CN103667455A - 器官基因的组蛋白h3k9三甲基化表达差异的分析方法与基因模型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种器官基因的组蛋白H3K9三甲基化表达差异的分析方法与基因模型，分析方法包括以下步骤：提取冷冻保存的标本的组织样本，研磨匀浆并用质量百分数为1%的甲醛处理，裂解细胞得到全细胞裂解液；在全细胞裂解液加入三甲基化组蛋白H3K9的抗体和磁珠，在4℃进行孵育，提取DNA；构建DNA文库，进行染色质免疫沉淀测序分析，对有效数据进行产量统计，并与目的物种基因组序列进行比对，根据转录因子结合位点和组蛋白修饰富集区域，获取峰值相关基因；对所述峰值相关基因按照基因功能进行聚类分析，并选取组蛋白H3K9三甲基化表达差异显著的至少一基因。

Description

器官基因的组蛋白H3K9三甲基化表达差异的分析方法与基因模型

【技术领域】

本发明涉及组蛋白甲基化，尤其涉及一种器官基因的组蛋白H3K9三甲基化表达差异的分析方法与基因模型。

【背景技术】

在哺乳动物基因组中，组蛋白可以有很多修饰形式，包括组蛋白末端的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、ADP（二磷酸腺苷）核糖基化等等，这些修饰都会影响基因的转录活性。组蛋白修饰最重要的表观遗传机制是控制基因表达，因此其与细胞的增殖、发育和生存息息相关。对于组蛋白H3（组蛋白H3的第9位赖氨酸残基）在不同的组织和生物中已广泛研究并证实组蛋白H3K9三甲基化（H3K9me3）与异染色质形成，基因的表达和转录伸长率具有关联性。

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达和调控的可遗传变化的过程和机制。与遗传多态性不同，会发生非遗传部分和可逆的DNA修饰。

甲基化发生在位于氨基末端的组蛋白尾部的五个主要的赖氨酸残基（H3K4,H3K9,H3K27,H3K36,H4K20），以及一个球状蛋白结构域（H3K79）内的赖氨酸残基，这些赖氨酸可发生单甲基化、二甲基化和三甲基化。在各种不同的组蛋白赖氨酸甲基化模式中，由于H3K9的甲基化和抑制的染色质相关而备受关注。H3K9三甲基化（H3K9me3）是翻译后修饰，并且与异染色质的形成和转录抑制相关联，也是基因转录沉默的标志，具有重要的研究价值。

高通量技术具有高效的特点，其可用来分析基因组中大量的基因表达情况同时研究病理过程中复杂的分子机理。ChIP-seq（ChromatinImmunoprecipitation–sequencing，染色质免疫沉淀-测序）是染色质免疫共沉淀后并结合高通量测序的方法，它能够在全基因组中识别转录因子（TFs）和DNA结合蛋白的结合位点。随着高通量测序平台如Illumina公司的基因组分析以及SOLiD（使用连接法测序的一种高通量测序仪，Sequencing byOligonucleotide Ligation and Detection）和芯片级别的抗体出现，ChIP-seq已成为用于确定基因组中的功能元件的最广泛使用的方法。与常用的ChIP-chip（Chromatin Immunoprecipitation-chip，染色质免疫共沉淀-芯片）相比，ChIP-seq具有更高的信噪比，更便宜以及更少量的样本的优势。

目前，只有极少数研究比较分析哺乳动物或人体组织的H3K9me3。

【发明内容】

有鉴于此，有必要提出一种新的器官基因的组蛋白H3K9三甲基化表达差异的分析方法与基因模型。

本发明的一个技术方案是，器官基因的组蛋白H3K9三甲基化表达差异的分析方法，其包括以下步骤：提取冷冻保存的标本的组织样本，研磨匀浆并用质量百分数为1%的甲醛处理，裂解细胞得到全细胞裂解液；在全细胞裂解液加入三甲基化组蛋白H3K9的抗体和磁珠，在4℃进行孵育，提取DNA；构建DNA文库，进行染色质免疫沉淀测序分析，对有效数据进行产量统计，并与目的物种基因组序列进行比对，根据转录因子结合位点和组蛋白修饰富集区域，获取峰值相关基因；对所述峰值相关基因按照基因功能进行聚类分析，并选取组蛋白H3K9三甲基化表达差异显著的至少一基因。

优选的，所述分析方法中，所述标本为心脏和/或脾脏。

优选的，所述分析方法中，所述提取DNA后还进行纯化，然后再构建DNA文库。

优选的，所述分析方法中，所述纯化采用快速PCR纯化试剂盒进行，纯化之后还采用实时定量基因扩增荧光检测系统进行验证。

优选的，所述分析方法中，所述比对中，允许不超过2个碱基的错配。

优选的，所述分析方法中，所述构建DNA文库中，对DNA片段末端修复，3′端加A碱基，连接测序接头，PCR扩增及选择DNA产物的片段大小，用于上机测序。

优选的，所述分析方法中，选择DNA产物的片段大小中，包括接头序列在内的片段大小为100-300bp。

优选的，所述分析方法中，所述有效数据为去除接头和低质量读取后的下机数据，其中低质量读取为每条读取中碱基质量值≦20个数大于等于50%，或者N碱基个数大于等于10%。

优选的，所述分析方法中，所述低质量读取为每条读取中碱基质量值≦18个数大于等于60%，或者N碱基个数大于等于15%。

本发明的又一技术方案是，一种基因模型，其包括采用上述任一分析方法所获得的组蛋白H3K9三甲基化表达差异显著的若干基因。

上述方案，通过分析器官H3K9三甲基化表达差异，从而确定出候选基因，这些基因与免疫，细胞信号转导，蛋白质转录和合成渠道和运输和细胞外基质等相关，能够作为中间结果的有效信息，为下一步的分析工作提供良好的信息支持和辅助数据；并且，H3K9me3具有作为一个潜在的生物标志物或表观遗传疾病治疗靶点的意义。

【附图说明】

图1是一个实施例心脏的峰值在若干基因功能元件上的分布特征图；

图2是一个实施例脾脏的峰值在若干基因功能元件上的分布特征图；

图3是一个实施例的各样本间所共同包含的基因和各自具有的特有的基因示意图；

图4是心脏的基因相关各位点所占的比例示意图；

图5是脾脏的基因相关各位点所占的比例示意图；

图6是两个样本中所共同包含的峰值区域富集度示意图；

图7是一个实施例的流程示意图。

【具体实施方式】

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述。

本发明通过采用ChIP-seq的技术，比较分析人体器官心脏和脾脏之间在全基因组中H3K9me3的变化及差异情况，以便更好地认识组织间的表观遗传差异，建立基因模型，作为下一步分析的基础，并通过数据分析，全面的描述了组织特异性表达，功能及发展情况。

如图7所示，本发明的一个实施例是，器官基因的组蛋白H3K9三甲基化表达差异的分析方法，其包括以下步骤：提取冷冻保存的标本的组织样本，研磨匀浆并用质量百分数为1%的甲醛处理，裂解细胞得到全细胞裂解液；在全细胞裂解液加入三甲基化组蛋白H3K9的抗体和磁珠（Beads），在4℃进行孵育，提取DNA；孵育时间不作限制，只需能够完成孵育，最后实现DNA提取机壳。然后构建DNA文库，进行染色质免疫沉淀测序分析，对有效数据进行产量统计，并与目的物种基因组序列进行比对，根据转录因子结合位点和组蛋白修饰富集区域，获取峰值相关基因；对所述峰值相关基因按照基因功能进行聚类分析，并选取组蛋白H3K9三甲基化表达差异显著的至少一基因。优选的，所述提取DNA后还进行纯化，然后再构建所述DNA文库。优选的，所述纯化采用快速PCR纯化试剂盒进行，纯化之后还采用实时定量基因扩增荧光检测系统进行验证。

优选的，所述分析方法中，所述标本为心脏或脾脏。关于下面相关实施例涉及样本的合法性说明如下：实验采用两组标本，包括两个心脏和两个脾脏，均来自中国广西桂林第一八一医院脑死亡患者自愿捐赠的器官。标本放置于-80℃保存。标本收集的方案与执行均获得广西代谢性疾病重点实验室和第一八一医院伦理委员会的批准。器官捐赠者均签署了知情同意书。

优选的，所述分析方法中，所述比对中，允许不超过2个碱基的错配。优选的，所述分析方法中，所述构建DNA文库中，对DNA片段末端修复，3′端加A碱基，连接测序接头，PCR扩增及选择DNA产物的片段大小，用于上机测序。优选的，所述分析方法中，选择DNA产物的片段大小中，包括接头序列在内的片段大小为100-300bp。

优选的，所述分析方法中，所述有效数据为去除接头和低质量读取后的下机数据，其中低质量读取为每条读取中碱基质量值20的个数大于等于50%，或者N碱基个数大于等于10%。优选的，所述分析方法中，所述低质量读取为每条读取中碱基质量值18的个数大于等于60%，或者N碱基个数大于等于15%。

例如，采用染色质免疫共沉淀方式，准备ChIP Sequencing建库。

首先，提取标本的组织样本，例如，从冰冻状态拿到0至4℃，注意不要拿到常温，待组织解冻后，参照BGI公布的程序进行ChIP-seq实验方案。简单的说，将组织样本先研磨匀浆并用质量百分数为1%的甲醛处理细胞，使DNA-protein的相互结合作用被交联固定，然后裂解细胞，得到全细胞裂解液，通过超声处理，将基因组DNA打断至100-500bp碎片，在细胞裂解液中加入特定的实验所需的三甲基化赖氨酸9的抗体和beads，并进行4℃孵育。采用合适的实验条件进行洗脱，并解交联，经过交联反转和蛋白酶K处理后，DNA被沉淀提取出，在构建DNA文库前，先用QIA快速PCR纯化试剂盒将DNA进一步纯化。通过qPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System，实时定量基因扩增荧光检测系统）对ChIP结果进行验证，准备好的ChIP后的DNA样品可以用于ChIP Sequencing建库。

ChIP Sequencing文库构建流程说明如下：先对DNA片段末端进行修复，3′端加A碱基，连接测序接头，详细步骤可参考Illumina公司Paired-EndDNA Sample Prep kit。然后进行PCR扩增及DNA产物的片段大小选择，优选为100-300bp，包括接头序列在内，合格的文库用于上机测序。优选的，DNA产物的片段大小为120至270bp。

然后进行ChIP-seq分析。

ChIP DNA末端修复，接头连接以及扩增等均按之前的进行。从琼脂糖凝胶中分离出大小约为49bp的片段，用Solexa/Illumina2G基因分析仪分析测序。与目的物种基因组序列进行比对，其中参考基因组版本为Hg19，比对软件为SOAP2.21。比对过程中，允许不超过2个碱基的错配，优选的，仅允许1个碱基的错配；其中比对到基因组上唯一位置的reads（唯一比对reads）将用于后续的信息分析。ChIP Sequencing reads在全基因组的分布包括唯一比对Reads在Repeats区域的分布；唯一比对Reads在各基因功能元件上的分布；唯一比对Reads的全基因组覆盖深度。而全基因组Peak扫描，采用软件MACS1.4.0，将基因组上的候选peak区延伸，得到一定长度的建模区域，根据此区域中所有唯一比对reads的情况，使用Poisson分布模型进行检验，计算候选peak区域的p-value,若p-value<1.00e-05，则认为该区域是一个peak。MACS的目的是从ChIP-seq的数据集中找出转录因子结合位点和组蛋白修饰富集区域，而且不需要正常对照。

Peak相关基因的GO分析，GO是一种整合性、统一化、动态开放实时更新的分类系统。其包括三大独立的本体（Ontology）：基因参与的生命过程（biological process），所处的细胞组份和元件(cellular component）及发挥的分子生物学功能（molecular function）。这三个ontology下面又可以独立出不同的亚层次，层层向下构成一个ontologies的树型分支结构。通过GO功能富集分析，可以知道peak相关基因涉及到哪些生物学功能的改变。通过GO功能分析可以将Peak相关基因按照基因功能进行聚类分析。

数据处理与产出情况统计情况如下：测序完成后，对原始数据进行去污染，去接头及去除低质量数据处理，统计clean data（有效数据）产量，具体如下表1所示。

样本名称	Read长度（bp）	Read总数（条）	产量（bp）
				Heart-H3K9me3	49	12943074	634210626
Spleen-H3K9me3	49	12952347	634665003

表1：clean data产量统计

其中，clean data（有效数据）为去除接头和低质量的reads（读取）后的下机数据，其中低质量reads定义为每条read中碱基质量值≦20个数大于等于50%，或者碱基为“N”的个数大于等于10%。对于clean data的严格限制，有利于获得可靠的有效数据。

然后将ChIP Sequencing结果与参考基因组序列进行比对。将clean data与目的物种基因组序列进行比对，允许不超过2个碱基的错配，其中比对到基因组上唯一位置的reads（唯一比对reads）将用于后续的信息分析，比对结果如下表2所示。

比对软件:SOAP2.21

参考基因组版本:Hg19

表2：序列比对结果统计

说明：比对reads数：能够比对到参考基因组的reads数目；

唯一比对reads数：能比对到参考基因组唯一位置的reads数目；

比对率：比对reads数与总reads的比值；

唯一比对率：唯一比对reads数与总reads数的比值。

再进行全基因组Peak扫描，基于一定的分析模型在全基因范围进行peak（ChIP Sequencing富集区域）扫描，得到Peak在基因组上的位置信息、peak区域序列信息等，如图1所示。Peak信息统计如下表3所示。

表3：Peak信息统计

Peak在基因功能元件上的分布特征如图1、图2所示。

最后通过GO分析peaks与注释基因的关联。GO是一种整合性、统一化、动态开放实时更新的分类系统。它包括三大独立的本体（Ontology）：基因参与的生命过程（biological process），所处的细胞组份和元件（cellularcomponent）及发挥的分子生物学功能（molecular function）。这三个ontology下面又可以独立出不同的亚层次，层层向下构成一个ontologies的树型分支结构。通过GO功能富集分析，可以知道peak相关基因涉及到哪些生物学功能的改变。通过GO功能分析，可以将peak相关基因按照基因功能进行聚类分析。

心脏器官组织中的104个注释基因中，37个基因与细胞组分和元件相关，37个基因发挥着分子生物学功能，30个基因参与生命过程。脾脏器官组织中的137个注释基因中，52个基因与细胞组分和元件相关，45个基因发挥着分子生物学功能，40个基因参与生命过程。

从细胞的组分来看，心脏中，亚细胞定位的注释基因中34个作为细胞部分，19个作为细胞器；脾脏中，亚细胞定位的注释基因中46个作为细胞部分，21个作为细胞器。

从分子生物学功能来看，心脏中，具有链接和催化活性的基因分别为33个和17个，而脾脏中，具有链接和催化活性的基因分别为36个和16个。心脏和脾脏中具有酶活性调节的基因分别为8.1%和8.9%。

从参与生命过程来看，心脏中，27个基因参与了细胞过程，20个基因参与了生物的调节过程，而脾脏中，36个基因参与了细胞过程，25个基因参与了生物的调节过程。

心脏和脾脏中H3K9me3的比较结果说明如下。

经过对比分析心脏和脾脏组织样本，可以得出样本间所共同包含的基因和各自具有的特有的基因，请参考图3。样品特有的基因，以其受peak影响的位点总数为基数，计算基因相关各位点所占的比例，如图4、图5所示。经过方差分析统计GO功能聚类，通过热图比较两个样本中所共同包含的峰值区域富集度，如图6所示。

通过以上对测序结果的分析，得出心脏和脾脏间169个基因表现了显著地H3K9me3差异，如图3所示，其中64个基因是心脏中的表现H3K9me3的特有基因，87个基因是脾脏中的表现H3K9me3的特有基因，18个基因是两个样本所共同包含的基因。

从这些基因中，挑选出8个表现H3K9me3明显的基因，然后再从这8个基因中挑选出两个心脏和脾脏间表现H3K9me3差异最明显的基因，分别是PTPN3和RBMS3。

本发明的又一实施例是，一种基因模型，其包括采用上述任一分析方法所获得的组蛋白H3K9三甲基化表达差异显著的若干基因。例如，所述基因模型包括心脏中的表现H3K9me3的64个特有基因，作为心脏H3K9me3基因模型。又如，所述基因模型包括脾脏中的表现H3K9me3的87个特有基因，作为脾脏H3K9me3基因模型。

又如，所述基因模型包括心脏和脾脏共有的表现H3K9me3的18个基因，作为心脏和脾脏共同的H3K9me3基因模型。又如，所述基因模型包括心脏中的表现H3K9me3的64+18=82个特有基因，作为心脏全部H3K9me3基因模型。又如，所述基因模型包括脾脏中的表现H3K9me3的87+18=105个特有基因，作为脾脏全部H3K9me3基因模型。以此类推。

又如，所述基因模型包括上述8个表现H3K9me3明显的基因；优选的，所述基因模型仅包括PTPN3和RBMS3。上述各模型主要分析心脏和脾脏间的H3K9三甲基化表达差异。从而确定出候选基因，这些基因与免疫，细胞信号转导，蛋白质转录和合成渠道和运输和细胞外基质等相关。

组蛋白末端的修饰被认为是调节基因表达的特定的一个指标。H3K9三甲基化（H3K9me3）是一个高度保守的组蛋白翻译后修饰，通常与异染色质形成和转录抑制相关联。H3K9甲基化最初是作为研究表观遗传沉默和着丝粒异构性的标记物。要覆盖这些区域并且对其进行研究，本发明使用ChIP-seq芯片，从而识别基因组范围内的转录因子和其它DNA结合蛋白的结合位点。对H3K9me3近期研究来看，在人体器官组织中，H3K9me3与表观遗传修饰的相互关系以及它所具有的潜在功能意义都少有研究。在这些基础上，通过选择H3K9me3作为研究目标，用ChIP-seq分析，可见心脏和脾脏间的H3K9me3存在显著差异性。

在这些候选基因中，PTPN3和RBMS3基因是心脏和脾脏间表现H3K9me3差异最明显的基因。蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型3（PTPN3），由该基因编码的蛋白质是蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族的一员。PTPs是已知的调节多种细胞过程，包括细胞生长，分化，细胞周期，致癌性转化的信号分子。此蛋白含有的C-末端PTP结构域和N-末端结构域，并且同源于条带4.1的细胞骨架相关的超家族蛋白质。该PTP的基板P97是具有调节细胞周期并涉及各种膜的相关功能。此PTP也被发现与接头蛋白β14-3-3相关并被其所调节。

例如，应用新一代测序技术分析非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系H2228的转录水平，发现了一个由多个外显子组成的融合转录子间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶（ALK）和PTPN3。基因组结构的详细分析表明，ALK的部分基因区域的外显子10和11易位到了PTPN3的外显子2和3之间。结果表明PTPN3的一个等位基因的无效突变使其具有肿瘤抑制活性。

RNA结合模体，单链相互作用蛋白3（RBMS3），此基因编码一种属于的c-myc基因的单链结合蛋白家族的RNA结合蛋白。这些蛋白质其特征是含有两套包含着保守模体RNP1和RNP2的核蛋白序列。这些蛋白质最初被发现在RNA结合蛋白中，作用于DNA结合过程中，并且与DNA复制，基因转录，细胞周期进程和细胞凋亡等多样化的功能相关联。此编码蛋白结合着α2（I）胶原蛋白启动子的上游元件。通过对该蛋白主要定位在细胞质中的观察表明，它可能涉及细胞质的功能，如控制RNA的代谢，而不是转录。例如，用表达和抑制系统的功能研究表明，RBMS3在NPC具有很强的抑癌作用。其抑癌机制在于它具有通过上调p53和p21，下调细胞周期蛋白E和CDK2，以及抑制Rb-ser780来阻滞细胞周期G1/S期的检查点的作用。进一步的分析表明，RBMS3通过激活胱天蛋白酶9和PARP的线粒体依赖性使其具有促进细胞凋亡的作用。RBMS3还能抑制微血管的形成，这可能是通过下调MMP2和β-catenin和灭活其下游的目标，包括细胞周期蛋白D1，c-Myc基因，MMP7和MMP9来实现的。

综上所述，本发明以心脏和脾脏为例，分析其中H3K9me3差异的状态，并且通过关键基因和组蛋白甲基化对于人体器官之间的关联获得了新的基因模型。也证明了下一代测序用于研究DNA甲基化具有很好的实用性，并且具有疾病的鉴别诊断，预后和治疗的重要性。这些新的研究结果表明H3K9me3具有作为一个潜在的生物标志物或表观遗传疾病治疗靶点的意义。

进一步地，本发明的实施例还包括，上述各实施例的各技术特征，相互组合形成的器官基因的组蛋白H3K9三甲基化表达差异的分析方法，以及采用这些分析方法得到的基因模型；这些分析方法所获得的基因，及其所组成的基因模型，在基因与免疫，细胞信号转导，蛋白质转录和合成渠道和运输和细胞外基质等相关领域具有一定的指导意义，能够作为中间结果的有效信息，为下一步的分析工作提供良好的信息支持和辅助数据。

需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的组织，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；并且，上面列出的各个技术特征，其相互组合所能够形成各个实施方案，应被视为属于本发明说明书记载的范围。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.器官基因的组蛋白H3K9三甲基化表达差异的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取冷冻保存的标本的组织样本，研磨匀浆并用质量百分数为1%的甲醛处理，裂解细胞得到全细胞裂解液；

在全细胞裂解液加入三甲基化组蛋白H3K9的抗体和磁珠，在4℃进行孵育，提取DNA；

构建DNA文库，进行染色质免疫沉淀测序分析，对有效数据进行产量统计，并与目的物种基因组序列进行比对，根据转录因子结合位点和组蛋白修饰富集区域，获取峰值相关基因；

对所述峰值相关基因按照基因功能进行聚类分析，并选取组蛋白H3K9三甲基化表达差异显著的至少一基因。

2.根据权利要求1所述分析方法，其特征在于，所述标本为心脏和/或脾脏。

3.根据权利要求2所述分析方法，其特征在于，所述提取DNA后还进行纯化，然后再构建DNA文库。

4.根据权利要求3所述分析方法，其特征在于，所述纯化采用快速PCR纯化试剂盒进行，纯化之后还采用实时定量基因扩增荧光检测系统进行验证。

5.根据权利要求4所述分析方法，其特征在于，所述比对中，允许不超过2个碱基的错配。

6.根据权利要求5所述分析方法，其特征在于，所述构建DNA文库中，对DNA片段末端修复，3′端加A碱基，连接测序接头，PCR扩增及选择DNA产物的片段大小，用于上机测序。

7.根据权利要求6所述分析方法，其特征在于，选择DNA产物的片段大小中，包括接头序列在内的片段大小为100-300bp。

8.根据权利要求7所述分析方法，其特征在于，所述有效数据为去除接头和低质量读取后的下机数据，其中低质量读取为每条读取中碱基质量值≦20个数大于等于50%，或者N碱基个数大于等于10%。

9.根据权利要求8所述分析方法，其特征在于，所述低质量读取为每条读取中碱基质量值≦18个数大于等于60%，或者N碱基个数大于等于15%。

10.一种基因模型，其特征在于，包括采用如权利要求1至9任一所述分析方法所获得的组蛋白H3K9三甲基化表达差异显著的若干基因。

Images