CN110975009B - 静电纺丝纤维支架材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种静电纺丝纤维支架材料的制备方法，采用可降解高分子材料电纺膜为基底材料，通过高速分散器将制备的电纺纤维打碎，然后通过生物交联剂交联、冻干，制备具有合适孔隙率的体内支架材料。本发明提供了一种扩展电纺纳米纤维材料应用的方法，实现三维孔径增大，可调节细胞粘附和促进表达的作用。

Description

静电纺丝纤维支架材料的制备方法
技术领域
本发明涉及医疗材料技术领域，主要涉及静电纺丝纤维支架材料的制备方法。
背景技术
理想的骨组织工程支架材料能够具有良好的生物相容性，能够促进组织再生，为细胞的生存提供足够的三维空间，能够有效传递营养物质；可降解，能够有效被人体吸收并不会产生炎症反应。此外，还应该能够利于细胞的贴附和增值，诱导骨再生。常用的支架材料为高分材料，分为天然类和合成类。天然类为能够在自然界中找到的天然生物质料，如胶原蛋白。胶原蛋白因为其具良好的生物相容性现已被广泛应用为支架材料和药物运送载体。但是天然高分子材料在生物相容性及可降解性良好的同时，也存在机械性能较差，以及生物体免疫排异反应等问题。而且来源较少，使用成本较高。与其相反，人工合成的高分子材料能够弥补天然高分子的弱点，但是则在生物相容性等方面差于天然高分子材料。
适宜的三维成骨孔隙率也是促进成骨再生细胞再生繁殖，更加有效地发挥成骨材料在促进骨生长方面的必要条件之一。三维多孔结构在骨支架材料得以应用，源于骨组织的原始结构。材料力学上的孔隙率是指材料体积中孔隙体积所占的比例。有关研究表明骨支架的三维多孔结构与成骨材料的力学性能和生物可降解性具有密不可分的联系。成骨材料的三维孔径大小、孔隙率关系到再生细胞的生长空间、细胞间营养物质的有效传递和连通。其不仅涉及到其力学及生物学性能，关系到后期再生细胞的增殖、粘附，从而促成骨组织的形成有着重要作用。该三维多孔结构能够影响成骨生长因子效能的发挥。在孔径大小和材料空隙率方面，对于成骨修复的作用，两者呈比例变化。相关实验表明，在可降解性能方面，小孔径表现出更为明显的可降解性，而与之相反大孔径的成骨材料所生的新生骨组织则更多。鉴于此，有必要通过一系列重组交联的方法重组改性传统纳米基底仿生膜，制备具有合适孔隙的生物支架材料。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种静电纺丝纤维支架材料及其制备方法，该材料解决了现有的材料孔径小、降解性能差的问题。
技术方案：聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)具有良好的支架性能和生物活性，以及可降解性。PLGA降解后产酸，体内降解速度较快，而PCL降解速度较慢；将此两种材料混纺，通过一系列改性，不仅能够增大三维孔径，增强骨支架的力学性能，而且能够促进材料植入后的降解速度。
将PLGA、PCL复合起来，在性能上形成各自的优势互补。在复合的过程中也能够在其中添加生物生长因子，包载抗菌药物，以增强改生物膜材料的促骨组织再生能力以及抗菌抗感染能力。通过仿生天然细胞外基质或者改性修饰，不断调整薄膜的孔隙大小，增强薄膜与细胞的亲和交互力。这些都有利于骨再生区域的骨细胞的再黏附、再分化和细胞增殖以及受损部位的再恢复。
但是，PLGA/PCL复合电纺膜在组织修复应用中同时存在着较弱的骨引导性能和较低的细胞响应等缺陷，使得电纺膜的应用受到了一部分的限制。除了PLGA和PCL以外，生物相容性较好聚合物还有壳聚糖、明胶等。
明胶是从动物的副产物如骨、皮肤和结缔组织中提取出来的一类蛋白质，具有优异的生物降解性、细胞相容性、无免疫原性。在本发明的交联重组的过程中使用此两种交联剂作为辅助交联剂。一方面能够起到辅助交联的作用，另一方面在于能够降低交联剂PEI的化学毒性。
鉴于以上前提，本发明是通过使用聚乙烯亚胺(PEI)作为交联剂，明胶和多巴胺作为辅助交联剂，重组传统电纺膜基底PLGA-PCL膜制备较大孔径成骨仿生膜的制备方法。
本发明的静电纺丝纤维支架材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制质量百分数为1-10％的可生物降解医用高分子电纺溶液，并将所述电纺溶液采用静电纺丝的方式制成具有三维结构的纳米纤维薄膜。质量百分数优选2-7％。
(2)将步骤(1)中得到的纳米纤维薄膜加入缓冲液中打碎。
(3)配制质量百分数为0.3-2％的聚乙烯亚胺(PEI)-多巴胺溶液作为重组交联剂，并配制辅助交联剂明胶水溶液；其中，质量百分数优选0.5％。
(4)向步骤(2)中打碎的纳米纤维薄膜中依次加入步骤(3)中配制的辅助交联剂明胶水溶液和重组交联剂，并混匀，得到重组改性的膜溶液；
(5)将步骤(4)中得到的重组改性的膜溶液置于孔板中，并吸除多余溶液；
(6)将孔板置于-80-70℃的条件中冷冻，然后干燥成型，得到所述静电纺丝纤维支架材料。其中，温度优选-80℃。
步骤(1)中，所述可生物降解医用高分子为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)。
电纺溶液中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)的质量比为1:0.5-2。优选1:1。
步骤(1)中，静电纺丝的条件为：电压5-30kV、接收距离5-30cm、进样速度0.5-5mL/h。
步骤(1)中，可生物降解医用高分子电纺溶液的溶剂为六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、二甲基甲酰胺的任意一种或几种组合。
步骤(2)中，所述缓冲液为Tris-HCl溶液，其pH值为5-11。
步骤(2)中，采用高速分散器将纳米纤维薄膜在缓冲液中打碎。
步骤(3)中，所述聚乙烯亚胺-多巴胺溶液中的聚乙烯亚胺质量浓度为0.3-2％，多巴胺的质量浓度为0.1-5％，其溶剂为pH值5-11的Tris-HCl溶液。优选的，聚乙烯亚胺浓度为0.5％，多巴胺的浓度为2％。
步骤(3)中，所述辅助交联剂明胶溶液中明胶的浓度为0.1-1％。优选2％。
一种由上述的制备方法制得的静电纺丝纤维支架材料，该材料为使用重组交联剂交联改性传统三维纳米纤维成骨仿生膜，以扩大其成膜孔隙，制备出适合成骨细胞生长的高孔隙率成骨仿生材料。
有益效果：本发明通过PEI-多巴胺交联剂重组交联打碎的静电仿生膜材料，在原有三维成膜材料的基础上，增大了原有三维膜的支架空间，拓宽了成骨细胞再生长的空间范围；在满足传统促骨再生长仿生膜的相关性能上，进一步提升了仿生膜容纳细胞的潜力。
附图说明
图1是本发明的实施例3中得到的产品扫描电镜图。
具体实施方式
由于在实际实验操作的过程中，在交联顺序和交联剂的使用浓度等量方面存在相应的技术问题，下面将具体结合此两方面的问题对本发明进行详细的描述。
基底膜材料均采用静电纺丝技术获得的多孔结构材料。
实施例1
步骤一、基底膜的制备及搅拌打碎：
S1、配制质量百分数为2％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物电纺三氯甲烷溶液，并将所述电纺溶液采用静电纺丝的方式制成具有三维结构的纳米纤维薄膜(也称电纺纤维膜)，静电纺丝的条件为：电压5kV、接收距离6cm、进样速度0.5mL/h；
S2、初步实验：剪刀剪碎4g聚乳酸-羟基乙酸共聚物电纺纤维膜，按照方案设计加入此离心管中，并加入Tris-HCl溶液；
S3、在此离心管中高速搅拌机搅拌(控制搅拌速度为1200r/h，搅拌2分钟)，搅拌打碎至完全成浆。
步骤二、交联溶液的配制：
S1、配制重量比为1.8％的PEI-多巴胺溶液(多巴胺重量比为0.3％)作为交重组交联剂。量取10ml Tris-HCl(pH＝8.5％)于表面皿中；分别加入0.02g多巴胺于表面皿中，完全溶解。
S2、加入0.18g PEI于有多巴胺的表面皿中，完全溶解。
S3、搅拌均匀，倒入50ml的离心管中。
步骤三、在步骤一中已打好的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)纤维膜中加入步骤二所配制好的交联剂溶液并混匀。
步骤四、将步骤三的成膜混合匀浆置于24孔板中，-80℃冰冻，然后放入-60℃冷冻干燥机中冷冻干燥。
本实施例获得的冷冻干燥产品具有多孔结构和良好的力学性能，杨氏模量约为49kPa。
实施例2
关于PEI浓度
分别以不同浓度的PEI-多巴胺溶液交联电纺纤维膜
步骤一、基底膜的制备及搅拌打碎：
S1、配制质量百分数为3％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物电纺二甲基甲酰胺溶液，并将所述电纺溶液采用静电纺丝的方式制成具有三维结构的纳米纤维薄膜(也称电纺纤维膜)，静电纺丝的条件为：电压13kV、接收距离12cm、进样速度2mL/h；
S2、初步实验：剪刀剪碎3-5g电纺纤维膜，按照方案设计加入离心管中，并加入Tris-HCl溶液。
S3、在离心管中高速搅拌机搅拌(控制搅拌速度为1000r/h，搅拌4分钟)，搅拌打碎至完全成浆。
步骤二、交联溶液的配制：
S1、配制重量比为0.5％和1％的PEI-多巴胺溶液(多巴胺重量比为0.2％)作为交重组交联剂。
分别量取10ml Tris-Hcl(pH＝6.8％)于2个表面皿中；分别加入0.02g多巴胺2份于表面皿中，完全溶解。
S2、分别加入0.05g、0.1g PEI于此2份加有多巴胺的表面皿中，完全溶解。
S3、搅拌均匀，分别倒入2个50ml的离心管中。
步骤三、在步骤一中已打好的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(CL)纤维膜中取两份分别加入步骤二所配制好的两份交联剂溶液并混匀。
步骤四、将步骤三的成膜混合匀浆置于24孔板中，-80℃冰冻，然后放入-60℃冷冻干燥机中冷冻干燥。
本实施例表明：不同PEI浓度均能获得多孔的薄膜材料。
实施例3
关于PEI交联顺序
步骤一、配制质量百分数为5％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)电纺三氟乙醇溶液，并将所述电纺溶液采用静电纺丝的方式制成具有三维结构的纳米纤维薄膜(也称电纺纤维膜)，静电纺丝的条件为：电压19kV、接收距离20cm、进样速度3.5mL/h；
在Tris-Hcl(pH＝8.5％)溶液中打碎聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)膜3-5g(控制搅拌速度为1200r/h)，搅拌2分钟，直至打碎成浆。
步骤二、配制0.5％PEI-多巴胺(DA)交联溶液：
S1、分别量取10mlTris-Hcl于2个表面皿中，分别加入0.02g多巴胺2份于表面皿中，完全溶解。
S2、称取PEI 0.05g于此表面皿中，完全溶解。
步骤三、在步骤一中已打好的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)纤维膜中加入步骤二所配制好的交联剂溶液加入配制好的0.5％PEI-DA溶液混匀。
步骤四、将步骤三的成膜混合匀浆置于24孔板中，-80℃冷冻。
步骤五、冷冻干燥。
本实施例的产品具有100um的孔径，并且通道相互交叉，如图1所示。
实施例4
改性重组力学性能的优化
基于前述明胶的辅助交联作用，在PEI-多巴胺作交联剂的基础上加入明胶溶液，辅助增强改性膜的成膜效果及力学性能。
具体实验步骤如下：
步骤一、配制质量百分数为7％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)电纺六氟异丙醇溶液，并将所述电纺溶液采用静电纺丝的方式制成具有三维结构的纳米纤维薄膜(也称电纺纤维膜)，静电纺丝的条件为：电压30kV、接收距离29cm、进样速度5mL/h；将通过静电纺丝获得的薄膜在水溶液中浸泡过夜。
步骤二、在Tris-Hcl(pH＝9.5％)溶液中打碎3-5g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)膜，至成匀浆。
步骤三、配制0.1％明胶溶液：称取0.01g明胶于10ml去离子水中，搅拌24小时至充分溶解。
步骤四、配制0.5％PEI-多巴胺交联溶液：在上面装有10ml水表面皿中加入已称量好的多巴胺20mg，在上面装有10ml水的表面皿中称量PEI 50mg。
步骤五、加入明胶溶液：在步骤四中装有配好的PEI-多巴胺交联溶液的表面皿中加入1％的明胶溶液3ml。
步骤六、再将以上3种交联剂已经充分混合的交联溶液加入步骤三中聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)膜匀浆中，充分混匀。
步骤七、装入孔板中，冷冻干燥前先将盛有交联后改性膜匀浆的24孔板进行-80℃冷冻为结晶状。冷冻干燥。
本实施例获得的产品，在保证孔径的条件下，杨氏模量从51.2kPa(无明胶)增加到60.3kPa(加入明胶)。

Claims (7)

1.一种静电纺丝纤维支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制质量百分数为1-10%的可生物降解医用高分子电纺溶液，并将所述电纺溶液采用静电纺丝的方式制成具有三维结构的纳米纤维薄膜；
（2）将步骤（1）中得到的纳米纤维薄膜加入缓冲液中打碎；
（3）配制聚乙烯亚胺-多巴胺溶液作为重组交联剂，并配制明胶水溶液作为辅助交联剂，所述聚乙烯亚胺-多巴胺溶液中的聚乙烯亚胺质量浓度为0.3-2%，多巴胺的质量浓度为0.2-5%；
（4）向步骤（2）中打碎的纳米纤维薄膜中依次加入步骤（3）中配制的辅助交联剂明胶水溶液和重组交联剂，并混匀，得到重组改性的膜溶液；
（5）将步骤（4）中得到的重组改性的膜溶液置于孔板中，将孔板置于-80 - -60℃的条件中冷冻，然后干燥成型，得到所述静电纺丝纤维支架材料。
其中，步骤（1）中，所述可生物降解医用高分子为聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯；所述电纺溶液中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯的质量比为1:0.5-2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，静电纺丝的条件为：电压5-30kV、接收距离5-30cm、进样速度0.5-5ml/h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述缓冲液为Tris-HCl溶液，其pH值为5-11。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，采用高速分散器将纳米纤维薄膜在缓冲液中打碎。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述聚乙烯亚胺-多巴胺溶液的溶剂为pH值5-11的Tris-Hcl溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述辅助交联剂明胶水溶液中明胶的质量浓度为0.1-1%。
7.一种由1-6任一权利要求的制备方法制得的静电纺丝纤维支架材料。
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