ES2339497T3

ES2339497T3 - Procedimiento y aparato de extraccion de la glandula de un artropodo.

Info

Publication number: ES2339497T3
Application number: ES07703571T
Authority: ES
Inventors: Michael Rheinnecker; Stefan Kohlhaas; Rolf Zimmat
Original assignee: SPINTEC ENGINEERING GmbH
Current assignee: SPINTEC ENGINEERING GmbH
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2027-03-01
Also published as: GB0604089D0; ATE458001T1; DE602007004830D1; JP2009528314A; CA2642793C; GB2435646A; EP1989223A2; PL1989223T3; WO2007098951A2; WO2007098951A3; US8287913B2; PT1989223E; DK1989223T3; EP1989223B1; JP5269616B2; CA2642793A1; US20080293918A1

Abstract

Un aparato para la extracción de material de una glándula (70) de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante que comprende: - un dispositivo de sujeción (50) en el que se sujeta al menos parte de la glándula (70); - una disolución tampón (30) que baña la glándula (70) al menos parcialmente; en el que, durante el uso, se libera el material desde la glándula (70) a la disolución tampón (30); y - un área (20) de recogida de material en la que se recoge el material.

Description

Procedimiento y aparato de extracción de la glándula de un artrópodo.

Campo de la invención

La solicitud se refiere a un aparato y un procedimiento para la extracción de material de glándulas de artrópodos de tipo salvaje o recombinante.

Técnica anterior

Inoue y col., en Eur. J. Biochem. 2004, 271, 356-366, describieron la secreción de fibroína de seda natural de Bombyx mori de la glándula posterior de la seda como una unidad elemental (que se denomina de aquí en adelante UE) de 2,3 MDa que está constituida por seis conjuntos de un heterodímero de fibroina de cadena pesada-cadena ligera unidas por disulfuro y una molécula de P25.

Actualmente, se elaboran disoluciones de proteínas de seda (tales como fibroína y otras proteínas) como disoluciones de seda regenerada sacada de capullos o filamentos de seda que se disuelven en agentes de solubilización (por ejemplo bromuro de litio) y se vuelven a plegar por medio de diálisis y otras técnicas de intercambio de tampón (véase, por ejemplo, Altmann y col., Biomaterials 2003, 24, 401-416). Dados los retos conocidos para producir proteínas activas por medio de replegado después de solubilización en agentes de plegado de proteína/caotrópicos (Vallejo and Rinas, Microbial Cell Factories, 2004, doi: 10.1186/1475-2859-3-11), una persona experta en la técnica apreciará las dificultades técnicas que se han resuelto para producir UE de fibroína nativa correctamente plegadas a partir de disoluciones de seda regenerada. Por lo tanto, no es sorprendente que no haya informe alguno hasta la fecha sobre la producción con éxito de fibroína de alto peso molecular ensamblada en conformación de UE a partir de disoluciones de seda regenerada.

Las diferencias entre las proteínas de seda nativas según se producen y se almacenan en las glándulas de artrópodos, tales como gusanos de seda (es decir en su conformación de UE de alto peso molecular) y las proteínas de seda regeneradas (anteriormente descritas) son tales que las proteínas de seda regeneradas producidas por las técnicas actuales tienen a lo sumo características "como-nativas", es decir, las proteínas de seda regeneradas tienen algunas propiedades en común, pero no se puede decir que sean idénticas ni sustancialmente idénticas a las proteínas de seda nativas. Las proteínas de seda nativas se definen como aquellas proteínas que se encuentran en su conformación de proteína nativa, es decir, con las estructuras de plegado primario, secundario, terciario y cuaternario similares o esencialmente similares a la proteína de tipo salvaje (Thomas E. Creighton, Proteins, Segunda Edición, 1993, 232-236, ISBN 0-7167-2317-4). Las diferencias de proteínas de seda regeneradas en su patrón de plegado de proteína, especialmente respecto a su plegado terciario y cuaternario en comparación con proteínas de seda nativas aparentemente no tienen impacto negativo en su uso como ingredientes cosméticos o farmacéuticos (según se describe, por ejemplo, por Tsubouchi y col., en la solicitud de patente internacional PCT/JP01/02250). Sin embargo, para aplicaciones más exigentes, tales como la producción de películas, revestimientos y objetos moldeados mecánicamente resistentes o el hilado biomimético de sedas (según se describe por Vollrath y Knight en la patente europea 1244828, transferida a Spintec Engineering GmbH), el plegado correcto y el autoensamblado de las proteínas de seda usadas para producción de dichos materiales desempeñan un papel en la determinación de la resistencia mecánica y características funcionales de los materiales formados. Debido a las diferencias entre las proteínas de seda regeneradas y las proteínas de seda nativas anteriormente destacadas, la calidad de las sedas regeneradas no ha sido suficiente para la producción de materiales de seda de alta calidad por medio de moldeo, revestimiento o hilado biomimético según se describe en la anteriormente mencionada patente europea 1244828.

La solicitud de patente europea Nº 1241178 (transferida al National Institute of Agrobiological Sciences and Kowa Co) enseña un procedimiento para la producción de fibroína de seda disolviendo capullos en una disolución acuosa alcalina o una disolución acuosa de urea. La disolución acuosa alcalina que se describe en los ejemplos de la solicitud de patente 1241178 es de carbonato de sodio o de tiocianato de litio a un pH de 7. Posteriormente, se añade acetona o alcohol a la disolución acuosa alcalina para precipitar la fibroína. Los resultados que se muestran en la solicitud de patente no indican que se produjeran proteínas de seda de alto peso molecular que exhibieran conformaciones de plegado de proteína nativa terciario y cuaternario.

La solicitud de patente 1241178 también reseña (párrafo 18) un procedimiento en el que se extrae la glándula de la seda del cuerpo de un gusano de seda a lo que sigue la extracción de la proteína del lumen de la glándula de la seda. Sin embargo, la descripción sugiere que el proceso no es adecuado para producción industrial porque la fibroína obtenida contiene impurezas tales como humor del gusano de seda y células de la glándula del gusano de seda.

Se ha descrito un procedimiento para la extracción de proteínas de seda nativas de glándulas de gusano de seda en la solicitud de patente internacional Nº PCT/EP02/12033 y la correspondiente patente de EE.UU. Nº 7.041.797 (Vollrath, transferida a Spintec Engineering GmbH). La patente 7.041.797 describe una aproximación en la que las glándulas de seda se retiran del cuerpo del gusano de seda a lo que sigue la retirada de una capa epitelial de las glándulas de seda. El procedimiento funciona bien para la extracción manual a partir de glándulas de seda individuales. Sin embargo, es tedioso y lleva mucho tiempo cuando se necesita extraer un gran número de glándulas de seda. Así pues, es impracticable como procedimiento de producción de las proteínas nativas a partir de glándulas de seda a escala industrial. El inventor de la patente 7.041.797 tampoco ha detallado un procedimiento ni un aparato que permita mezclado y agrupación eficientes y homogéneos de proteínas extraídas de las glándulas de seda ni tampoco la incorporación de aditivos en el contenido glandular extraído de seda.

De modo similar, la solicitud de patente japonesa JP-A-2268693 (Asahi) enseña un procedimiento para cultivar una glándula de seda obtenida de gusanos de seda (tal como la de Bombyx mori) y usar un medio de cultivo. El medio de cultivo se retira usando diálisis para obtener una disolución acuosa de la fibroína de seda. Sin embargo, los inventores de la solicitud de patente 2268693 no consideraron cómo se incorporan homogéneamente aditivos al contenido altamente viscoso de la glándula de seda.

Un procedimiento más rudimentario para obtener proteína de fibroína se describe en la solicitud de patente japonesa JP-A-3209399 (Terumo) en el que se cortan las cabezas de los gusanos de seda. A continuación se recolecta la proteína de fibroína presionando el abdomen del gusano de seda para extraer la proteína de fibroína. Se retira sericina de la mezcla de proteína resultante tratando la mezcla proteínica con un álcali débil, tal como Na_{2}CO_{3}. Los inventores de la solicitud de patente 3209399 no enseñaron cómo se incluyen aditivos en las mezclas proteínicas. Además, el procedimiento de la solicitud de patente 3209399 tiene la desventaja de que no se evita fácilmente la incorporación de impurezas del cuerpo del gusano de seda. Estas impurezas se tienen que retirar o puede que afecten a las propiedades de las fibras hiladas biomiméticamente de objetos hilados, revestidos o moldeados que se producen con dichas mezclas de proteínas.

La solicitud de patente japonesa JP-A-046525 (Best Kobo KK and Okamoto Resu KK) describe un procedimiento para la extracción de sericina. La sericina se extrae sumergiendo seda bruta en agua con electrolitos. La solicitud de patente 046525 no describe aparato ni procedimiento para la extracción de material de una glándula de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante.

Resumen de la invención

Por lo tanto, se necesita un procedimiento y un aparato para extraer material de una glándula de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante; el material puede ser una proteína, un péptido y combinaciones de proteínas y péptidos.

Se necesita adicionalmente incorporar aditivos a dicho material glandular del gusano de seda de tipo salvaje o recombinante.

Se necesita adicionalmente mezclar homogéneamente el material extraído de más de una glándula del gusano de seda de tipo salvaje o recombinante.

Estos y otros objetos se resuelven mediante un aparato para la extracción de material de una glándula de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante. El aparato comprende un dispositivo de sujeción en el que se sujeta al menos parte de la glándula. Una disolución tampón al menos parcialmente (pero no necesariamente por completo) baña la glándula de tal modo que el material se libera de la glándula a la disolución tampón y se recoge en un área de recogida en el fondo del aparato.

El aparato garantiza que material de dos o más glándulas de gusano de seda de tipo salvaje o recombinante se mezcla conjuntamente de modo sustancialmente homogéneo. Sumergir al menos parcialmente las glándulas de gusano de seda de tipo salvaje o recombinante en la disolución tampón significa que la presión osmótica, la disección enzimática o mecánica garantizan que el material se libera desde la glándula del gusano de seda a la disolución tampón.

El aparato incorpora además un soporte. El soporte puede ser un soporte poroso tal como una red porosa o una placa porosa. El soporte se coloca entre el dispositivo de sujeción y el área de recogida del material. El soporte poroso proporciona una solución técnica eficaz para disgregar el contenido proteínico altamente viscoso que fluye de las glándulas, lo que da como resultado que se recoge en el área de recogida un material uniformemente mezclado.

El soporte poroso también sirve como un medio técnico para controlar y cambiar las propiedades físicas del material recogido (es decir, los contenidos glandulares). Por ejemplo, cambiando la malla o tamaño de poro y/o ajustando la posición del soporte poroso con relación a la posición de la glándula en el dispositivo de sujeción y/o con relación a la posición del área de recogida del aparato, es posible controlar la exposición del material a la disolución tampón (y cualquier aditivo en la disolución tampón) en el aparato.

En una realización adicional, la exposición del material a la disolución tampón también puede controlarse usando un soporte no poroso de modo que la posición del soporte no poroso sea tal que el material se guíe hacia el área de recogida del aparato.

Se pueden incorporar aditivos a la disolución tampón. Se ha encontrado que la solubilización y sedimentación del material en la disolución tampón conduce a una distribución sustancialmente uniforme de aditivos dentro del material.

Estos y otros objetos también se resuelven mediante un procedimiento para la extracción de material de una glándula de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante. El procedimiento comprende: proporcionar la glándula que contiene el material al menos parcialmente, hacer una abertura en la glándula y colocar la glándula en un dispositivo de sujeción de tal modo que la glándula está al menos parcialmente sumergida en una disolución tampón. El material se libera entonces de la glándula.

En un aspecto adicional, el procedimiento según la presente invención permite la adición de un aditivo a la disolución tampón. Se ha encontrado que la solubilización y sedimentación del material en la disolución tampón conduce a una distribución sustancialmente uniforme de los aditivos dentro del material extraído.

También es posible hacer que pase el material a través de un soporte poroso (tal como una placa porosa o una red porosa). Según se ha discutido anteriormente, la provisión del soporte poroso disgrega el contenido proteínico altamente viscoso que fluye de las glándulas, lo que da como resultado que se recoge en el área de recogida un material uniformemente mezclado. Finalmente, el material se recoge en el fondo del aparato.

Según se discute más adelante, el material está constituido por biomateriales nativos o recombinantes que se pueden producir en glándulas de artrópodos tales como, por ejemplo, proteínas, péptidos o carbohidratos u otras moléculas biológicas adecuadas y/o una combinación de ellas. Los materiales se pueden usar para numerosos fines que incluyen, pero sin limitación, la fabricación de fibras o películas. Preferiblemente el material es fibroína nativa o recombinante o proteínas de fibroinfusión conocidas por los expertos en la técnica de las tecnologías de gusanos de seda recombinantes.

La extracción de material de la glándula de un gusano de seda de tipo nativo o recombinante en conformidad con la invención evita la necesidad de usar técnicas de replegado de proteínas que son necesarias cuando se hacen proteínas de seda a partir de una disolución de seda regenerada. En cambio, el aparato y el procedimiento que se presentan aquí, posibilitan la extracción a gran escala de materiales hechos y almacenados por el gusano de seda en sus glándulas. Evitando las técnicas de replegado de proteínas y usando condiciones suaves de purificación de proteínas, se puede retener toda o la mayor parte de la funcionalidad conferida por la síntesis natural del biomaterial en las glándulas del gusano de seda. Por ejemplo, en el caso del gusano de seda la invención descrita permite una recolección eficaz de fibroína nativa o fibroína recombinante sin destruir los complejos de proteína de fibroína multímera de alto peso molecular (plegado terciario y cuaternario, descrito por ejemplo en Inoue y col., en Eur. J. Biochem. 2004, 271, 356-366) evitando el uso de agentes desnaturalizantes que se usan ampliamente para elaborar sedas regeneradas (por ejemplo, véase Altmann y col., Biomaterials 2003, 24, 401-416).

Desde un punto de vista comercial, el aparato descrito posibilita una técnica benigna de recolección y la conservación de las características nativas de la fibroína en el contenido glandular extraído del gusano de seda. Además, el aparato establece las bases para la producción de nuevas películas, revestimientos, objetos moldeados o materiales hilados de seda que se basan en las propiedades potenciadas de las proteínas de seda nativas en comparación con las regeneradas.

Adicionalmente, la invención posibilita el mezclado del contenido glandular de gusano de seda de tipo salvaje con el tampón y/o el aditivo, proporcionando de este modo un medio para la producción de nuevas sedas con propiedades conferidas por la integración permanente o transitoria de aditivos.

Dado que el material es una disolución acuosa y no requiere ningún disolvente orgánico como agente de replegado para proteínas de seda (a diferencia de la técnica anterior discutida arriba), se cree que, por ejemplo, se puede usar como aditivo cualquier proteína o péptido lábil. Otros ejemplos de aditivos potenciales se enumeran más adelante.

La invención también posibilita la homogeneización del contenido glandular extraído mediante el paso a través de la red porosa, proporcionando de este modo mezclado homogéneo de los contenidos glandulares procedentes de más de un artrópodo.

En resumen, el aparato descrito posibilita que el operador elabore disoluciones de contenidos glandulares con propiedades de material ajustables tales como por ejemplo concentración de proteína o composición bioquímica controlando parámetros tales como composición del tampón, dimensiones de aberturas en el soporte poroso, distancia de flujo de materiales dentro del aparato y tamaño del área de recogida.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra el aparato con un soporte poroso según la invención actual.

La Fig. 2 muestra el uso del aparato para recolectar contenidos glandulares de artrópodo.

La Fig. 3 muestra el procedimiento de uso del aparato.

La Fig. 4 muestra la curva de estiramiento a la tensión del Ejemplo 4.

La Fig. 5 muestra el aparato con un soporte sólido según la invención actual.

Descripción detallada de la invención

Las Figs. 1 y 5 muestran un aparato 5 que se usa en la invención. El aparato 5 comprende un recipiente 10, un área 20 de recogida de material, y una disolución tampón 30 con uno o más aditivos 40. Uno o más aditivos 40 se pueden añadir en cualquier etapa durante el uso del aparato o como alternativa puede que no se necesite añadir aditivos 40. El aparato 5 contiene adicionalmente un dispositivo 50 de sujeción de glándula ajustable en altura (indicado por la flecha) que sujeta una o más glándulas de artrópodos retiradas de artrópodos en posición que facilita la liberación (elución) de contenidos de una o más glándulas. Opcionalmente, el aparato 5 contiene un soporte 60 ajustable en altura y posición (indicado por las flechas) con un tamaño de poro de 0,1-10 mm. El soporte 60 puede ser una red porosa o una placa porosa según se indica en Fig. 1 o una placa sólida según se indica por la Fig. 5. La disolución tampón 30 puede contener por ejemplo Tris 100 mM o cualquier otro tipo de tampón conocido para un experto en la técnica de purificación de proteínas. Los aditivos 40 pueden ser, sólo a manera de ejemplo, sustancias terapéuticamente activas o agentes colorantes.

El procedimiento de uso del aparato 5 para extraer contenido glandular de artrópodo se muestra en visión de conjunto en la Fig. 2 y se describe en la Fig. 3.

La Fig. 2 muestra la colocación de las glándulas de artrópodos 70 en el dispositivo de sujeción 50 (indicado por la flecha). Para facilitar la recolección industrial de las glándulas del gusano de seda, el dispositivo de sujeción 50 se carga automáticamente con las glándulas de artrópodos 70 mediante uno o varios dispositivos robóticos 80 de captación y transferencia. Sin embargo, para producción a pequeña escala, el aparato 5 también se puede cargar manualmente. El contenido glandular 90 se libera de la glándula del artrópodo 70 y se recoge en el área 20 de recogida de material. Opcionalmente, el soporte poroso 60 se puede usar para mejorar el mezclado homogéneo y aumentar la exposición del contenido glandular 90 con el tampón 30 con o sin aditivos 40. Cambiando las posiciones del dispositivo de sujeción 50 y el soporte poroso 60 relativas entre ellos y con relación al área 20 de recogida de material, el aparato 5 posibilita el ajuste a la concentración requerida del contenido glandular recogido 90. Como alternativa, se puede usar soporte 60 no poroso en absoluto conservando de este modo todo lo posible la concentración de contenido glandular eluído
90.

La Fig. 3 resume el procedimiento de uso para el aparato 10.

En una primera etapa 200 se llena el recipiente 10 con el tampón 30 con o sin uno o más aditivos 40.

En la siguiente etapa 210, se extraen las glándulas 70 de los cuerpos de los artrópodos, tales como gusanos de seda. Esto se puede hacer, por ejemplo, usando el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. Nº 7.041.797. Se hace al menos una abertura en la pared celular epitelial de las glándulas del gusano de seda de modo que se pueda liberar el contenido (proteínas de seda) del interior de las glándulas del gusano de seda. La abertura en la pared celular epitelial se puede hacer por ultrasonidos, corte mecánico o disección enzimática. La abertura en la pared celular epitelial también se puede llevar a cabo cortando la glándula del gusano de seda aproximadamente por la mitad. La posición exacta de la abertura en la pared celular epitelial y el procedimiento de hacer la abertura no son cruciales para poner en práctica la invención. Las glándulas abiertas 70 se colocan a continuación bien manualmente o bien con uno de los dispositivos robóticos 80 de captación y transferencia en el dispositivo de sujeción 50 del aparato 10. Dispositivos de captación-y-colocación de este tipo son conocidos por los expertos en la técnica de automatización en laboratorio y permiten la manipulación física de la glándula 70 de gusano de seda por medio de un dispositivo funcional de captación-y-colocación, tal como un agarrador. Las glándulas 70 de gusano de seda transferidas se ponen en orden sobre el dispositivo de sujeción 50 de manera que se posibilite la liberación eficaz del contenido 90 de la glándula 70 de gusano de seda y un empaquetado eficaz de las glándulas 70 de gusano de seda dentro del recipiente 10. En una realización de la invención, se usan las glándulas 70 de gusano de seda procedentes de aproximadamente 7 gusanos de seda, aunque esto no es limitativo de la invención y puede ser fácilmente llevado a mayor escala de varios órdenes de magnitud aumentando las dimensiones del dispositivo de sujeción 50 y del aparato 5.

En la siguiente etapa 220, el contenido glandular 90 fluye de la glándula 70 del gusano de seda al recipiente 10 y se recoge en el área 20 de recogida de material. Opcionalmente, el contenido glandular 90 se hace pasar a través del soporte poroso 60. Según se ha discutido anteriormente, el uso del soporte poroso 60 tiene la ventaja de mejorar la homogeneidad y de ajustar las propiedades de material del contenido glandular 90 variando las posiciones del soporte poroso 60 y/o del dispositivo de sujeción 50 en el recipiente 10. Además, el soporte poroso 60 también se puede usar para reducir impurezas del contenido glandular liberado 90.

En la etapa 230, el contenido glandular 90 que se recoge en el área 20 de recogida de material se puede almacenar en el recipiente 10 o se puede transferir a recipientes de almacenamiento adecuados adicionales (que no se muestran). El contenido glandular recogido 90 tiene un contenido en proteína de alrededor de 1-30% y se puede cargar con aditivos útiles durante o después del proceso de extracción para conferir una nueva funcionalidad al material glandular recogido. Además, el contenido glandular recogido 90 es sustancialmente homogéneo, especialmente si el contenido glandular recogido 90 se hizo pasar a través del soporte poroso 60. Esta distribución homogénea del contenido glandular recogido 90 y la capacidad de conferir uno o más aditivos a los contenidos glandulares 90 contrasta con los procedimientos de la técnica anterior en los que no ha sido posible mezclar las proteínas de seda de material nativo de más de una glándula 70 de gusano de seda ni incorporar uno o más aditivos 40 al material.

Se debería destacar que este procedimiento es igualmente aplicable a proteínas nativas y péptidos (que no se limitan solamente a proteínas de seda) y sus proteínas recombinantes análogas y de fusión extraídas en forma nativa de las glándulas de artrópodos de tipo salvaje o recombinante tales como gusanos de seda de la familia Bombycidae, que incluyen, pero sin limitación, gusanos de seda de los géneros Antherea, Attacus, Samia, Bombyx y Telea. Los materiales extraídos incluyen, pero sin limitación, péptidos y proteínas del tipo de polímeros de bloques ABAB, tales como fibroína.

Se pueden añadir uno o más aditivos 40 al contenido glandular extraído 90, bien a la disolución tampón 30 en cualquier etapa de la extracción o bien directamente al contenido glandular 90 cosechado en el área 20 de recogida de material.

La gama de aditivos que se puede añadir es extensa y se contempla que se pueden usar los siguientes aditivos:

\bullet: Aditivos orgánicos:

\circ: Pequeñas entidades moleculares

\circ: Péptidos

\circ: Proteínas

\circ: Carbohidratos

\circ: Lípidos

\circ: Ácidos nucleicos tales como ADN, ARN, APNs y otros análogos de ácidos nucleicos con más de 100 bases de longitud así como fragmentos de los mismos con menos de 100 bases de longitud tales como por ejemplo siARNs

\bullet: Aditivos inorgánicos:

\circ: Aditivos o precursores que mejoran o aportan propiedades mecánicas, ópticas, eléctricas o catalíticas

\circ: Minerales tales como fosfatos, carbonatos, sulfatos, fluoruros, silicatos, etc, y mineraloides tales como arcillas, talco, y sílices,

\circ: Sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, metales de transición, metales de post-transición y aleaciones de los mismos,

\circ: Complejos metálicos tales como iones metálicos coordinados con EDTA y otros agentes quelantes,

\circ: Aislantes tales como óxidos metálicos como Fe_{2}O_{3}, Al_{2}O_{3}, TiO_{2},

\circ: Cualquier semiconductor III-V o I I-VI y conductores, tales como metales y aleaciones de los mismos,

\circ: Aditivos basados en carbono, tales como fullerenos, nanotubos de carbono, fibras o varillas, grafito

\bullet: Aditivos hidrófobos, hidrófilos o anfóteros para ajustar la solubilidad del contenido glandular en la disolución tampón y proporcionar de este modo diferentes concentraciones de material extraído.

\bullet: Nanopartículas

\bullet: Compuestos fisiológicamente activos tales como

\circ: Anticuerpos y sus análogos

\circ: Antisépticos, agentes antivirales y antibióticos

\circ: Anticoagulantes y antitrombóticos

\circ: Agentes vasodilatadores

\circ: Agentes quimioterápicos

\circ: Agentes antiproliferantes

\circ: Agentes antirrechazo o inmunosupresores

\circ: Agentes que actúan sobre el sistema nervioso central y periférico

\circ: Analgésicos

\circ: Agentes antiinflamatorios

\circ: Hormonas tales como esteroides

\circ: Agentes de mineralización para regeneración dental tales como fluorapatito para regeneración dental

\circ: Agentes de mineralización para regeneración ósea tales como hidroxilapatito, fosfato de tricalcio, partículas derivadas de animales marinos tales como corales y quitosanos y similares

\circ: factores de crecimiento tales como

\bullet: Proteínas óseas morfogénicas BMPs

\bullet: Proteínas óseas de tipo morfogénico GFDs

\bullet: Factores de crecimiento epidérmico EGFs

\bullet: Factores de crecimiento de fibroblastos FGFs

\bullet: Factores de crecimiento transformantes TGFs

\bullet: Factores de crecimiento vascular endotelial VEGFs

\bullet: Factores de crecimiento de tipo insulina IGFs

\bullet: Factores de reparación y regeneración nerviosa NGFs

\bullet: factores de crecimiento derivados de plaquetas PDGFs

\circ: Proteínas que funcionan como agentes de unión de células o proteínas tales como colágeno IV, polisilina, fibronectina, caderinas, ICAM, V-CAM, N-CAM, selectinas, neurofascinas, oxinina, neuroglina, fascilina

\circ: Motivos de unión de células tales como por ejemplo los sitios de reconocimiento RGD o RADAR para moléculas de adhesión celular

\circ: Agentes de cicatrización de heridas

\circ: Agentes para prevenir la formación de cicatrices tales como por ejemplo Cordaneurin

\circ: Otras proteínas, polisacáridos, glicoproteínas o lipoproteínas terapéuticamente activas derivadas naturalmente o elaboradas mediante ingeniería genética

\circ: Células terapéuticamente activas tales como por ejemplo células troncales o células autólogas derivadas de un sitio del paciente

\bullet: Agentes para detectar cambios de pH tales como rojo neutro

\bullet: Agentes que fomentan la formación de hoja-\beta de las proteínas extraídas de glándulas

\bullet: Agentes tales como polímeros biodegradables que se degradan a velocidades controlables de modo que posibilitan una biodegradabilidad controlada

\bullet: Agentes tales como inhibidores de proteasa que inhiben la actividad de proteasa por ejemplo en el sitio de implantación en el paciente, de modo que posibilitan una biodegradabilidad controlada

\bullet: Disolventes apróticos que mejoran la formación de enlaces de hidrógeno en proteínas de seda tales como éter, éster, anhídrido de ácido, cetonas (por ejemplo acetona), aminas terciarias, dimetilformamida, piridina, furano, tiofeno, tricloroetano, cloroformo y otros hidrocarburos halogenados, dimetilsulfóxido, dimetilsulfato, dimetilcarbonato, imsol, anisol, nitrometano

\bullet: Agentes que mejoran la liberación de compuestos fisiológicamente activos

\bullet: Colorantes derivados naturalmente o sintetizados químicamente

\bullet: Agentes de coloreado derivados naturalmente o elaborados mediante ingeniería genética tales como proteína verde fluorescente

\bullet: Proteínas que llevan carga estructural derivadas naturalmente o elaboradas mediante ingeniería genética tales como actina, seda, colágeno o fibronectina y análogos o derivados de las mismas

\bullet: Materiales eléctricamente conductores o semiconductores

\bullet: Polielectrolitos con cargas positivas o negativas unidas

\bullet: Líquidos iónicos

\bullet: Materiales que confieren magnetismo temporal o permanente

\bullet: Polímeros solubles en agua tales como ácido poliláctico o policaprolactona

\bullet: Fibras de vidrio.

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Se debería entender que la lista de aditivos no pretende limitar la invención sino que es ejemplar de los aditivos que se pueden añadir al material glandular extraído 90.

El material glandular extraído 90 se puede usar para formar objetos, por ejemplo mediante revestimiento, moldeo o hilado según se define en el aparato de hilado que se describe en la patente europea 1244828. Si se añaden uno o más aditivos 40 al material glandular extraído 90, los objetos formados pueden tener propiedades adicionales. Por ejemplo, se podría añadir uno de los aditivos 40 al material glandular extraído 90 para estimular el crecimiento de tejido de modo que los objetos formados se puedan usar como implante médico.

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Ejemplos Ejemplo 1

Se extrajeron las glándulas de gusanos de seda de cuatro gusanos de seda Bombyx mori al final de su quinta fase retirando la glándula del gusano de seda del cuerpo de los gusanos de seda Bombyx mori según se describe anteriormente con referencia a la patente de EE.UU. 7.041.797. Cada una de las glándulas de cortó por la mitad. Las mitades posteriores de las glándulas de gusano de seda se colocaron con un par de pinzas sobre una red situada dentro de una placa Petri que se había llenado con tampón de acetato de amonio 100 mM que tenía pH 7,8. En total se transfirieron ocho glándulas 70 posteriores de gusano de seda. Las ocho glándulas 70 de gusano de seda fueron incubadas durante 60 minutos para choque osmótico y liberación del contenido glandular 70 de gusano de seda. Las glándulas 70 de gusano de seda vaciadas se retiraron a continuación de la superficie de la red usando un par de pinzas. Cuando era necesario, se hacía un movimiento de deslizamiento sobre el borde de la placa Petri para extraer cualquier material de glándula de gusano de seda restante que quedara dentro de la glándula de gusano de seda. El material glandular de gusano de seda extraído se dejó durante toda la noche sobre la superficie de la red, lo que dejó que pasara el material glandular de gusano de seda a través de la red y sedimentara en el fondo de la placa Petri. Se retiró a continuación la red de la placa Petri y se cosechó la proteína de gusano de seda de la glándula de gusano de seda usando una jeringa desechable de 5 ml.

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Ejemplo 2

Se extrajeron ocho mitades posteriores de las glándulas 70 de gusano de seda según se describe en el Ejemplo 1. Los análisis microscópicos del material restante pegado a la red y del contenido glandular filtrado que se recogieron en la placa Petri demostraron la separación eficaz del desecho celular epitelial y materiales glandulares descompuestos, desnaturalizados del contenido glandular homogéneo en la placa Petri.

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Ejemplo 3

Para demostrar la posibilidad de incorporar aditivos 40 ("dopantes") en el contenido glandular durante la extracción, se extrajeron ocho mitades posteriores de las glándulas de gusano de seda en una disolución tampón de acetato de amonio 100 mM y rojo neutro 1,75 mM. La disolución tampón tenía pH 7,8. Esto se comparó con cuatro mitades posteriores extraídas en disolución tampón de acetato de amonio 100 mM a pH 7,8 sin aditivos adicionales. La adición del aditivo 40 a la disolución tampón no condujo a agregación ni desestabilización del material glandular extraído de la glándula del gusano de seda.

El material glandular que contenía el aditivo de rojo neutro se transfirió a una placa Petri y se secó a 50ºC para formar una película. Se encontró que la película era estable y retenía el color rojo cuando se incubaba en agua a temperatura ambiente durante tres meses, demostrando con ello la integración estable del aditivo en el material glandular.

El material glandular de gusano de seda que se había extraído según se describe anteriormente conteniendo aditivo rojo neutro 0,18 mM se probó adicionalmente con éxito respecto a facilidad de hilado usando el dispositivo de hilado biomimético de la patente europea 1244828 y produciendo fibras de seda uniformemente coloreadas de rojo con diámetro de aproximadamente 5 \mum que se recogieron sobre dos bobinas de aluminio.

Ejemplo 4 Propiedades físicas de los materiales glandulares extraídos

Se elaboró por colada una película usando el material glandular extraído en conformidad con el procedimiento del Ejemplo 1. La película de colada fue insoluble en agua y no cambió sus propiedades tras el mojado y el secado repetidos en agua o disolventes orgánicos. Se realizó la prueba de tracción en H_{2}Od sobre medidor de tracción ZwickRoell TC-FR2.5TN a 10 mm/min con geometrías de muestra de 40 mm x 2,5 mm x 0,06 mm. La película exhibió resistencia a la rotura en H_{2}Od de aproximadamente 20 MPa a aproximadamente 100% de la elongación de rotura (véase la figura 4 sobre los datos).

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Ejemplo 5 Reproducibilidad de la extracción del contenido glandular

Se extrajeron las glándulas de gusano de seda de siete gusanos de seda Bombyx mori al final de su quinta fase retirando la glándula del gusano de seda del cuerpo de los gusanos de seda según se describe por ejemplo en la solicitud de patente de EE.UU. número 7.041.797. Cada una de las glándulas de cortó por la mitad. Las mitades posteriores de las glándulas de gusano de seda (en total 14) se colocaron con un par de pinzas sobre una varilla situada en la parte de arriba de un cilindro con 30 mm aproximadamente de diámetro y 100 mm aproximadamente de longitud que contenía tampón de acetato de amonio 100 mM, pH 7,8, y una red con tamaño de malla de 1 mm, situada aproximadamente a 46 mm de distancia del fondo cerrado del cilindro. Se liberó el contenido total de las glándulas de seda abiertas, se hizo que pasara a través de la red y se recogió en el fondo del dispositivo. La concentración de proteína del contenido glandular total recogido se determinó a continuación mediante secado en estufa a 60ºC. El procedimiento de extracción se realizó cinco veces, produciendo concentraciones de proteína de glándula de 7,0%, 7,2%, 7,2%, 6,7% y 7,1% y una concentración de proteína en conjunto de 7 \pm 0,22%.

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Ejemplo 6 Ajuste de la concentración de proteína del contenido glandular extraído

Se realizaron con el aparato cuatro extracciones de glándula de seda con 14 mitades posteriores cada una. Para cada una de las extracciones de glándula de seda, se prepararon 14 mitades posteriores según se describe en el Ejemplo 5. La concentración del contenido glandular extraído se ajustó variando la posición de la red porosa respecto del fondo del cilindro entre 10 mm, 20 mm y 46 mm. Una de las extracciones se realizó con la red porosa retirada permitiendo el paso directo del contenido glandular desde la glándula hasta el fondo del cilindro. La concentración de proteína del contenido glandular total recogido se determinó a continuación mediante secado en estufa a 60ºC. Las concentraciones de proteína resultantes fueron: 20% para extracción sin red porosa, 15% con la red situada a 10 mm de distancia del fondo del cilindro, 11% con 20 mm de distancia, 7% con 46 mm de distancia y 5% con 100 mm de distancia.

Claims

1. Un aparato para la extracción de material de una glándula (70) de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante que comprende:

-: un dispositivo de sujeción (50) en el que se sujeta al menos parte de la glándula (70);

-: una disolución tampón (30) que baña la glándula (70) al menos parcialmente; en el que, durante el uso, se libera el material desde la glándula (70) a la disolución tampón (30); y

-: un área (20) de recogida de material en la que se recoge el material.

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2. El aparato de la reivindicación 1, que incorpora adicionalmente un soporte (60).

3. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se sedimenta el material dentro del aparato.

4. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incorpora adicionalmente un dispositivo (80) de captación-y-colocación.

5. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución tampón tiene uno o más aditivos (40).

6. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el soporte (60) es movible dentro del aparato.

7. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el soporte (60) es no poroso.

8. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dispositivo de sujeción (50) es movible dentro del aparato.

9. Un procedimiento para la extracción de material de una glándula (70) de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante que comprende:

-: proporcionar la glándula (70) que contiene al menos parcialmente el material;

-: hacer una abertura en la glándula (70);

-: colocar la glándula (70) en un dispositivo de sujeción (50), estando la glándula (70) al menos parcialmente sumergida en la disolución tampón (30) de modo que el material se libera desde la glándula (70).

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10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el material se selecciona entre el grupo constituido por proteínas, péptidos y combinaciones de los mismos.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 ó la 10, en el que el material es fibroína.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el gusano de seda puede ser cualquier especie nativa o recombinante de la familia Bombycidae.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que adicionalmente comprende añadir al menos un aditivo (40) a la disolución tampón.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que al menos un aditivo (40) es una molécula biológicamente activa.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, que adicionalmente comprende un ajuste de la distancia entre el dispositivo de sujeción (50) y/o un soporte (60) y un área (20) de recogida de material.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, que adicionalmente comprende hacer que pase el material liberado a través del soporte (60).

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, que adicionalmente comprende un ajuste de la distancia entre el soporte (60) y un área (20) de recogida de material.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en el que proporcionar la glándula (70) comprende la retirada de la glándula (70) del cuerpo del gusano de seda.