CN111330076B - 一种组织工程支架的脱细胞装置 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种脱细胞装置。所述脱细胞装置包括依次密封连通的第一管道，第一容器，第二管道，第二容器和第三管道，以及与第三管道连接的第三容器；所述第一管道的一端连接第一容器的第一开口；所述第二管道的一端连接第一容器的第二开口；所述第二管道的另一端和第三管道的一端分别连接第二容器的两端；所述第二容器用于放置生物材料，且生物材料不能进入到第二管道和第三管道中。用所述装置对生物材料进行脱细胞，使生物材料能够被彻底处理，极大提高了脱细胞的效果。且可自动弃掉废液，自动清洗，大大减少细胞洗脱和清洗过程的操作步骤和用水量。

Description

一种组织工程支架的脱细胞装置
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种生物材料脱细胞装置。
背景技术
ECM(Extracellular Matrixc，细胞外基质)是各种生物材料的主要组织成份，为细胞的生存及活动提供适宜的场所，参与调节胚胎发育进程，决定细胞的粘附与迁移，在创伤修复和纤维化、细胞的生长、分化、代谢和肿瘤发生及转移中起重要作用。因此，ECM被广泛用于制作医用植入材料，以主动诱导和促进周围细胞的迁入、粘附、增殖和分化。生物材料除了含有ECM之外，还包括细胞成分，而异种生物材料的细胞成分容易引起免疫反应。
所以将ECM作为植入材料使用时，还需要对异种生物材料进行脱细胞处理，以去除引起免疫反应的细胞成分，保留天然ECM结构和成分。因其无免疫原性，以及良好的生物相容性，成为组织工程支架材料的选择之一。
脱细胞处理的真皮、心包、角膜、血管、膀胱、食管、小肠粘膜基质、骨、肝脏等作为相应组织的替代物已相继开发成功，显示出良好的应用前景。
但目前采用的脱细胞处理方法为：添加化学试剂同时机械震荡。水浴摇床是脱细胞常采用的装置，水浴摇床包括容纳腔和驱动装置，可以将生物材料、水和化学试剂等放入容纳腔内，使化学试剂溶液对生物材料进行脱细胞处理，以破坏细胞间或细胞与ECM间的连接、溶解细胞质成分、破坏细胞内核酸、蛋白、脂质间的连接等，同时启动驱动装置驱动容纳腔中的溶液震荡，使溶液和生物材料之间产生相对运动，以破坏细胞膜，释放出细胞内容物，以彻底清除细胞成分。
而生物材料在脱细胞过程中需要使用多种不同类型的溶液进行多次漂洗。如果使用机械震荡的方式将需要多次取出生物材料，去掉相应的溶液，换成新的溶液。如此反复，其处理过程是非常繁杂。并且多次取出生物材料这种操作容易造成生物材料的微生物污染和损伤。且摇床需要不间断的驱动强度，因此耗能也较大。
另外，现行方法主要是利用物理，化学和生物因素，直接导致有活性完整细胞裂解，然后清洗去除细胞碎片。但从临床应用效果来看，产品的力学强度或生物学活性仍不令人满意。
发明内容
本发明的另一个目的在于提供一种生物材料脱细胞装置。
本发明目的之一在于提供一种生物材料脱细胞装置。
本发明的另一个目的在于提供一种简易的脱细胞装置。
本发明的另一个目的在于提供一种脱细胞效果优异的脱细胞装置。
本发明的另一个目的在于提供一种在保持脱细胞效果良好的前提下还能保持组织较好性能的脱细胞装置。
另一方面，本发明提供了一种脱细胞装置，包括依次密封连通的第一管道，第一容器，第二管道，第二容器和第三管道，以及与第三管道连接的第三容器；所述第一管道的一端连接第一容器的第一开口；所述第二管道的一端连接第一容器的第二开口；所述第二管道的另一端和第三管道的一端分别连接第二容器的两端；所述第二容器用于放置生物材料，且生物材料不能进入到第二管道和第三管道中。其中所述的两端包括竖直时的上端下端，或者是水平时的左端右端，或者是其他非垂直状态的两端。
某些实施例中，细胞脱洗液置于所述的第三容器中，细胞脱洗液从第三容器经过第三管道流向第二容器中，再经过第二管道流向第一容器；而生物材料置于第二容器中，这个过程中细胞脱洗液会对生物材料进行不断地洗脱；因此，能够完成细胞脱洗液的这个流通过程的方式都可以满足要求。例如在某些实施方式中，对第一管道的另一端给予一个负压，第三容器中的细胞脱洗液在这种负压的作用下，会完成所述的细胞洗脱液的流通过程。
某些实施例中，给予所述负压作用的为一种负压吸引装置；所述负压吸引装置与所述第一管道的另一端连接。
其中某些事实施例中，所述负压吸引装置为真空泵。
作为一种可以选择的实施方式，所述的负压吸引装置选自循环水真空泵、干式螺杆真空泵、往复泵、滑阀泵、旋片泵、罗茨泵和扩散泵中的一种。
其中某些实施例中，所述第一管道的一端连接第一容器的上部。
某些实施例中，所述第二管道的一端连接第一容器的上部。
其中一些实施例中，所述第二管道伸入到第一容器内。
在某些实施例中，所述第三容器不密封。
另外一些实施例中，所述第三容器具有一开口。
某些实施例中，所述第一容器的第一开口至少位于第一容器的1/3高度以上。
作为一种优选的实施方式，所述第一开口至少位于第一容器的1/2高度以上。
作为进一步的优选实施方式，所述第一开口至少位于第一容器的2/3高度以上。
其中一些实施例中，所述第三管道至少伸入第三容器的2/3高度以下。
作为一种优选的实施方式，所述第三管道至少伸入第三容器的1/2高度以下。
作为一种更为优选的实施方式，所述第三管道至少伸入第三容器的1/3高度以下。
其中一些实施例中，所述第二管道和/或第三管道与第二容器连接处的直径小于生物材料的最小直径，这样保证生物材料不会进入管道中。
某些实施例中，所述的第二容器有一可闭合的口，通过此口便于将生物材料放入或取出。
另外一些实施例中，所述第二容器由第一半容器和第二半容器构成；所述第一半容器和第二半容器可拆卸连接，同样，通过这种结构的第二容器可以达到将生物材料放入或取出的目的。
在某些实施例中，所述第一半容器与第二半容器为嵌合连接；这种嵌合连接的设计，起到了很好的生物材料放入和密封的效果，保证脱细胞过程中的无菌及纯度。
作为一种可以选择的实施方式，所述的第一半容器与第二半容器为嵌合连接处设置有磨砂。
某些实施例中，所述第二管道和/或第三管道与第二容器连接处设置过滤装置，其阻挡生物材料通过，能通过的物质包括脱洗下来的细胞和液体；所述连接处不仅可以是二者接头处，也可以是靠近接头处的第二容器内或者靠近接头处的管道内。
某些实施例中，所述第二容器里面可以设置一个或多个承载生物材料的支撑部；如果所述支撑部有多个，则可以将多份生物材料置于支撑部上，同时进行脱细胞处理。
作为一种可以选择的实施方式，所述支撑部与所述第二容器可拆卸连接。
其中某些实施例中，所述脱细胞装置可以同时设置所述过滤装置和所述支撑部。
某些实施例中，所述脱细胞装置设置所述过滤装置和所述支撑部中的一种。
作为一种可以选择的实施方式，所述支撑部为一可开合的镂空容器，其闭合后不允许所述生物材料通过而允许液体和细胞通过。
作为一种可以选择的方式，所述支撑部为支架。
本发明的某些实施例中，所述支撑部彼此间隔设置，这样可以避免在处理多份生物材料的时候，生物材料之间发生团聚、缠绕在一起；间隔设置可以增强脱细胞效果。
当然，本发明中，作为生物材料脱细胞装置，可以不含有支撑部，例如处理透明软骨样本或纤维软骨样本时。
当生物材料具体为骨腱界面复合体时，如果不将所述生物材料悬吊于支撑部上，则生物材料与溶液相对运动的频率和幅度较大；而这样将容易损伤支架的肌腱部分。因此，当生物材料具体为骨腱界面复合体时，则最好在生物材料脱细胞装置的第二容器中设置支撑部。
某些实施例中，所述第一容器的底部还含有第三开口，细胞洗脱液流入第一容器之后可以直接排出。
作为一种可以选择的实施方式，所述第三开口可以闭合；所以根据实际需要选择开或者关。
某些实施例中，所述第二容器为玻璃瓶。
某些实施例中，所述第二容器为灌洗瓶。
某些实施例中，所述第三容器为龙头瓶。
作为一种可以选择的实施方式，所述第一管道、第二管道和第三管道中至少一个管道上设有一个或多个流量调节器；可以根据实际需要调节细胞洗脱液的流速。
某些实施例中，所述流量调节器选自血管钳、输液管调节器、绷带中的一种或多种。
某些实施例中，所述脱细胞装置还包括用于固定第二容器的固定架，有固定架可以更好地保证整个脱细胞装置的稳定。
作为一种可以选择的实施方式，所述固定架为铁架台。
作为一种优选的实施方式，所述铁架台上至少设置有一个固定部，其用于固定第二容器。
作为一种更为优选的实施方式，所述铁架台上至少设置有三个固定部，其用于固定第二容器，第二管道和第三管道。
一方面，本发明提供了一种脱细胞方法。
待处理的生物材料放置于一容器内，然后使细胞洗脱液流经所述的容器，直至生物材料脱细胞结束。
某些实施例中，所述脱细胞方法中，通过负压使细胞洗脱液流经所述容器。
某些实施例中，所述脱细胞方法包括以下步骤：
(1)将生物材料用磷酸盐缓冲液清洗，然后用纱布进行包裹；
(2)再将步骤(1)中的生物材料进行冻融循环；
(3)将步骤(2)中的生物材料取出依次经细胞洗脱液：A液、B液、C液、D液、E 液、F液、G液直至生物材料脱细胞结束；其中用A液、B液、C液、D液进行洗脱时，所述生物材料固定于容器内进行；
其中，所述A、D、G液为PBS；所述B液为Triton X-100溶液；所述C液为Tris缓冲液；所述E液为胰蛋白酶溶液；所述F液为脱氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶A组成的核酸酶溶液。
作为一种优选的实施方式，所述B液为含0.1-1.5M KCl的Triton X-100溶液；所述Triton X-100的体积份数为0.05-2％；所述C液为5-12mM Tris缓冲液；所述E液为0.1-3 g/L胰蛋白酶溶液；所述G液为500U/mL脱氧核糖核酸酶I和1mg/mL核糖核酸酶A组成的核酸酶溶液。
作为一种可以选择的实施方式，步骤(1)中，所述清洗次数为1次以上，每次时间为10min以上。
作为一种优选的实施方式，所述清洗次数为3次，每次时间为30min。
作为一种可以选择的实施方式，步骤(2)中，所述冻融循环次数为1～5次。
作为一种优选的实施方式，步骤(2)中，所述冻融循环次数为3次。
作为一可以选择的实施方式，步骤(2)中，一个冻融循环的步骤包括：将所述生物材料于液氮中冷冻8-20min，然后在30-40℃恒温水浴锅中解冻5-20min。
作为一可以选择的实施方式，步骤(3)中，所述B液的处理条件为0～4℃，脱细胞1-15h。
作为一可以选择的实施方式，步骤(3)中，所述C液的处理条件为0～4℃，脱细胞1-5h。
作为一可以选择的实施方式，步骤(3)中，所述D液的处理条件为0～4℃，脱细胞1-5h。
作为一可以选择的实施方式，步骤(3)中，所述E液的处理条件为30-40℃，脱细胞12-30h。
作为一可以选择的实施方式，步骤(3)中，所述F液的处理条件为30-40℃，脱细胞7-15h。
作为一可以选择的实施方式，步骤(3)中，所述G液的处理条件为20-37℃，脱细胞10-24h。
作为一种可以选择的实施方式，所述生物材料为骨、真皮、心包、角膜、血管、膀胱、食管、小肠粘膜基质、软骨、肝脏。
作为一种可以选择的实施方式，所述生物材料为软骨。
作为一种优选的实施方式，所述生物材料为透明软骨。
作为一种优选的实施方式，所述生物材料为纤维软骨。
作为一种优选的实施方式，所述生物材料骨/腱界面复合体。
还有一方面，本发明提供了一种所述方法制得的脱细胞的生物材料。
本发明中的某些实施例中，所述溶液均无菌。
作为一种可以选择的实施方式，所述溶液中含有1％青链霉素和2.5mg/ml两性霉素。
与现有技术相比，本发明其中一个实施例的有益效果在于：
1、制备出脱细胞非常彻底的生物材料支架，力学强度好，最大程度上保留了的支架的固有成分；不仅能有效去除组织内具有大部分抗原的细胞成分，降低移植物的免疫排斥反应，同时能维持组织大致形态结构，保留大部分组织基质成分和生物活性因子，为实现对骨腱界面的形态结构和基质成分双重仿生基础。
2、通过将生物材料放置于所述生物材料脱细胞装置中，所述生物材料脱细胞装置能够对所述生物材料进行反复漂洗，使生物材料均能够被彻底处理，极大地提高支架的脱细胞效果。
3、所述生物材料脱细胞装置中可以通过设置多个支撑架，增大生物材料的放置数量，提高生产效率，且能够保证生物材料支架不会相互缠绕以及能够将生物材料的运动范围限定在较小的区域，减少生物材料的损伤。
4、所述生物材料脱细胞装置因为不用将生物材料分别从各种脱细胞液中取出，且可以直接打开废液瓶中的开口，将废液去掉，避免多次换液对生物材料的损伤；且所述生物材料脱细胞装置开启自动清洗模式，排水机构启动将脱细胞废液自动排出，大大减少清洗过程的操作步骤和用水量。
附图说明
图1为本发明实施例1生物材料脱细胞装置的示意图。
图2为本发明实施例1另外一种生物材料脱细胞装置的示意图。
图3为本发明实施例2的生物材料脱细胞装置的示意图。
图4为本发明实施例3的生物材料脱细胞装置的示意图。
附图中部件名称对应的标号如下：
负压吸引装置1；电源开关100；抽真空接口101；
第一管道200；第二管道201；第三管道202；
第一容器3；第一开口300；第二开口301；第三开口302；
玻璃管4；
第二容器5；第一半容器500；第二半容器501；
生物材料6；
支撑部7；
第三容器8；
固定架9；
第四容器11；开口110；开口111；开口112
液流调节器12。
图5为骨、纤维软骨、肌腱组织脱细胞前后HE染色结果。
图6为骨、纤维软骨、肌腱组织脱细胞前后扫描电镜观察结果。
图7A-7C为骨、纤维软骨、肌腱组织脱细胞前后SR-FTIR法检测其胶原蛋白和蛋白多糖的含量变化：图7A为SR-FTIR法检测图谱；图7B为SR-FTIR法检测骨、纤维软骨、肌腱组织脱细胞前后其胶原蛋白的含量变化直方图；图7C为SR-FTIR法检测骨、纤维软骨、肌腱组织脱细胞前后其蛋白多糖的含量变化直方图。
图8为骨、纤维软骨、肌腱组织脱细胞前后的生物力学测试结果。
图9为不同脱细胞方法得到的骨腱界面支架脱细胞效果的检测结果：
图9A分别为细胞含量；胶原的分布和含量；蛋白多糖的分布与含量检测结果；图9B为DNA含量的检测结果；图9C为胶原含量的检测结果；图9D为蛋白多糖含量的检测结果；图9E为拉断载荷的检测结果；图9F为刚度的检测结果。
图10为支架与骨髓间充质干细胞黏附实验扫描电镜检测结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在本发明实施例的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
书页支架：将组织工程支架切成书页的形状，一般包含一个柄和五个页，设计“书页”原理的组织薄片切割方法，克服了单层组织薄片的局限性，便于体外组装及手术植入；增加支架间隙，有利于细胞迁入支架内部生长；缩短脱细胞处理时间，避免了细胞外基质活性成份流失。
组织工程支架：指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的不同组织，并根据具体替代组织具备的功能的材料；为了使种子细胞增殖和分化，需要提供一个由生物材料所构成的细胞支架，支架材料相当于人工细胞外基质；组织工程支架材料包括：骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官，如肝、脾、肾、膀胱等的组织支架材料。
下文公开提供了不同的实施例和例子用来实现本发明的目的。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例的装置的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/其他材料的使用。
下面参考附图描述根据本发明的生物材料脱细胞装置，可用于脱去生物材料(例如骨、软骨)中的细胞。
本发明中的具体实施例中，所述负压吸引装置可以为循环水真空泵1、干式螺杆真空泵、往复泵、滑阀泵、旋片泵、罗茨泵和扩散泵等，但又不限于此。
所述的第一管道200、第二管道201；第三管道202可以选自为医用乳胶管、玻璃管、硅胶管、橡胶管中的一种或三种。
本发明中的具体实施例中，所述第一容器3为废液瓶，可以至少有第一开口300、第二开口301、第三开口302中的一个开口；可以具体为抽滤瓶。
所述的第二容器5可以为灌洗瓶也可以为磨砂瓶，用于放置生物材料6。
生物材料6可以为骨、真皮、心包、角膜、血管、膀胱、食管、小肠粘膜基质、软骨、肝脏、骨/腱界面复合体；
支撑部7可以为铁框、铁丝；
第三容器8可以为广口瓶也可以为锥形瓶、龙头瓶等。
固定架9可以为铁架台，但又不限于此。
实施例1
如图1所示，脱细胞装置包括依次密封连通的第一管道200，第一容器3，第二管道201，第二容器5和第三管道202，以及与第三管道202连接的第三容器8；所述第一管道 200的一端连接第一容器3的第一开口300；所述第二管道201的一端连接第一容器3的第二开口301；所述第二管道201的另一端和第三管道202的一端分别连接第二容器5的两端；所述第二容器5用于放置生物材料6，且生物材料6不能进入到第二管道201和第三管道202中，所述的溶液包括细胞可以进入第二管道201和第三管道202中。第三容器8的位置高于第二容器5，第二容器5的位置高于第一容器3时，脱细胞液在负压或者重力的作用下，从第三容器8流经第二容器5，再达到第一容器3。生物材料6置于第二容器5中，整个过程脱细胞液不断地流经生物材料6进行反复漂洗，从而起到脱细胞的效果。
实施例2
本发明的另外一个实施方式，如图2所示，所述脱细胞装置还包括一个负压吸引装置 1，所述负压吸引装置1可以为循环水真空泵，其上面有电源开关100，抽真空接口101。第一容器3上有三个开口，为第一开口300、第二开口301，其中第一开口300通过第一管道 200与负压吸引装置1上的抽真空接口101连接。所述脱细胞装置还可以包括玻璃管4，玻璃管4的一端通过第一容器3上的第二开口301插入第一容器3中；另一端与第二管道201 的一端连接。本实施例中，第一容器3上的第二开口301可以塞入橡胶塞，玻璃管4可通过所述橡胶塞插入第三容器3中。另外，第三容器3可以为龙头瓶，可以有第三开口302，用于排出脱细胞液。
第二容器5可分为第一半容器500和第二半容器501，第一半容器500和第二半容器501可以嵌合连接，两者的连接处设置有磨砂。
所述第二管道201和/或第三管道202与第二容器5连接处可以设置过滤装置，其阻挡生物材料通过；液体和细胞可以通过。
第二容器5中内部设有可拆卸连接的支撑部7，为用于承载生物材料6的支撑架。生物材料6可悬挂在支撑部7中。本实施例中，当所述生物材料6悬挂在支撑部7中时，生物材料6可以为骨腱界面复合体、真皮组织等，但又不限于此。另外，本发明中，第二容器5可固定于铁架台9中。
第二容器5的第一半容器500的开口与第二管道201的另一端连接。第二容器5的第二半容器501的开口与第三管道202的一端连接，第三管道202的另一端从第三容器8的开口伸入脱细胞液液面以下。
第一管道200、第二管道201和第三管道202与所述的各个部件连接处可以使用密封贴膜进行密闭连接。所述生物材料脱细胞装置彼此之间是连通的，且保证不漏液；在开启负压吸引装置例如循环水真空泵时，能够保证整个生物材料脱细胞装置里面能够形成负压状态，能够使得脱细胞液从第三容器8中依次流经第三管道202、第二容器5、第二管道201和第一容器3或者从第三容器8中依次流经第三管道202、第二容器5、第二管道201、玻璃管4和第一容器3。
所述脱细胞装置工作时，打开负压吸引装置1的开关100(打开负压吸引装置后即引发循环水真空泵装置开启，待脱细胞液充满整个管道后，此时可关闭负压装置开关)。脱细胞液从第三容器8中依次流经第三管道202、第二容器5、第二管道201和第一容器3或者从第三容器8中依次流经第三管道202、第二容器5、第二管道201、玻璃管4和第一容器3。脱细胞液在负压的作用下不断地流经第二容器5，从而对生物材料6进行不断地冲洗，达到生物材料进行脱细胞的效果。当第一容器3中的脱细胞液满时，可开启第一容器3第三开口 302，将脱细胞废液自动排出。
如附图3所示，例如生物材料6为软骨组织样本时，本发明的生物材料脱细胞装置在图 2所示装置的基础上去掉了固定架9和支撑部7，生物材料可以不悬挂在支撑架上，直接放置在第二容器5中。
实施例3
本发明其中的一个实施例中，在实施例1图2的脱细胞装置的基础上，第一容器3里的脱细胞液(使用过的脱细胞液)可以循环利用。如图4所示，第一容器3中有使用过的脱细胞液(废液)，玻璃管4一端插入所述废液液面以下(其中第一容器3透气，例如可以去掉所述橡胶塞)。
将第三容器8用第四容器11替换。第四容器11有开口110、开口111和开口112，开口110通过第一管道200与负压吸引装置1上的抽真空接口101连接。
在脱细胞装置开始工作时，将第一容器3上的第一开口300和第三开口302关闭。开启负压吸引装置1，第一容器3中的溶液经过第二管道201，流经第二容器5，通过第三管道202再流向第四容器11。
脱细胞液在负压的作用下不断地流经第二容器5，对生物材料6进行不断地冲洗，达到对生物材料进行脱细胞的效果。
其中，第四容器11的开口111在工作中可以开启也可以关闭。如果开口111处于关闭状态，当第四容器11中的废液满时，可开启开口111，将脱细胞废液自动排出。如果废液打算重复利用，则可关闭开口111，达到储液的作用。
另外，本发明中还可以含有液流调节器12，可以调节生物材料脱细胞装置中的液体流速。
实施例4脱细胞方法
1、骨(骨腱界面复合体)、纤维软骨书页支架用1×PBS溶液(0.01M)冲洗(90 min)，然后取出支架置于纱布里层并进行包裹。
2、进行3次冻融循环(液氮中冷冻10min，然后在37℃恒温水浴锅中解冻10min，此为一个冻融循环)。
3、样本取出后在4℃环境下，置于实施例1生物材料脱细胞装置中，于PBS溶液中漂洗24h。
4、配制含1.5M KCl的0.1％Triton X-100溶液，将支架浸泡于此溶液中，冲洗12h，4℃。
5、10mM Tris缓冲液(pH 8.0)洗涤3h。
6、用PBS洗涤3h，4℃。
7、用0.25％胰蛋白酶在37℃下消化24h。
8、将样品置于核酸酶溶液(G)(浓度为500U/mL脱氧核糖核酸酶I和1mg/mL核糖核酸酶A)中孵育12h，37℃。
9、样本取出后在常温环境下PBS液中漂洗，4×6h。
以上溶液中均常规添加1％青链霉素和2.5mg/ml两性霉素防止微生物污染。
所述步骤3、4、5、6在实施例1或2所述的脱细胞装置中进行。
实施例5脱细胞效果测试
所述样本为骨、纤维软骨、肌腱组织按照实施例2的装置，以实施例4的脱细胞方法进行脱细胞处理。
1、生物材料的HE染色
依次将样本切片(制备成书页支架)放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min- 无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。
对脱细胞后的样本进行HE染色后，得到实验结果如图5所示。
图5的实验结果表明，HE染色后，脱细胞骨书页支架中可见明显的骨小梁结构；脱细胞纤维软骨书页支架中可见原软骨陷窝结构中并无细胞存留，胶原纤维排列较为疏松，大体结构并无明显改变；脱细胞肌腱书页支架中可见整体结构稍膨胀，肌腱细胞完全去除，胶原纤维排列较为紊乱。说明以上支架经该脱细胞装置以及脱细胞方法处理后在能保持原组织形态和结构的情况下，且组织中的细胞去除得很彻底。
2、生物材料的扫描电镜观察
通过扫描电镜观察，如图6所示，可以发现，经过本发明的方法处理后，骨、软骨、肌腱组织的细胞成分已全部去除。
3、生物材料的SR-FTIR法(同步辐射傅里叶红外光谱)检测
得到实验结果如图7A-7C所示，可知，经SR-FTIR检测各相支架脱细胞前后的基质成分(胶原蛋白和蛋白多糖)的变化，评估脱细胞过程对支架细胞外基质的影响，对比分析后，经该装置脱细胞后，骨、软骨、肌腱支架均能保持原组织基质成分。对比分析后，发现去细胞后骨支架保留有胶原纤维约88.23％，蛋白聚糖约92.99％；纤维软骨支架保留有胶原蛋白约81.23％，蛋白多糖约81.77％；肌腱支架保留有胶原蛋白约81.41％，蛋白多糖约92.22％(具体数值见表1和表2)。
表1
Figure RE-GDA0002496854260000111
表2
Figure RE-GDA0002496854260000121
4、生物材料的力学性能测试
用杨氏模量测定仪测量样本的杨氏弹性模量。其中，所述样本为骨、纤维软骨、肌腱组织按照实施例3的装置，以实施例4的脱细胞方法进行脱细胞处理。
得到的实验结果如图8所示，结果表明，经过该脱细胞装置处理后，发现去细胞后骨支架的杨式模量约为去细胞前的80.0％，纤维软骨支架的杨式模量约为去细胞前的93.9％，肌腱支架的杨式模量约为去细胞前的95.9％。
表3
Figure RE-GDA0002496854260000122
对比例1
将本发明的脱细胞装置替换成摇床，其他与实施例4相同。
L为未脱细胞组(只做脱钙处理的正常骨腱界面支架)；M为对照组(常规脱细胞方法处理的骨腱界面支架)；N为实验组(实施例4脱细胞方法处理的骨腱界面支架)。
T:tendon肌腱
F:fibrocartilage纤维软骨
B:bone骨
TR(tendinous region)肌腱区域
FR(fibrocartilage region)软骨区域
BR(bony region)骨区域
用常规的实验方法进行检测，检测结果如图9和图10所示，。从图9可以看出，使用本发明的装置进行脱细胞，其效果远远好于常规的摇床脱细胞的方法。
其中，图9A中，SR为天狼星红(sirius red)，SR-FTIR为同步辐射傅里叶红外成像(Synchrotron Radiation-Fourier Transform Infrared Spectroscopy)；TB为甲苯胺蓝(Toluidine Blue)。
图9B-9F中的L为未脱细胞组(只做脱钙处理的正常骨腱界面支架)；M为对照组(常规脱细胞方法处理的骨腱界面支架)；N为实验组(实施例4脱细胞方法)。
其中M与N的区别只在于M使用脱细胞装置为摇床，N的装置为实施例2的脱细胞装置。与摇床相比，用本发明的脱细胞装置进行脱细胞，在保证结构较为完整的前提下，还能够使得去细胞更为彻底。
另外，进行支架与细胞的黏附实验，支架细胞黏附步骤：a.共培养3天后取出支架-BMSCs复合体；b.PBS冲洗3次，去除表面未粘附细胞；c.2.5％戊二醛固定12小时， 4℃；d.30％，50％，70％，80％，90％酒精，无水乙醇，无水乙醇，梯度脱水，各30分钟； e.等比例醋酸异戊酯混合乙醇浸泡20分钟，轻微晃动；f.吸去混合液后常规临界点干燥法干燥；g.导电胶涂于样品台，用镊子轻夹支架，使支架细胞粘附面朝上，贴牢于导电胶上固定；h.离子溅射镀膜法行导电处理；i.扫描电镜观察。
支架与骨髓间充质干细胞黏附实验的扫描电镜图如图10所示。从图10可以看出，扫描电镜下观察BMSCs与去细胞骨腱界面支架的骨、纤维软骨和肌腱区域粘附情况，可见细胞均可以粘附于各相支架表面，有伪足伸出，攀附于支架突出部位。其中，粘附于去细胞骨支架表面的BMSCs伸展良好，呈多角形，粘附于去细胞纤维软骨支架表面的BMSCs体积较大，呈不规则分布，粘附于去细胞肌腱支架表面的BMSCs数量较多，体积较小，沿肌腱纤维走行分布。实验组的骨腱界面支架不论是骨、软骨还是肌腱区域其细胞黏附性能比对照组更好。

Claims (37)

1.一种脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述脱细胞装置包括依次密封连通的第一管道，第一容器，第二管道，第二容器和第三管道，以及与第三管道连接的第三容器；
所述第一管道的一端连接第一容器的第一开口；
所述第二管道的一端连接第一容器的第二开口；
所述第二管道的另一端和第三管道的一端分别连接第二容器的两端；所述第二容器用于放置生物材料，且生物材料不能进入到第二管道和第三管道中；
所述脱细胞装置还包括负压吸引装置；
所述负压吸引装置与所述第一管道的另一端连接；
所述的脱细胞装置的使用方法，其包括以下步骤：
(1)将生物材料固定于所述第二容器内；或者，将待处理的生物材料固定于第二容器内的支撑部；
(2)将脱细胞洗脱液放入所述第三容器中；
(3)启动所述脱细胞装置，使得细胞洗脱液从第三容器经第三管道流经第二容器，在第二容器中对生物组织进行脱细胞；然后经第二管道流入第一容器；
其中，步骤(1)和(2)对顺序没有要求；
所述的细胞洗脱液包括：A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液；其中
用A液、B液、C液、D液进行洗脱时，所述生物材料固定于容器内进行；
其中，所述A、D、G液为PBS；
所述B液为含0.1-1.5M KCl的Triton X-100溶液；所述Triton X-100的体积份数为0.05-2％；
所述C液为5-12mM Tris缓冲液；
所述E液为0.1-3g/L胰蛋白酶溶液；
所述F液为500U/mL脱氧核糖核酸酶I和1mg/mL核糖核酸酶A组成的核酸酶溶液。
2.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述的负压吸引装置为循环水真空泵。
3.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第一管道的一端连接第一容器的上部。
4.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第二管道的一端连接第一容器的上部。
5.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第二管道伸入到第一容器内。
6.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第三容器不密封。
7.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第三容器具有一开口。
8.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第一开口至少位于第一容器的1/3高度以上。
9.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第一开口至少位于第一容器的1/2高度以上。
10.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第一开口至少位于第一容器的2/3高度以上。
11.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第三管道至少伸入第三容器的2/3高度以下。
12.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第三管道至少伸入第三容器的1/2高度以下。
13.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第三管道至少伸入第三容器的1/3高度以下。
14.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第二管道和/或第三管道与第二容器连接处的直径小于生物材料的最小直径。
15.如权利要求1所述脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述的第二容器有一可闭合的口；
或者，所述第二容器由第一半容器和第二半容器构成；所述第一半容器和第二半容器可拆卸连接。
16.如权利要求15所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第一半容器与第二半容器为嵌合连接。
17.如权利要求15所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述的第一半容器与第二半容器为嵌合连接处设置有磨砂。
18.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第二管道和/或第三管道与第二容器连接处设置过滤装置，其阻挡生物材料通过；
和/或所述第二容器里面设置一个或多个承载生物材料的支撑部。
19.如权利要求18所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述支撑部与所述第二容器可拆卸连接。
20.如权利要求18所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述支撑部为一可开合的镂空容器，其闭合后不允许所述生物材料通过而允许液体通过。
21.如权利要求18所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述支撑部为支架。
22.如权利要求18所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述支撑部彼此间隔设置。
23.如权利要求1所述的脱细胞装置，其特征在于，所述第一容器的底部还含有第三开口。
24.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第三开口可以闭合。
25.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第二容器为玻璃瓶。
26.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第二容器为灌洗瓶。
27.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第三容器为龙头瓶。
28.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述第一管道、第二管道和第三管道中至少一个管道上设有一个或多个液流调节器。
29.如权利要求28所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述液流调节器选自血管钳夹闭和输液管调节器中的一种或两种。
30.如权利要求1所述脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述脱细胞装置还包括用于固定第二容器的固定架。
31.如权利要求30所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述固定架为铁架台。
32.如权利要求30所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述铁架台上至少设置有一个固定部，其用于固定第二容器。
33.如权利要求30所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述铁架台上至少设置有三个固定部，其用于固定第二容器，第二管道和第三管道。
34.权利要求1-33任一所述的装置的使用方法在生物材料脱细胞中的应用。
35.根据权利要求1-33任一所述的装置的使用方法，或者权利要求34所述应用，其特征在于，所述生物材料为骨、真皮、心包、角膜、血管、膀胱、食管、小肠粘膜基质、软骨、肝脏。
36.根据权利要求1-33任一所述的装置的使用方法，或者权利要求34所述应用，其特征在于，所述生物材料为透明软骨或纤维软骨。
37.如权利要求1所述的脱细胞装置的使用方法，其特征在于，所述细胞洗脱液可重复利用。
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