JPH02268693A - 後部絹糸腺培養による絹フィブロインの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、カイコの後部絹糸腺培養による、絹フィブロ
インの生産方法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］絹フィ
ブロインは、現在その有用性が認識され酵素固定化担体
や化粧品として活発に利用されている高分子量タンパク
である。通常、絹フイブロイン水溶液は繭から精練、溶
解、透析といった過程を経て得られ、原料となる繭は、
養蚕によって供給される。従って、多量の絹フイブロイ
ン水溶液を得るためには、一連の複雑な過程が要求され
ると同時に、面の生産時期は食下葉である桑の生育時期
に大きく依存するといった問題点がある。

従って絹フィブロインを特異的に合成する器官である後
部絹糸腺を、カイコ体外で培養することにより絹フィブ
ロインを生産する方法が望まれる。

しかし、従来、絹糸腺の培養に関する技４＋ｉはそのほ
とんどがバイオリアクターとして機能させるためではな
くホルモン効果やタンパク合成機構を検討するためにあ
った。例えば、静置、振とう条件下においてＬ字管内や
試験管内で２時間程度の培養を行い絹タンパクの生産が
確認されている。

又、後部絹糸腺をポリアクリルアミドで固定化し培養す
ることによってその寿命が２０時間程度にまで伸びるこ
とも報告されている。しかし、いずれも紺フィブロイン
の生産量は少なく、さらに後部絹糸腺の寿命も短く、到
底実用的に応用することができない。

従って、本発明は、バイオリアクターを目的とした後部
絹糸腺培養のための培養装置及びそれを用いた培養方法
を開発し、組フィブロインを連続的に生産する方法を提
供することを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本実験は、後部絹糸腺による絹フィブロインの生産方法
に関し、カイコより無菌的に摘出した後部♀［ｉ糸線を
、培地の循環下に培養することによって絹フィブロイン
を生産させることを特徴とするものである。

本発明の実施に当たって、まず、カイコの後部絹糸腺を
調整する。この後部絹糸腺は、例えば絹フィブロイン生
産の盛んになる５齢５日目のカイコを用い、常法に従っ
て滅菌後（例えば７０χエタノールに数分間浸す）、無
菌的に摘出することＱこよって得ることができる。

次に、♀１１フィブロインの連続的な生産を行うための
ハ・イオリアクターの製作について、まず後部絹糸腺が
培養される容器には、培地がその中を流れ、培養系内を
循環することが可能なものを用いる。酸素供給に関して
は、後部絹糸腺に物理的なダメージを与えずに多量の酸
素を培地中に溶存させ効果的な酸素供給を行うために、
例えば、酸素分子を透過するシリコン性のザイラスティ
ックチューブを用いる。そして長間の培養には生産され
た紺フィブロインが液状絹として培地に）容出し、流速
の変化や障害物との接触、ポンプによる圧縮作用をうけ
て不溶化して膜やゲル状になりチ、。

ブがつまってしまうのを防くため、ヌ培養終Ｙ後の絹フ
ィブロインの回収をＦ１便に行うために、例えば、チュ
ーブの内径を大きくして流速の変化を緩やかにする、ト
ラップを設Ｈ）る、培養容器は酸素供給装置等の他の附
属装置と一体系にせず単純なものを用いることが望まし
い。全ての装置は、滅菌を節便に行うため、例えばオー
トクレーブ等の滅菌方法に耐えられるものであることが
望ましい この培養装置を用いた培養方法によれば、培養中に培地
を循環させることにより、静置条件での培養で見られる
後部絹糸腺近傍での必要栄１分−や酸素の欠如、老廃物
の蓄積を防ぎ、後部絹糸腺に必要栄養分や酸素を効果的
に供給し、蓄積した老廃物の効果的な除去が行なわれる
ものである。必要栄養分や酸素の効果的供給は、かくは
ん培養によっても可能であるが、それによって後部絹糸
腺に物理的なダメージを与えると組織に悪影害を及ぼし
、ひいては絹フイブロイン生産が停止してしまうため、
この点からも、本発明に関わる培養方法：よ好ましい。

そして、培養開始後一定時間後に全ての培地を新鮮培地
と入れ替えたり、新鮮培地を連続的に供給することによ
って培地全体の必要栄養分の欠如や老廃物の蓄積を防く
ことができる。

この培養に用いる培地としては、栄養豊富な無を椎動物
の細胞培養に用いられるブレース・インセクト・メディ
ウム（ギブコ社）を使用すると良い。培養温度は２５゛
Ｃが望ましく、培養のｐ＋＋は６．６〜７．０が適当で
ある。

最後に、上記培養において、生産された絹フィブロイン
を含む培養液を取り出し、透析によって、培養液を取り
除くことにより、絹フイブロイン水溶液を得る。

以下実施例、参考例、対照例によって、本発明の一実施
態様を説明する。

す考↓ｊ↓ 〈培養成績の評価方法〉 培養成績は培養により生産された絹フィブロイン及び後
部絹糸腺の総乾燥重量増加率で評価した。

以下にその式を示した。

重量増加率（％） −（（ＷしＷ２）　−ＷＯ）　／ＷＯ ここで、ＷＯ；培養前の後部絹糸腺の乾燥重量Ｗ１；培
り後の後部絹糸腺の乾燥重量 Ｗ２；培養後の培地から回収した産生された絹フィブロ
インの乾燥重量 各々の重量測定法は参考例２、及び３に述べた。

ｊ考拠Ｉ 〈培養前の後部絹糸腺の乾燥重量〉 カイコから摘出した直後の後部絹糸腺の余分な水分を取
り除き湿重量を測定した後、乾燥器内４０°Ｃで乾燥さ
せその乾燥重量を測定し湿重量と乾燥重量の相関を示す
検量線（第１図）を作成したところ、最小二乗法による
相関係数は０．９９７８と信頓できる値となり湿重量１
ｍｇの後部絹糸腺を乾燥させると０．１１９４　ｍｇと
なることがわかった。培養前の後部落■糸線の重Ｙはこ
の値を用いて湿重量から４１算した。

５１９例−１ く培養後の後部絹糸腺及び産生された絹フィブロインの
乾燥重量〉 培養をしていると摘出時すでに後部相系線内にあった箱
フィブロインや新たに生産されたｌｉミツイブロイン培
地中に溶出するために、培養後の後部絹糸腺の乾燥重量
に）容出した絹フィブロインの乾燥重量を加える。、・
容出した絹フィブロインは１００χメタノールによる分
別沈澱で回収し、メタツルと蒸留水でよく洗浄して得た
。乾燥は乾燥器内４０゛Ｃで行った。

丈−施桝」− 工程上 く後部絹糸腺の摘出〉 家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）から後部絹糸腺をクリ
ーンへンチ内で摘出して１．１５χｋｃｌ？Ｓ液で洗浄
した。

工程−亀 〈後部絹糸腺の培養〉 第２図に示されているような培養装置を作成し２、１０
．２２．３０．４８時間の培養を行った。培な中はポン
プで培地を循環させ一定時間後に全ての培地を引き抜き
新鮮培地を入れる。１回の培養にはカイコ３頭分の後部
絹糸腺を使用した。培地にはブレス・インセクト・メデ
ィウムを使用した。酸素及び培地の流速は２　ｍｌ／ｓ
ｅｃで行った。培養温度は２５°Ｃで行った。

又、１１５時間の長間にわたる培養には第２図に示した
培養装置を改良して行った。改良、点は培地中に溶出し
た絹フィブロ・インが析出してチューブがつまるのを防
ぐためにチューブの内径を大きくし、培養容器との接続
部には円錐状のパイプを取り付は流速の掻端な変化を避
けた。又、酸素供給装置と培養容器を分けて培養後の絹
フィブロインの回収が簡便に行えるようにした。培養方
法、及び使用した培地は同様である。

工程−ｙ く絹フィブロインの採取〉 工程２の培養で得られた培養液より１００　％メタノー
ルによる分別沈澱によって絹フィブロインを回収した。

参考例１．２．３に記載の方法により求めた培養結果を
第３図に示した。又培地中に溶出した化フィブロインと
後部絹糸腺の重量増加率の比較を第４図に示した。絹フ
イブロイン中呈は時間経過に従い増加していき、又その
ほとんどが培地中に溶出した分であり、１１５時間の長
期にわたる連続的な絹フィブロインの生産が行われるこ
とが薙Ｌ２、された。１１５時間後の生産された絹フイ
ブロイン量は乾燥重量で約１５０　ｍｇとなり、もとの
後部絹糸腺重量の約２倍に当たる。

″Ｘｊ１缶貰１ く生産された絹フィブロインの確認〉 培地中にｌｊ：ＩＣラヘルグリンンを添加し、ＮＭＲ管
内で培養を行ない経時変化をＮ　Ｍ　Ｒ測定することに
より培地中のラベルグリシンが生産された絹フイブロイ
ン中へ取り込まれることが確認され（第５図）、又本培
養装置を用いて生産された絹フィブロインの分子量もＳ
ＤＳゲル電気泳動法により、菌中の化フィブロインと同
程度であると確認した。（第６図） 比１鵜」− 〈他の培養方法との比較ｌ〉 ブレース・インセクト・メディウムを使用し、Ｌ字管を
用いて静置、振どう条件下で培養を行なったが絹フィブ
ロインの生産は停止している。その結果を表１に示す。

く他の培養方法との比較２〉 グレ〜ス・インセクト・メディウムを使用し、酸素供給
のためのサイラステインクチューブを取り付けたビーカ
ー型の容器を用いて５時間おきに全ての培地を新鮮な培
地と交換する方法で培養を行ったが、第７図に示される
ように絹フィブロインの生産は停止してしまった。

蓑考炎↓ く溶存酸素の局在化と循環培養の有用性〉Ｌ字管を用い
た静置培養を行い第８図に示されている各地点の溶存酸
素を酸素電４Ｍ　（ＴＹＰＥ　ＢＯ−Ｇ（株）石川製作
所）を用い測定したところ後部絹糸腺近傍が特に低いこ
とがわかった。結果を表２に示す。これは後部絹糸腺の
酸素の消費によるものであり、同様に必要栄養分や老廃
物についても後部絹糸腺近傍での局在化が起こっている
と考えられ、循環培養ではこの局在化を防いでいる。

以下余白 での 〔発明の効果］ 本発明により、家蚕後部絹糸腺の１１５時間以上にわた
る器官培養が可能となり、高分子量タンパクである紺フ
ィブロインの連続的な生産を行なうことができる。この
絹フィブロインは酵素固定化担体や化粧品等に利用する
ことができ、今後、食品、医薬品、化学工業の分野での
バイオリアクタとして、医療、分析の分野でのバイオセ
ンサとして、広く利用されていく可能性を秘めている。

さらに、聞フィブロインを特異的に合成する器官である
後部絹糸腺のカイコ体外での長時間培養が可能になった
ことにより後部絹糸腺のバイオリアクターとしての利用
、即ち絹フィブロインのみならず有用物質生産のだめの
場としての利用が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は摘出直後の後部絹糸腺の湿重量と乾燥重量との
相関を示す検量線である。 第２図は、循環培養装置の概略図である。 第３図は循環培養による紺フィブロイン生産の結果であ
る。 第４４図は循環培養による重量増加分を溶出絹フィブロ
インと後部絹糸腺に分けて示した図である。 第５図はｌ−１３Ｃラベルグリシンの絹フイブロイン中
への取り込みを示すＮＭＲスペクトルである。 第６図はＳＤＳゲル電気泳動法により培養生産物を泳動
した結果である。 第７図は培地を循環せず交換のみ行う条件下での培養に
よる絹フイブロイン生産の結果である。 第８図は静置条件下での溶存酸素量の測定方法を示した
図である。 なお、第２図及び第８図における略号は、以下の器具等
を示す。 ｉ：Ｏｚバック、２：ベリスターポンプ、３：シリコン
栓、４：サイラスティソクチューブ、５：後部絹糸腺、
６：ナイロンネット、７；三方コック、８；エアーフィ
ルタ ９：回収した培養液、１０：新鮮培地、１１：酸素１掻
、１２ニサランメノシユ、１３：Ｌ字管特許出願人　旭
化成工業株式会社 第 ）凹 湿重量 （Ｙｎ　ｇ） 培養時間 （ｈ ＝：ｎＺ・す；く・、ｊ 第６図 Ｊ′音卆茨１侍［Ｕ ７面のに′・需 第８図 口 ］ 手 続 捕 正 書（方式） 事件の表示 平成 １年特許願第８８１５６号 発明の名称 後部絹糸腺培養による絹フィブロインの生産方法補正を
する者 事件との関係

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）カイコより無菌的に摘出した後部絹糸腺を、培地の
   循環下に培養することによって、絹フィブロインを生産
   する方法