CN112011625B - 一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，使用猪组织样本通过ChIP‑seq方法富集与目的蛋白结合的DNA，再采用荧光定量QPCR方法进行定量检测，并对其结果进行判定，其中，定量检测结果的计算方法采用“ΔΔCt”法进行判断，对结果进行判定为，阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数≥2，视为富集效果达标，阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数<2，视为富集效果未达标；能够特异性的检测猪组蛋白修饰水平，并能够有效的判定DNA区域富集效果，从而为ChIP‑seq提供重要参考，大大节省了由于富集效果差造成测序结果差所带来的时间和经济成本，为开展猪的表观基因组学研究提供有效途径。
Description
技术领域
本发明涉及ChIP-seq技术领域，尤其涉及一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法。
背景技术
脂肪沉积和肌肉生长是猪的最重要的经济性状之一，其直接影响猪肉品质的优劣及其经济价值的高低。因此，通过遗传学研究猪脂肪和肌肉组织的遗传性状是一门十分重要的课题。
其中，表观遗传学研究是继遗传学后新兴发展起来的科学领域，是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因的可遗传表达。组蛋白修饰则是表观遗传调控一个重要的调控方式，它可通过甲基化、乙酰化修饰等方式来调控基因的表达。而H3K4ME3和H3K27ac是组蛋白修饰的重要表观遗传修饰，已经在酵母菌、果蝇、人细胞和小鼠细胞都有表达并参与调控基因的转录。但在猪脂肪沉积和肌肉生长的机制还很模糊。技术人员通过对不同组蛋白修饰在猪脂肪和肌肉组织变化进行研究，探索在猪不同组织中的表达模式，再以此为参照，来寻找特异性调控脂肪沉积和肌肉生长的基因，其应用在畜牧业上，可以促进猪的遗传改良，而在医学上能够更好的解释代谢综合征的发病机制，有助于寻求更有效的防治措施，服务于农业生产以及医学临床等实际应用提供参考。
目前，组蛋白修饰调控图谱研究中最重要的技术手段为染色质免疫共沉淀与二代测序技术结合起来的测序技术，即ChIP-Seq技术。这种技术首先利用特定组蛋白修饰抗体将此类组蛋白修饰结合的DNA区域富集，纯化建库后对此区域进行高通量测序。此技术被认为是全基因组范围内研究组蛋白修饰最好的方法。
但是，ChIP技术研究的主要材料集中在模式动物的细胞或组织样本，处理方法已经较为成熟，但在猪肌肉和脂肪组织的应用较少，特别是脂肪组织对前期处理要求高、破碎难度大、提取完整细胞核较困难、材料间的稳定性不是很好，这些因素制约着该项技术在猪组织中的应用。特别是ChIP-seq成本较高，如果不在之前做好有效质控，在大规模样本富集后通过测序结果看实验的成败将会带来很大的损失。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA，再采用荧光定量QPCR方法进行定量检测，并对其结果进行判定；
其中，定量检测结果的计算方法采用“ΔΔCt”法进行判断，其计算方法如下，
首先，进行实验样本免疫沉淀的标准化，其公式为，
ΔCt [normalized 样品沉淀] = Ct [样品沉淀] - (Ct [Input] - Log2 (Input Dilution Factor))，
Input Dilution Factor(IDF) = (fraction of the inputchromatin saved) -1；
然后，计算阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数，其公式为，
ΔΔCt [ChIP阳性引物/ ChIP阴性引物] = 阳性引物ΔCt [normalized 样品沉淀] - 阴性引物 ΔCt[normalized 样品沉淀]，
Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP阳性引物/ ChIP阴性引物])；
最后，对结果进行判定为，
阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数≥2，视为成功阳性沉淀富集，富集效果达标；
阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数<2，视为成功阴性沉淀富集，富集效果未达标。
在以上技术方案的基础上，优选的，使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA时，包括以下步骤，
S1对猪组织样本进行甲醛交联反应，然后进行甘氨酸冰上终止交联，再离心获得沉淀，并用PBS对沉淀进行清洗；
S2获得的组织细胞分别用细胞裂解液和核裂解液进行裂解以获取细胞核沉淀；
S3超声打断染色质以获得蛋白核酸复合物的小片段：
S4使用组蛋白修饰抗体与蛋白核酸复合物的小片段进行免疫共沉淀反应；
S5洗脱并纯化富集的与目的蛋白结合的DNA。
更进一步优选的，步骤S2中，细胞裂解液包括10mM HEPES、80mM KCl、1%(v/v)IGEPAL CA-630和蛋白酶抑制剂。
更进一步优选的，细胞裂解液的添加量为，每1g猪组织加入3mL细胞裂解液。
更进一步优选的，步骤S2中，核裂解液包括50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、1.5%(v/v) SDS和蛋白酶抑制剂。
更进一步优选的，步骤S3中，超声条件为每次超声30s，间隔30s，超声循环10次。
更进一步优选的，步骤S4包括如下步骤，
S41用ChIP dilution buffer洗protein G磁珠3次以活化磁珠，加入990μL ChIPdilution buffer和5μL的H3K4Me3或H3K27AC抗体，在4℃条件下，置于静音混匀器上过夜孵育；
S42用ChIP dilution buffer清洗磁珠3次，加入900μL ChIP dilution buffer和100μL染色质溶液，在4℃条件下，置于静音混匀器上孵育7-12h。
更进一步优选的，步骤S5包括如下步骤，
S51将反应后的磁珠装入离心管并置于磁力架上，弃去上清液后，依次加入Lowsalt wash buffer、High salt wash buffer、LiCl wash buffer和TE buffer进行洗涤；
S52弃去上清液，加入250μL Elution buffer后，在65℃条件下，以800rpm离心20min，置于磁力架上放置2min后，吸取上清移至新的离心管中；
S53重复步骤S52，在两次Elution buffer洗脱后，获得上清液共500μL；
S54加入20μL 5M NaCl后，在65℃条件下，以600rpm过夜解交联，取15μL Input加入500μL Elution buffer和20μL 5M NaCl同时解交联；
S55向解交联产物中加入10μL 0.5M EDTA、5μL RNase和20μL Tris-HCl (pH7.0)，置于恒温振荡仪上，在37℃条件下，以600rpm孵育30min，之后加入2μL蛋白酶K，在55℃条件下，以600rpm孵育1h，纯化解交联产物。
在以上技术方案的基础上，优选的，采用荧光定量QPCR方法进行定量检测时，荧光定量在ABI 7500仪器上进行，利用Takara试剂盒，反应体系20μL；
其中，包括1.5μL ChIP-DNA模板、10μL SYBR Premix ExTaq、0.4μL ROX和上下游引物各0.5μL，加入ddH2O补足至20μL；
扩增程序为，95℃预变性30sec；95℃变性10sec，退火延伸30sec，进行40个循环；95℃变性1min，退火温度+2℃30sec，95℃30sec，进行一个循环，收集信号。
另一方面，提供了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测引物，引物对选自序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2所示的阳性引物对和阴性引物对。
本发明的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法相对于现有技术具有以下有益效果：
本发明提供了一种检测方法，能够特异性的检测猪组织中的H3K4ME3及H3K27AC修饰水平，并能够有效的判定DNA区域富集效果，从而为ChIP-seq提供重要参考，大大节省了由于富集效果差造成测序结果差所带来的时间和经济成本，为开展猪的表观基因组学研究提供有效途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中猪脂肪组织H3K4ME3及H3K27AC富集后的定量检测结果；
图2为本发明实施例2中猪肌肉组织H3K4ME3及H3K27AC富集后的定量检测结果。
实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA，再采用荧光定量QPCR方法进行定量检测，并对其结果进行判定；
其中，定量检测结果的计算方法采用“ΔΔCt”法进行判断，其计算方法如下，
首先，进行实验样本免疫沉淀的标准化，其公式为，
ΔCt [normalized 样品沉淀] = Ct [样品沉淀] - (Ct [Input] - Log2 (Input Dilution Factor))，
Input Dilution Factor(IDF) = (fraction of the inputchromatin saved) -1，
一般情况下，技术人员设定样本投入控制为投入免疫共沉淀样品的2%，此时的投入稀释因子为5.6；
然后，计算阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数，其公式为，
ΔΔCt [ChIP阳性引物/ ChIP阴性引物] = 阳性引物ΔCt [normalized 样品沉淀] - 阴性引物 ΔCt[normalized 样品沉淀]，
Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP阳性引物/ ChIP阴性引物])；
最后，对结果进行判定为，
阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数≥2，视为成功阳性沉淀富集，富集效果达标，即富集效果较好；
阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数<2，视为成功阴性沉淀富集，富集效果未达标，即富集效果较差。
另外，本发明的提供了一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测引物，引物对选自序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2所示的阳性引物对和阴性引物对，具体的，
阳性引物核苷酸序列（SEQ ID NO.1）为：
CATSPER2 PF：CGGAGACTGGGATAGCGAAC
CATSPER2 PR：AAAGGTATCCCGTCCCGAGTAT
阴性引物核苷酸序列（SEQ ID NO.2）为：
STRC PF：ATCAGGTATTCTGTGGCTCG
STRC PR：ATTCTCACCTTGTGTGGGATAG
其中，考虑到猪组蛋白修饰H3K4ME3及H3K27AC结合的多样性及较难直接得出对应的阳性位点，技术人员通过优化分析，大致获得了H3K4ME3及H3K27AC结合活性的共有区段共2096bp（chromosome：Sscrofa11.1：1：127812797：127831385：1），并根据此区域设计特定的基因组引物对SEQ ID NO.1；同时，获得了H3K4ME3及H3K27AC非结合区域共有区段共2049bp（chromosome：Sscrofa11.1：1：127833821：127852873：1），并根据此区域设计特定的基因组引物对SEQ ID NO.2。
实施例1，进行猪脂肪组织H3K4ME3及H3K27AC富集后的定量检测。
本实施例以猪脂肪组织为样本，其具体操作步骤如下，
1）先取50ml的离心管，加入50ml PBS 100ul PIS 200ul PMSF冰上预冷，再取样肌肉组织0.5g。
2）用剪刀将样本剪成小块，再加PBS定至30ml，再加入840ul 37%甲醛，于室温摇床上轻摇15min。
3）加入3.42ml 2.0M 的甘氨酸，使终浓度为0.2M，室温摇床上轻摇5min。
4）以2500 rpm，在室温下离心5 min。
5）将下层用PBS清洗两次，以2500 rpm，在4℃下离心5 min。
6）弃去液体，沉淀用细胞裂解液进行匀浆；其中，细胞裂解液的添加量为，每1g猪组织加入3mL细胞裂解液。
7）匀浆后的样品置于冰上放置20 min。
8）用40μm的细胞筛进行过滤。
9）在4℃下以4000 g离心10 min，弃上清，沉淀用500 μl的核裂解液进行裂解，转移到1.5 ml离心管中裂解30 min。
10）采用Biorupt超声波打断染色质，超声条件为30s超声，30秒间隔，超声循环数为10个循环。
11）取20ul 未打断的样和打断的样品进行解交联，之后用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）纯化提取DNA，再用琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小。
12）用ChIP dilution buffer洗protein G磁珠3次以活化磁珠，加入990μL ChIPdilution buffer和5μL的H3K4Me3或H3K27AC抗体，在4℃条件下，置于静音混匀器上过夜孵育。
13）用ChIP dilution buffer清洗磁珠3次，加入900μL ChIP dilution buffer和100μL染色质溶液，在4℃条件下，置于静音混匀器上孵育7-12h。
14）将反应后的磁珠装入离心管并置于磁力架上，弃去上清液后，依次加入Lowsalt wash buffer、High salt wash buffer、LiCl wash buffer和TE buffer进行洗涤。
15）弃去上清液，加入250μL Elution buffer后，在65℃条件下，以800rpm离心20min，置于磁力架上放置2min后，吸取上清移至新的离心管中。
16）重复步骤S52，在两次Elution buffer洗脱后，获得上清液共500μL。
17）加入20μL 5M NaCl后，在65℃条件下，以600rpm过夜解交联，取15μL Input加入500μL Elution buffer和20μL 5M NaCl同时解交联。
18）向解交联产物中加入10μL 0.5M EDTA、5μL RNase和20μL Tris-HCl (pH7.0)，置于恒温振荡仪上，在37℃条件下，以600rpm孵育30min，之后加入2μL蛋白酶K，在55℃条件下，以600rpm孵育1h，纯化解交联产物。
19）采用荧光定量QPCR方法进行定量检测时，荧光定量在ABI 7500仪器上进行，利用Takara试剂盒，反应体系20μL；其中，包括1.5μL ChIP-DNA模板、10μL SYBR PremixExTaq、0.4μL ROX和上下游引物各0.5μL，加入ddH2O补足至20μL；扩增程序为，95℃预变性30sec；95℃变性10sec，退火延伸30sec，进行40个循环；95℃变性1min，退火温度+2℃30sec，95℃30sec，进行一个循环，收集信号。
最后，采用“ΔΔCt”法对富集效果进行评估，其结果如图1所示，其中左柱为CATSPER2指标，右柱为STRC指标。
其中，细胞裂解液包括10mM HEPES、80mM KCl、1%(v/v) IGEPAL CA-630和蛋白酶抑制剂。
核裂解液包括50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、1.5%(v/v) SDS和蛋白酶抑制剂。
定量PCR反应试剂可以选用包括但不限于商业出售的用于定量的PCR试剂盒或反应试剂，其一般包括PCR反应MIX、SYBR Green染料、ROX染料等。
实施例2，进行猪肌肉组织H3K4ME3及H3K27AC富集后的定量检测。
本实施例以猪肌肉组织为样本，其具体操作步骤和实施例1相同。
其结果如图2所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA，再采用荧光定量QPCR方法进行定量检测，并对其结果进行判定；
其中，所述定量检测结果的计算方法采用“ΔΔCt”法进行判断，其计算方法如下，
首先，进行实验样本免疫沉淀的标准化，其公式为，
ΔCt [normalized 样品沉淀] = Ct [样品沉淀] - (Ct [Input] - Log2 (Input Dilution Factor))，
Input Dilution Factor(IDF) = (fraction of the input
chromatin saved) -1；
然后，计算阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数，其公式为，
ΔΔCt [ChIP阳性引物/ ChIP阴性引物] = 阳性引物ΔCt [normalized 样品沉淀] - 阴性引物 ΔCt[normalized 样品沉淀]，
Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP阳性引物/ ChIP阴性引物])；
最后，对结果进行判定为，
阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数≥2，视为成功阳性沉淀富集，富集效果达标；
阳性引物和阴性引物的有效沉淀富集倍数<2，视为成功阴性沉淀富集，富集效果未达标；
其中，阳性引物核苷酸序列为：
CATSPER2 PF：CGGAGACTGGGATAGCGAAC；
CATSPER2 PR：AAAGGTATCCCGTCCCGAGTAT；
阴性引物核苷酸序列为：
STRC PF：ATCAGGTATTCTGTGGCTCG；
STRC PR：ATTCTCACCTTGTGTGGGATAG；
其中，使用猪组织样本通过ChIP-seq方法富集与目的蛋白结合的DNA时，包括以下步骤，
S1对猪组织样本进行甲醛交联反应，然后进行甘氨酸冰上终止交联，再离心获得沉淀，并用PBS对沉淀进行清洗；
S2获得的组织细胞分别用细胞裂解液和核裂解液进行裂解以获取细胞核沉淀；
S3超声打断染色质以获得蛋白核酸复合物的小片段：
S4使用组蛋白修饰抗体与蛋白核酸复合物的小片段进行免疫共沉淀反应，所述组蛋白修饰抗体为H3K4Me3或H3K27AC抗体；
S5洗脱并纯化富集的与目的蛋白结合的DNA。
2.根据权利要求1所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述细胞裂解液包括10mM HEPES、80mM KCl、1%(v/v) IGEPAL CA-630和蛋白酶抑制剂。
3.根据权利要求1所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述细胞裂解液的添加量为，每1g猪组织加入3mL细胞裂解液。
4.根据权利要求1所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述核裂解液包括50mM Tris-HCl，pH8.0、10mM EDTA、1.5%(v/v) SDS和蛋白酶抑制剂。
5.根据权利要求1所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述超声条件为每次超声30s，间隔30s，超声循环10次。
6.根据权利要求1所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述步骤S4包括如下步骤，
S41用ChIP dilution buffer洗protein G磁珠3次以活化磁珠，加入990μL ChIPdilution buffer和5μL的H3K4Me3或H3K27AC抗体，在4℃条件下，置于静音混匀器上过夜孵育；
S42用ChIP dilution buffer清洗磁珠3次，加入900μL ChIP dilution buffer和100μL染色质溶液，在4℃条件下，置于静音混匀器上孵育7-12h。
7.根据权利要求6所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：所述步骤S5包括如下步骤，
S51将反应后的磁珠装入离心管并置于磁力架上，弃去上清液后，依次加入Low saltwash buffer、High salt wash buffer、LiCl wash buffer和TE buffer进行洗涤；
S52弃去上清液，加入250μL Elution buffer后，在65℃条件下，以800rpm离心20min，置于磁力架上放置2min后，吸取上清移至新的离心管中；
S53重复步骤S52，在两次Elution buffer洗脱后，获得上清液共500μL；
S54加入20μL 5M NaCl后，在65℃条件下，以600rpm过夜解交联，取15μL Input加入500μL Elution buffer和20μL 5M NaCl同时解交联；
S55向解交联产物中加入10μL 0.5M EDTA、5μL RNase和20μL Tris-HCl，pH7.0，置于恒温振荡仪上，在37℃条件下，以600rpm孵育30min，之后加入2μL蛋白酶K，在55℃条件下，以600rpm孵育1h，纯化解交联产物。
8.根据权利要求1所述的一种用于评估猪组蛋白修饰的富集结果的检测方法，其特征在于：采用荧光定量QPCR方法进行定量检测时，所述荧光定量在ABI 7500仪器上进行，利用Takara试剂盒，反应体系20μL；
其中，包括1.5μL ChIP-DNA模板、10μL SYBR Premix ExTaq、0.4μL ROX和上下游引物各0.5μL，加入ddH2O补足至20μL；
扩增程序为，95℃预变性30sec；95℃变性10sec，退火延伸30sec，进行40个循环；95℃变性1min，退火温度+2℃30sec，95℃30sec，进行一个循环，收集信号。
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