CN110612128A - 用于制造脱细胞化的组织的方法、脱细胞化的组织、和用于制造脱细胞化的组织的设备 - Google Patents

用于制造脱细胞化的组织的方法、脱细胞化的组织、和用于制造脱细胞化的组织的设备 Download PDF

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Abstract

一种用于制造脱细胞化的组织的方法，其包括如下步骤：使用包含液化气体的液体将生物组织的细胞裂解，和使用溶核酶将所述生物组织的裂解的细胞中包含的核酸组分降解。

Description

用于制造脱细胞化的组织的方法、脱细胞化的组织、和用于制 造脱细胞化的组织的设备
技术领域
本发明涉及用于制造脱细胞化的组织的方法、脱细胞化的组织、和用于制造脱细胞化的组织的设备。
背景技术
在再生医疗领域中，通过从人或某种别的哺乳动物的生物组织除去细胞组分例如胞浆组分、胞质组分、细胞骨架和细胞膜组分而产生的脱细胞化的组织被用作例如用于再生患者的衰竭(病变，损坏，failed)器官的支架组织植入。脱细胞化的组织主要由胞外基质组分例如弹性蛋白、胶原蛋白(I型、IV型)和层粘连蛋白构成。
用于制造脱细胞化的组织的常规方法包括使用包含界面活化剂的处理液体将生物组织脱细胞化(参见例如专利文献1-3)。具体地，将生物组织在包含界面活化剂的处理液体中浸渍几天，同时进行搅动。然而，因为界面活化剂致使构成胞外基质组分的蛋白质降解，所以脱细胞化的组织可受损。而且，使用以上方法的脱细胞化费时并且残余的界面活化剂可残留在脱细胞化的组织中。
在该方面，使用超临界二氧化碳将生物组织脱细胞化的方法被知晓(参见例如专利文献4)。
然而，在该方法中，大量DNA残留在脱细胞化的组织中。
要注意，脱细胞化的组织的DNA以干重计的量期望地小于50ng/mg(参见例如非专利文献1)。
引文列表
专利文献
[PTL 1]PCT国际申请公布No.JP-T-2005-514971的日文译文
[PTL 2]PCT国际申请公布No.JP-T-2006-507851的日文译文
[PTL 3]PCT国际申请公布No.JP-T-2005-531355的日文译文
[PTL 4]日本未审的专利申请公布No.2007-105081
非专利文献
[NPL 1]Biomaterials.2011年4月，32(12):3233-3243
发明内容
技术问题
本发明的一个目的在于，提供用于制造如下的脱细胞化的组织的方法：其基本上免受损伤并且具有小于50ng/mg的以干重计的量的DNA。
问题的解决方案
根据本发明的一个方面，用于制造脱细胞化的组织的方法包括如下步骤：使用包含液化气体的液体将生物组织的细胞裂解(胞解)，和使用溶核酶将所述生物组织的裂解的细胞中包含的核酸组分降解。
发明的有益效果
根据本发明的一个方面，能够提供用于制造如下的脱细胞化的组织的方法：其基本上免受损伤并且具有小于50ng/mg的以干重计的量的DNA。
附图说明
[图1]图1为说明根据本发明一种实施方式的用于制造脱细胞化的组织的实例性方法的流程图表。
[图2]图2为呈现二甲醚的饱和蒸气压曲线的图。
[图3]图3为说明根据本发明一种实施方式的一种实例性脱细胞化预处理设备的示意图。
[图4]图4为说明根据本发明一种实施方式的另一种实例性脱细胞化预处理设备的示意图。
[图5]图5为实施例1的用苏木精和曙红染色的脱细胞化的组织的光学显微照片。
[图6]图6为实施例2的用苏木精和曙红染色的脱细胞化的组织的光学显微照片。
[图7]图7为实施例3的用苏木精和曙红染色的脱细胞化的组织的光学显微照片。
[图8]图8为用苏木精和曙红染色的未处理的生物组织的光学显微照片。
具体实施方式
在下文中，将参照附图描述本发明的实施方式。
(用于制造脱细胞化的组织的方法)
图1说明根据本发明一种实施方式的用于制造脱细胞化的组织的一种实例性方法。
用于制造脱细胞化的组织的方法包括使用包含液化气体的液体将生物组织的细胞裂解(破坏)的步骤(步骤S1)、和使用溶核酶(核酸酶)将裂解的细胞中包含的核酸组分降解的步骤(步骤S2)。
在步骤S1中，例如，可使生物组织与包含液化气体的液体接触以将生物组织的细胞裂解(破坏)并使核酸组分暴露到所述细胞的外部。通过这种方式，脱细胞化的组织可基本上免于损伤，并且液化气体不太可能残留在脱细胞化的组织中。在本实施方式中，包含液化气体的液体使细胞膜组分溶解并因此裂解(破坏)细胞。
在本说明书中，液化气体是指在标准温度和标准压力(0℃，1atm(0.101325MPa))下构成气体的物质的液体形态。
尽管在本实施方式中使用的液化气体只要它能够将生物组织的细胞裂解而没有特别限制，但是可使用例如二甲醚、甲乙醚、甲醛、乙烯酮、乙醛、丙烷、丁烷、液化石油气、或者以上物质的两种或更多种的组合。在以上物质中，甲乙醚和二甲醚考虑到可将它们在相对低的温度和低压下液化的事实，可被适宜地使用。特别地，可优选地使用二甲醚。
二甲醚可在约1℃至40℃和约0.2MPa至5MPa下液化(参见图2)，并且因此，可使用成本相对低的设备用于制造脱细胞化的组织的生产设备。而且，因为液化二甲醚在标准温度和标准压力下容易蒸发，所以其不太可能残留在脱细胞化的组织中。
为了例如维持液化气体的液体状态，步骤S1的过程可在气密性提取槽中在饱和蒸气压以上的环境下进行。
尽管用于使生物组织与包含液化气体的液体接触的方法没有特别限制，但是例如，可基于生物组织的本性和性质选择适宜的方法，例如将包含液化气体的液体和生物组织混合并搅拌的方法、将生物组织浸渍在包含液化气体的液体中的方法、或使包含液化气体的液体循环并将其与生物组织接触的方法。
包含液化气体的液体可进一步包含溶剂(夹带剂)。
尽管所使用的溶剂没有特别限制，但是可使用例如乙醇、水、生理盐水溶液、PBS(磷酸盐缓冲的生理盐水溶液)、或者以上物质的两种或更多种的组合。
优选地将溶剂的加入量调至小于或等于其在液化气体中的溶解度。通过这种方式，可实现包含液化气体的液体的均一性。
液化气体的温度优选地在1℃至40℃的范围内、和更优选地在10℃至30℃的范围内。当液化气体的温度在1℃至40℃的范围内时，可缩减如下所述的脱细胞化预处理设备的成本。
液化气体的压力优选地在0.2MPa至5MPa的范围内、和更优选地在0.3MPa至0.7MPa的范围内。当液化气体的压力在0.2MPa至5MPa的范围内时，可缩减如下所述的脱细胞化预处理设备的成本。
尽管生物组织没有特别限制，但是例如，生物组织可为：获自人或某种别的哺乳动物的软组织，例如皮肤、血管、心脏瓣膜、角膜、羊膜、硬脑膜或它们的一部分；获自人或某种别的哺乳动物的器官，例如心脏、肾脏、肝脏、胰腺、大脑或它们的一部分；或获自人或某种别的哺乳动物的结缔组织，例如骨、软骨、肌腱或它们的一部分。
在使生物组织与包含液化气体的液体接触并然后将温度和压力调回到标准温度和标准压力之后，使液化气体气化并除去。
要注意，当通过将步骤S1的过程(工序)实施仅一次而使细胞裂解进行得不足时，可将步骤S1的过程重复多次。
在步骤S2中，例如，可使已经经历步骤S1的细胞裂解过程的生物组织与包含溶核酶的溶液接触以致使暴露到所述细胞的外部的核酸组分降解。结果，脱细胞化的组织的DNA以干重计的量可小于50ng/mg。
尽管在本实施方式中使用的溶核酶只要它能够降解DNA即可而没有特别限制，但是例如可使用脱氧核糖核酸酶(例如脱氧核糖核酸酶I)。
尽管用于使裂解的细胞与包含溶核酶的溶液接触的方法没有特别限制，但是可使用的实例性方法包括将包含溶核酶的溶液和已经经历细胞裂解过程的生物组织混合并搅拌的方法、将已经经历细胞裂解过程的生物组织在包含溶核酶的溶液中浸渍的方法、和使包含溶核酶的溶液循环并使其与已经经历细胞裂解过程的生物组织接触的方法。
用于使裂解的细胞与包含溶核酶的溶液接触的方法可基于已经经历细胞裂解过程的生物组织的本性和性质而适当地选择。
要注意，在一些实施方式中，步骤S2的过程可包括在步骤S1的过程中。即，例如使用包含液化气体的液体和溶核酶可将生物组织的细胞裂解并将所述细胞中包括的核酸组分降解。在该情形中，例如，可在使生物组织与包含液化气体的液体接触的同时引入包含溶核酶的溶液。
在一种优选实施方式中，用于制造脱细胞化的组织的方法进一步包括洗涤(洗净)已经经历核酸组分降解过程的生物组织的步骤(步骤S3)。
在步骤S3中，例如，可使已经经历步骤S2的核酸组分降解过程的生物组织与洗涤溶液接触以对其进行洗涤。
洗涤溶液的实例包括水、生理上相容的液体、生理上可接受的有机溶剂的水溶液、包含液化气体的液体、等。
尽管生理上相容的液体没有特别限制，但是实例包括生理盐水溶液、PBS(磷酸盐缓冲的生理盐水溶液)、和以上物质的两种或更多种的组合。特别地，例如可优选地使用生理盐水溶液。
尽管生理上可接受的有机溶剂没有特别限制，但是例如可使用乙醇等。
包含液化气体的液体可与步骤S1中使用的包含液化气体的液体相同或不同。
要注意，在一些实施方式中，步骤S3的过程可包括例如将已经经历核酸组分降解过程的生物组织在用水或生理上相容的液体洗涤所述生物组织之前用生理上可接受的有机溶剂的水溶液或包含液化气体的液体洗涤。
尽管用于使已经经历核酸组分降解过程的生物组织与洗涤溶液接触的方法没有特别限制，但是可使用的实例性方法包括将洗涤溶液和已经经历核酸组分降解过程的生物组织混合并搅拌的方法、将已经经历核酸组分降解过程的生物组织在洗涤溶液中浸渍的方法、和使洗涤溶液循环并使其与已经经历核酸组分降解过程的生物组织接触的方法。
使已经经历核酸组分降解过程的生物组织与洗涤溶液接触的方法可基于已经经历核酸组分降解过程的生物组织的本性和性质适当地选择。
要注意，优选地用在4℃至40℃的温度的洗涤溶液将已经经历核酸组分降解过程的生物组织进行洗涤。
在用包含液化气体的液体洗涤已经经历核酸组分降解过程的生物组织的情形中，例如为了维持液化气体的液体状态，所述洗涤过程优选地例如在气密性提取槽中在至少的饱和蒸气压下的环境中实施。
要注意，用洗涤溶液洗涤已经经历核酸组分降解过程的生物组织的过程的处理时间没有特别限制，只要在对于充分地除去在步骤S2中使用的酶和在步骤S1中暴露到所述细胞的外部的细胞组分足够的时长上进行洗涤。
要注意，在一些实施方式中，当用洗涤溶液洗涤已经经历核酸组分降解过程的生物组织时，例如，可更换洗涤溶液并可重复地进行洗涤过程。
通过实施根据本实施方式的用于制造脱细胞化的组织的方法，可获得基本上免受损伤并具有小于50ng/mg的以干重计的量的DNA的脱细胞化的组织。当脱细胞化的组织的DNA以干重计的量小于50ng/mg时，可防止当将所述脱细胞化的组织移植到活体中时的免疫反应。
(脱细胞化预处理设备)
在本实施方式中使用的脱细胞化预处理设备没有特别限制，只要它能够使用包含液化气体的液体将生物组织的细胞裂解。
在下文中，将描述其中使用液化二甲醚作为包含液化气体的液体的实例性情形。
脱细胞化预处理设备通过使生物组织与液化二甲醚接触可将生物组织的细胞裂解，所述液化二甲醚例如通过在提取槽中将二甲醚加压到至少其饱和蒸气压而产生。而且，脱细胞化预处理设备通过将压力降至小于饱和蒸气压可使液化二甲醚气化以从已经经历细胞裂解过程的生物组织除去液化二甲醚。
具体而言，脱细胞化预处理设备包括用于将液化二甲醚从储存手段(g)输送到接触手段(b)的液体输送手段(a)、用于使生物组织与液化二甲醚接触的接触手段(b)、和用于将已经与生物组织接触的液化二甲醚从接触手段(b)导出的导出手段(c)。而且，脱细胞化预处理设备包括分离手段(d)和通过调节温度和压力使二甲醚凝结的凝结手段(e)，所述分离手段(d)可为用于通过调节温度和压力使二甲醚分离的分离槽或用于通过膜分离使二甲醚分离的膜式分离槽。进一步地，脱细胞化预处理设备包括用于通过调节温度和压力使液化二甲醚气化的气化手段(f)、用于储存液化二甲醚的储存手段(g)、用于供给(补给)液化二甲醚的供给手段(h)、和用于检测温度和压力的检测手段(i)。
尽管液体输送手段(a)只要它能够调节液化二甲醚的流量即可而不受限于特定的构造(配置)，但是可使用例如输液泵或热驱动机构。
在下文中，将描述适于实施步骤S1的过程的脱细胞化预处理设备。
图3说明根据本发明一种实施方式的脱细胞化预处理设备100的一种实例性构造。
要注意，图3只是便于理解根据本实施方式的脱细胞化预处理设备的构成元件的整体形状、尺寸和排列的示意性说明。本发明无论如何不受限于以下描述，并且在本发明的范围内可适宜地改造或改变脱细胞化预处理设备的构成元件。
脱细胞化预处理设备100包括用于储存液化二甲醚2的储存槽1、用于使生物组织7与液化二甲醚2接触的提取槽6、用于分离从提取槽6导出的液体的分离槽11、和用于将液化二甲醚2从储存槽1输送到提取槽6的泵3。而且，脱细胞化预处理设备100包括用于导出或引入(液化)二甲醚的导管5、10、12、14、16、19和20以及用于调节各槽中的空气压力并控制(液化)二甲醚的导出和引入的阀4、9、13、15、18和21。为了维持液化二甲醚的液体状态，可调节在提取槽6和分离槽11内的压力。
在脱细胞化预处理设备100中，用于将液化二甲醚2从储存槽1引入到提取槽6的泵3、阀4和导管5充当液体输送手段(a)。提取槽6充当接触手段(b)。用于将液化二甲醚2从提取槽6导出的导管10和阀9充当导出手段(c)。此外，分离槽11充当分离手段(d)。凝结器17充当凝结手段(e)。连接至分离槽11的导管12和阀13充当气化手段(f)。储存槽1充当储存手段(g)。导管19和20充当供给手段(h)。
脱细胞化预处理设备100可包括另外的构成元件，例如用于检测各槽中的温度和压力的温度计和压力计、用于搅拌各槽的内容物的搅拌器、和用于使惰性气体(例如氮气)循环以例如将活性气体(例如氧气)泵送在槽和导管内的装置。
在下文中，将描述使用脱细胞化预处理设备100实施步骤S1的过程的方法。
首先，将生物组织7引入到具有在其上游侧和下游侧处布置的过滤器8的提取槽6中。此时，将阀4、9、13、15、18、21、22关闭。要注意，当在储存槽1中未储存足量的液化二甲醚2时，开启阀21并将液化二甲醚2经由导管20供给到储存槽1，其后将阀21关闭。此时，可将阀18与阀21一起开启和关闭。要注意，液化二甲醚通过将二甲醚加压到至少其饱和蒸气压而产生(参见图2)。
然后，开启阀4，并将储存槽1中的液化二甲醚2通过泵3取出(抽取)、经由导管5引入到提取槽6中、和使其与生物组织7接触，其后将阀4关闭。结果，将作为生物组织7的细胞膜的主要组分的磷脂溶解，并且使生物组织的细胞7裂解。
然后，开启阀4和9，并且将液化二甲醚通过泵3从提取槽6取出并经由导管10引入到分离槽11中。结果，将提取槽6中的具有溶解在其中的磷脂的液化二甲醚经由导管10引入到分离槽11中。此时，因为过滤器8布置在提取槽6的上游侧和下游侧处，已经经历细胞裂解的生物组织7残留在提取槽6中。
控制开启阀4和9的时机，使得从将液化二甲醚引入到提取槽6中的时刻起经过预定的时长以使得液化二甲醚能够与生物组织7接触。要注意，在液化二甲醚与生物组织7接触的同时，例如可将液化二甲醚和生物组织7静置预定的时长、或可对它们进行搅拌。
然后，关闭阀4，开启阀9、13和22，并将压力降至小于二甲醚的饱和蒸气压使得在阀4和阀13之间存在的液化二甲醚气化并经由导管14从导管23排出。要注意，为了排出二甲醚，例如可按需使用泵。结果，已经经历细胞裂解的生物组织7残留在提取槽6中，并且磷脂残留在分离槽11中。
要注意，当阀22关闭且阀15开启时，气化的二甲醚经由导管16引入到凝结器17中。结果，可再利用通过二甲醚的凝结而产生的液化二甲醚。
尽管以上已经描述了其中将储存槽1中的液化二甲醚2不连续地取出的实例性情形，但是在其它实例中，可将储存槽1中的液化二甲醚2连续地取出。
具体地，可开启阀4和9，使得可将储存槽1中的液化二甲醚2从导管5连续地引入到提取槽6中，并且可将提取槽6中的具有溶解在其中的磷脂的液化二甲醚从提取槽6连续地取出到导管10。在该情形中，提取槽6的内部结构优选地构造成使得液化二甲醚与生物组织7接触。
而且，要注意，在一些实施方式中，脱细胞化预处理设备可构造成：为了使二甲醚液化(或使液化二甲醚气化)，调节所述温度而非压力。
(核酸组分降解设备)
在本实施方式中使用的核酸组分降解设备没有特别限制，只要它能够使用溶核酶将通过脱细胞化预处理设备裂解的细胞中包含的核酸组分降解。例如，可使用已知的搅动器。
要注意，在一些实施方式中，核酸组分降解设备可包括在脱细胞化预处理设备中。在该情形中，例如，在将生物组织7与液化二甲醚在提取槽6中接触的同时，使用例如已知方法可将包含溶核酶的溶液引入到提取槽6中。
(洗涤设备)
在本实施方式中使用的洗涤设备没有特别限制，只要它能够洗涤已经经历通过核酸组分降解设备的核酸组分降解过程的生物组织。例如，可使用已知的搅动器。
要注意，在其中将已经经历核酸组分降解的生物组织用液化二甲醚洗涤的情形中，可使用例如脱细胞化预处理设备100。
实施例
在下文中，将参照具体的工作实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不受限于这些实施例。
[实施例1]
(步骤S1)
使用如图4中所示的脱细胞化预处理设备，将作为生物组织的实例的猪主动脉57的细胞裂解。
具体地，将切割成厚度约3cm的切片的猪主动脉57放置在具有在其上游侧和下游侧处布置的过滤器55的提取槽56中。然后，将60mL二甲醚52填充到储存槽51中、加压到0.8MPa、和使其液化。此时，将恒温槽50的温度设定到37℃。预先将二甲醚放置在分离槽61中，并且关闭阀53、54、58、59和60。然后，开启阀53、54、58、59以致使液化二甲醚流动。当提取槽56填充有液化二甲醚时，关闭阀54、58，并且猪主动脉57浸渍在液化二甲醚中。然后，开启阀54和58，通过阀59将液化二甲醚的流量调节到10mL/分钟，并在分离槽61中收集具有溶解在其中的磷脂的液化二甲醚。之后，关闭阀59，将分离槽61从所述设备移除，并使液化二甲醚在通风橱中在大气压下挥发。
通过将以上操作重复进行10次，使猪主动脉57与600mL液化二甲醚接触。之后，关闭阀54，开启阀58、59和60，使提取槽56中的压力恢复至大气压，并且使提取槽56中的液化二甲醚挥发和排出。然后，除去已经经历细胞裂解的生物组织。
(步骤S2)
将步骤S1的已经经历细胞裂解过程的生物组织放置在包含0.2mg/mL脱氧核糖核酸酶I(由Roche Diagnostics制造)和0.05M的MgCl2(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)的生理盐水溶液中并且在4℃的气氛(环境)中进行搅动7天以降解DNA。
(步骤S3)
将已经经历步骤S2的DNA降解过程的生物组织放置在包含80体积％乙醇的生理盐水溶液中并且在4℃的气氛中进行搅动3天。然后，将生物组织放置在生理盐水溶液中并且在4℃的气氛中进行搅动1天以获得脱细胞化的组织。
将所获得的脱细胞化的组织储存在4℃的生理盐水溶液中。
[实施例2和3]
在实施例2和3中，除了如下之外以和实施例1相同的方式获得脱细胞化的组织：在步骤S2中，经历细胞裂解的生物组织的搅动在4℃的气氛中分别进行5天和3天。
将所获得的脱细胞化的组织储存在4℃的生理盐水溶液中。
[实施例4]
在实施例4中，除了如下之外以和实施例1相同的方式获得脱细胞化的组织：在步骤S1中，使用57mL二甲醚和3mL水代替60mL二甲醚。
将所获得的脱细胞化的组织储存在4℃的生理盐水溶液中。
图5-8为实施例1-3中获得的脱细胞化的组织和作为未处理的生物组织的猪主动脉57的苏木精-曙红染色的(HE染色的)样品的图像。
从图5-8可认识到，实施例1-3的脱细胞化的组织基本上免受损伤并且不具有核(核酸，nucleus)，其存在于未处理的生物组织中。
表1列出实施例1-4的脱细胞化的组织和未处理的生物组织中DNA的以干重计的量和DNA长度。
[表1]
要注意，使用PureLink Genomic DNA Kits(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)从脱细胞化的组织或未处理的生物组织提取DNA。而且，DNA的量通过使用超痕量分光光度计Nano Drop 2000c(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)的紫外吸光度测量而测定。此外，通过电泳测定DNA长度。
从表1可认识到，实施例1-4的脱细胞化的组织满足如非专利文献1中记载的DNA的以干重计的量小于50ng/mg的标准。而且，在实施例1的脱细胞化的组织中，DNA长度小于100bp。
尽管以上参考某些说明性实施方式和实施例已经描述了本发明，但是本发明不受限于这些实施方式和实施例，并且可进行大量改变和改型而不偏离本发明的范围。
本申请基于在2017年5月11日向日本专利局提交的日本专利申请No.2017-095004并要求其优先权日的权益，该日本专利申请的全部内容特此并入作为参考。
[符号列表]
1 储存槽
2 液化二甲醚
3 泵
4、9、13、15、18、21、22 阀
5、10、12、14、16、19、20、23 导管
6 提取槽
7 生物组织
8 过滤器
11 分离槽
17 凝结器
100 脱细胞化预处理设备
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于制造脱细胞化的组织的方法，所述方法包括：
使用包含液化气体的液体将生物组织的细胞裂解；和
使用溶核酶将所述生物组织的裂解的细胞中包含的核酸组分降解。
2.根据权利要求1所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中所述液体进一步包含溶剂。
3.根据权利要求2所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中所述溶剂为水和乙醇的至少一种。
4.根据权利要求1所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中
所述液化气体在范围为1℃至40℃的温度下。
5.根据权利要求1所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中
所述液化气体在范围为0.2MPa至5MPa的压力下。
6.根据权利要求1所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其进一步包括：
洗涤具有降解的核酸组分的所述生物组织。
7.根据权利要求6所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中
将具有降解的核酸组分的所述生物组织用水、生理盐水溶液、乙醇水溶液和所述包含液化气体的液体的至少一种洗涤。
8.根据权利要求7所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中
将具有降解的核酸组分的所述生物组织用乙醇水溶液或所述包含液化气体的液体洗涤并且然后用水或生理盐水溶液洗涤。
9.通过根据权利要求1-8任一项所述的方法制造的脱细胞化的组织，所述脱细胞化的组织包含小于50ng/mg的以干重计的量的DNA。
10.用于制造脱细胞化的组织的设备，所述设备包括：
裂解手段，用于使用包含二甲醚的液体将生物组织的细胞裂解；和
降解手段，用于使用溶核酶将所述生物组织的裂解的细胞中包含的核酸组分降解。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
以下所附内容是根据PCT条约第19条修改的内容
国际局收到于2018年8月27日寄出的有关权利要求书修改。
以新的权利要求1-10项替换原始权利要求1-10项。
19(1)条申明
在答复上述申请2018年7月4日的国际检索报告(ISR)中，申请人特此提供以下申明说明随文件提交的在PCT条约19下的修改。
权利要求9已经修改且与权利要求1-8相关，其在ISR中已认为具有新颖性和创造性。权利要求10已经修改以叙述用“包含二甲醚的液体”代替“包含液化气体的液体”。修改后的权利要求10具有新颖性和创造性，因为所引用的文献D1和D2完全没有提及以上修改特征，如下面详细说明的。
根据权利要求10的发明，使用包含液化二甲醚的液体作为脱细胞化溶液用于生物组织的细胞裂解以制造脱细胞化的组织。另一方面，D1(WO 2010/091188)在第20页公开使用高渗溶液如高渗氯化钠溶液、洗涤剂如CHAPS、螯合剂如EDTA、或者酶如DNAse作为脱细胞化溶液。文献2(US 2012/051970)公开使用二氧化碳超临界流体作为脱细胞化溶液。然而，上述文献D1和D2既没有教导也没有暗示使用液化的二甲醚作为脱细胞化溶液。
如原提交的本申请[0020]段所述的，因为二甲醚可在约1℃至40℃和约0.2MPa至5MPa下液化，所以可使用成本相对低的设备用于制造脱细胞化的组织的生产设备。而且，因为液化二甲醚在标准温度和标准压力下容易蒸发，所以其不太可能残留在脱细胞化的组织中。另一方面，如D2的[0048]段所述的，液化二氧化碳必须在约1000至约3500psi(即，7-24MPa)的压力下，其显著高于液化二甲醚的压力。因此，本发明的上述有利效果无法通过这些引用文献的教导获得。

Claims (10)

1.用于制造脱细胞化的组织的方法，所述方法包括：
使用包含液化气体的液体将生物组织的细胞裂解；和
使用溶核酶将所述生物组织的裂解的细胞中包含的核酸组分降解。
2.根据权利要求1所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中所述液体进一步包含溶剂。
3.根据权利要求2所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中所述溶剂为水和乙醇的至少一种。
4.根据权利要求1所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中
所述液化气体在范围为1℃至40℃的温度下。
5.根据权利要求1所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中
所述液化气体在范围为0.2MPa至5MPa的压力下。
6.根据权利要求1所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其进一步包括：
洗涤具有降解的核酸组分的所述生物组织。
7.根据权利要求6所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中
将具有降解的核酸组分的所述生物组织用水、生理盐水溶液、乙醇水溶液和所述包含液化气体的液体的至少一种洗涤。
8.根据权利要求7所述的用于制造脱细胞化的组织的方法，其中
将具有降解的核酸组分的所述生物组织用乙醇水溶液或所述包含液化气体的液体洗涤并且然后用水或生理盐水溶液洗涤。
9.脱细胞化的组织，其包含小于50ng/mg的以干重计的量的DNA。
10.用于制造脱细胞化的组织的设备，所述设备包括：
裂解手段，用于使用包含液化气体的液体将生物组织的细胞裂解；和
降解手段，用于使用溶核酶将所述生物组织的裂解的细胞中包含的核酸组分降解。
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