CN108949742A - 一种猪脂肪组织的超声破碎方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于染色质免疫共沉淀领域，具体涉及一种猪脂肪组织的超声破碎方法及其应用，包括(1)猪脂肪组织进行冰上甲醛交联反应、(2)甘氨酸冰上终止交联后离心并冰浴分层、(3)获取猪脂肪组织细胞沉淀层、(4)获取细胞核沉淀层、(5)超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段五个步骤。本发明的猪脂肪组织的超声破碎方法整个实验操作均保持低温条件，更大程度保证了蛋白的天然结构，从而得到真实抗体吸附的DNA‑蛋白复合物。且得到的蛋白核酸复合物的小片段可直接用于后续ChIP，得到的DNA检测其浓度并用高通量测序检测全基因组范围内的DNA和目的蛋白的结合情况。并进一步用富集后得到的dna建库后二代测序，应用于猪脂肪组织DNA生物信息学分析。
Description
技术领域
本发明属于染色质免疫共沉淀领域，具体涉及一种猪脂肪组织的超声破碎方法及其应用。
背景技术
生命体内的生物过程调控十分复杂而有序。生命体的大部分基因信息存在于细胞染色质中，而在生命体的生物活动中，蛋白质和DNA的相互作用是细胞精准调控的重要基础。目前常用的在体外检测DNA-蛋白质相互作用的方法有足迹法、电泳迁移率变动分析、DNA-蛋白质印迹法、酵母单杂交分析法、噬菌体展示技术等(Dey B,Thukral S,KrishnanS,Chakrobarty M,Gupta S,Manghani C,Rani V.DNA-protein interaction:methods fordetection and analysis.Molecular and Cellular Biochemistry.08Mar 2012,365(1-2):279-299)，但是这些方法都不能真实反映生理条件下DNA与蛋白质的相互作用。而染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)能够真实反映生理条件下DNA-蛋白质相互作用，它能结合测序(ChIP-seq)、芯片(ChIP-Chip)等技术获得全基因组内转录因子分布、核小体定位、组蛋白修饰等表观基因组信息(Peter J.Park.ChIP-Seq:advantagesand challenges of a maturing technology.Nat Rev Genet.2009October；10(10):669–680.doi:10.1038/nrg2641)。
在世界肉类的生产中，猪肉的生产起着重要的作用。而脂肪沉积影响生猪的生产效率和猪肉的品质，并且猪跟人类有着相似的体重、器官大小、代谢方式、脂肪沉积的部位等，所以猪是研究人类肥胖问题的一个很好的模式动物(Houpt,K.A.,T.R.Houpt,andW.G.Pond,The pig as a model for study of obesity and of control of foodintake:a review.Yale J Biol Med,1979.52(3):p.307-29)。
ChIP技术中对组织样本预处理的方法主要是将组织样品剪碎后与胶原酶、透明质酸酶等酶混合后37℃消化3h后离心得到的滤液进行常规甲醛固定、超声破碎等步骤，但是这种方法在处理脂肪组织时，实验结果很不理想。脂肪组织中含有大量的脂肪使得小的脂肪组织在离心处理时不易沉淀，并且标准的ChIP操作流程中要求超声波破碎时的缓冲液使用SDS裂解缓冲液，但是大量脂肪的存在严重影响超声效率，导致染色质片段化结果不适合后续免疫共沉淀；而且免疫共沉淀实验在37℃水浴酶消化过程中，由于蛋白结构不稳定性，容易造成部分蛋白降解，影响实验结果。
目前，对脂肪ChIP-seq的研究很多都是在脂肪前体细胞中的研究，对于染色质修饰的动态变化及与基因的表达调控关系也限于细胞水平，还未有报道在猪脂肪组织中的应用。
发明内容
针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种猪脂肪组织的超声破碎方法及其应用，该方法处理脂肪组织后得到合适大小的DNA-蛋白质片段能方便后续的染色质免疫共沉淀实验，并且所有实验操作均保持低温条件，更大程度保证了蛋白结构的稳定。
本发明的第一个目的在于提出一种猪脂肪组织的超声破碎方法，包括以下步骤：
(1)猪脂肪组织进行冰上甲醛交联反应；
(2)甘氨酸冰上终止交联后离心并冰浴分层；
(3)收集上层油脂层，用PBS清洗离心得到猪脂肪组织细胞沉淀层；
(4)细胞沉淀层加入脂肪细胞裂解液匀浆，匀浆液依次冰浴裂解、细胞筛过滤，滤液离心获得细胞核沉淀层；
(5)细胞核沉淀层加入核裂解液裂解并超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段。
进一步地，所述步骤(2)中加入的甘氨酸浓度为2.0M，甘氨酸加入后的终浓度为0.125M。
进一步地，所述步骤(4)中脂肪细胞裂解液含有10mM HEPES，80mM KCl，1％Igepal，PIS。
进一步地，所述步骤(4)中每1g脂肪组织加入3ml脂肪细胞裂解液。
进一步地，所述步骤(5)中核裂解液含有50mM Tris-Hcl(pH 8.0)，10mM EDTA，1％SDS，PIS。
进一步地，所述步骤(5)中超声条件为：30s超声，30秒间隔，超声循环数为10个循环。
本发明的第二个目的在于提出上述猪脂肪组织的超声破碎方法在猪脂肪组织的染色质免疫共沉淀实验中的应用。
进一步地，所述猪脂肪组织的染色质免疫共沉淀方法为：向上述任一项的蛋白核酸复合物的小片段中加入Protein G磁珠，清洗并洗脱磁珠吸附的蛋白-DNA复合物后解交联并纯化DNA，得到的DNA检测其浓度并用高通量测序检测全基因组范围内的DNA和目的蛋白的结合情况。
本发明的第三个目的在于提出上述猪脂肪组织的超声破碎方法在猪脂肪组织DNA建库测序和生物信息学分析中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明的猪脂肪组织的超声破碎方法整个实验操作均保持低温条件，更大程度保证了蛋白的天然结构，从而得到真实抗体吸附的DNA-蛋白复合物。
(2)本发明的超声破碎方法在细胞沉淀层加入脂肪细胞裂解液裂解之前先匀浆再经细胞筛过滤，可以显著提高裂解效率，同时最大程度减小脂肪对过滤效果的影响和对后续超声效率的影响。
(3)经本发明的猪脂肪组织的超声破碎方法得到的蛋白核酸复合物的小片段可直接用于后续染色质ChIP，得到的DNA检测其浓度并用高通量测序检测全基因组范围内的DNA和目的蛋白的结合情况。并进一步用富集后得到的dna建库后二代测序，应用于猪脂肪组织DNA生物信息学分析，获得自己感兴趣的基因的同时还可获得没有报道的调控基因。
附图说明
图1为实施例1中猪腹下脂肪经本发明的的超声破碎方法-染色质免疫共沉淀获得的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测谱图。
图2为实施例2中猪板油脂肪经本发明的的超声破碎方法-染色质免疫共沉淀获得的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测谱图。
具体实施方式
下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。
实施例1：染色质免疫共沉淀中猪腹下脂肪的超声破碎方法
1、猪腹下脂肪的超声破碎
(1)分别取50ml PBS、100μl PIS、200μl PMSF冰上预冷。
(2)冰上将1g冻存猪脂肪组织缓慢解冻并剪成体积为1-3立方厘米碎片，解冻后的碎片用30ml PBS打散后加入终浓度为1％甲醛，摇床冰上轻摇10min；然后加入甘氨酸终止交联反应，使甘氨酸终浓度为0.125M，摇床冰上轻摇10min。
(3)2500rpm离心5min后立即置于冰上，当溶液分成三层时，取上层液体用PBS清洗，2500rpm 4℃离心5min，重复PBS清洗、离心操作；弃上清，沉淀用3ml脂肪细胞裂解液(10mM HEPES，80mM KCl，1％Igepal，PIS)匀浆后冰上裂解20min，用250μm的细胞筛进行过滤，细胞筛上滤渣继续匀浆后过滤；滤液4000g 4℃离心10min，弃上清，沉淀用500μl核裂解液(50mM Tris-Hcl(pH 8.0)，10mM EDTA，1％SDS，PIS)进行裂解20min，Biorupt超声打断10min，超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段，超声条件为：30s超声，30秒间隔，超声循环数为10个循环。
(4)取20μl未打断的样品和步骤(3)中打断的样品解交联，之后用酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)纯化提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小，如图1所示。
2、IP富集
超声破碎后产物片段经琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为100bp-500bp。进一步对超声破碎后产物片段进行后续IP富集实验，即加入Protein G磁珠、抗体收集被抗体吸附的目的蛋-DNA复合物，清洗并洗脱磁珠吸附的蛋白-DNA复合物后解交联并纯化DNA，得到的DNA检测其浓度并用高通量测序检测全基因组范围内的DNA和目的蛋白的结合情况。具体操作如下：
(1)活化磁珠：配ChIP dilution Buffer，其中包括：1.1％Triton x-100，1.2mMEDTA，16.7mM Tris-Hcl(pH 8.0)，167mM Nacl；所用的抗体包括：5μg H3K4me3(CST，9751)，用其洗protein G beads三次，最后加入990μl ChIP dilution Buffer再加5μl的抗体，4℃静音混匀器上过夜孵育。
(2)再用ChIP dilution Buffer清洗磁珠3次，最后再加入900μl ChIP dilutionBuffer及100ul离心好的染色质上清液，4℃静音混匀器上7-12h。
(3)磁力架上放置，弃上清依次加入Low salt wash buffer、High salt washbuffer、LiCl wash buffer和TE buffer进行洗涤；Low salt wash buffer包括150mMNacl、0.1％SDS、1％Triton x-100、2mM EDTA、20mM Tris-Hcl(pH 8.0)；High salt washbuffer包括500mM Nacl、0.1％SDS、1％Triton x-100、2mM EDTA、20mM Tris-Hcl(pH 8.0)；LiCl wash buffer包括0.25M LiCl、1％NP-40、1％脱氧胆酸钠、1mM EDTA、10mM Tris-Hcl(pH 8.0)；TE buffer包括100mM Tris-Hcl(pH 8.0)、1mM EDTA。
(4)弃上清加260μl Elution buffer 65℃条件下800rpm离心20min后，磁力架上放置2min吸上清于一新的tube中；Elution buffer主要包括1％SDS、0.1M NaHCO3。
(5)重复步骤(4)，将两次的Elution buffer合并，共500μl；
(6)加入20ul 5M NaCl，65℃600rpm过夜解交联，取15μl Input加入500μlElution buffer和20ul 5M NaCl同时解交联；
(7)解交联产物中加入10μl 0.5M EDTA、5μl RNase、20μl Tris-Hcl(pH 7.0)于恒温振荡仪上37℃、600rpm，孵育30min，之后加入2μl蛋白酶K，55℃、600rpm孵育1h，纯化17中的产物；
(8)建库测序：Q-bit对ChIP下来的DNA进行定量，然后加入接头并对文库进行扩增，再用AMPure磁珠对文库进行纯化，Q-sep1检查文库的质量，用Hiseq4000进行PE150测序，对测序结果进行生物信息学分析。
实施例2：染色质免疫共沉淀中猪板油脂肪的超声破碎方法
1、猪板油脂肪的超声破碎
(1)分别取50ml PBS、100ul PIS、200ul PMSF冰上预冷。
(2)冰上将1g冻存猪板油脂肪组织缓慢解冻并剪成体积为1-3立方厘米碎片，解冻后的碎片用30ml PBS打散后加入终浓度为1％甲醛，摇床冰上轻摇10min；然后加入甘氨酸终止交联反应，使甘氨酸终浓度为0.125M，摇床冰上轻摇10min。
(3)2500rpm离心5min后立即置于冰上，当溶液分成三层时，取上层液体用PBS清洗，2500rpm 4℃离心5min，重复PBS清洗、离心操作；弃上清，沉淀用3ml脂肪细胞裂解液(10mM HEPES，80mM KCl，1％Igepal，PIS)匀浆后冰上裂解20min，用250μm的细胞筛进行过滤，细胞筛上滤渣继续匀浆后过滤；滤液4000g 4℃离心10min，弃上清，沉淀用500μl核裂解液(50mM Tris-Hcl(pH 8.0)，10mM EDTA，1％SDS，PIS)进行裂解20min，Biorupt超声打断10min，超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段，超声条件为：30s超声，30秒间隔，超声循环数为10个循环。
(4)取20μl未打断的样品和步骤(3)中打断的样品解交联，之后用酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)纯化提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小，如图2所示。
2、IP富集
超声破碎后产物片段经琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为100bp-500bp。进一步对超声破碎后产物片段进行后续IP富集实验，即加入Protein G磁珠、抗体收集被抗体吸附的目的蛋-DNA复合物，清洗并洗脱磁珠吸附的蛋白-DNA复合物后解交联并纯化DNA，得到的DNA检测其浓度并用高通量测序检测全基因组范围内的DNA和目的蛋白的结合情况。具体操作同实施例1。
因此，本发明的猪脂肪组织的超声破碎方法整个实验操作均保持低温条件，更大程度保证了蛋白的天然结构，从而得到真实抗体吸附的DNA-蛋白复合物。经本发明的猪脂肪组织的超声破碎方法得到的蛋白核酸复合物的小片段可直接用于后续染色质ChIP，得到的DNA检测其浓度并用高通量测序检测全基因组范围内的DNA和目的蛋白的结合情况，并进一步用富集后得到的dna建库后二代测序，应用于猪脂肪组织DNA生物信息学分析。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种猪脂肪组织的超声破碎方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)猪脂肪组织进行冰上甲醛交联反应；
(2)甘氨酸冰上终止交联后离心并冰浴分层；
(3)收集上层油脂层，用PBS清洗离心得到猪脂肪组织细胞沉淀层；
(4)细胞沉淀层加入脂肪细胞裂解液匀浆，匀浆液依次冰浴裂解、细胞筛过滤，滤液离心获得细胞核沉淀层；
(5)细胞核沉淀层加入核裂解液裂解并超声打断染色质获得蛋白核酸复合物的小片段。
2.根据权利要求1所述的一种猪脂肪组织的超声破碎方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的甘氨酸浓度为2.0M，甘氨酸加入后的终浓度为0.125M。
3.根据权利要求1所述的一种猪脂肪组织的超声破碎方法，其特征在于，所述步骤(4)中脂肪细胞裂解液含有10mM HEPES，80mM KCl，1％Igepal，PIS。
4.根据权利要求3所述的一种猪脂肪组织的超声破碎方法，其特征在于，所述步骤(4)中每1g脂肪组织加入3ml脂肪细胞裂解液。
5.根据权利要求1所述的一种猪脂肪组织的超声破碎方法，其特征在于，所述步骤(5)中核裂解液含有50mM Tris-Hcl(pH 8.0)，10mM EDTA，1％SDS，PIS。
6.根据权利要求1所述的一种猪脂肪组织的超声破碎方法，其特征在于，所述步骤(5)中超声条件为：30s超声，30秒间隔，超声循环数为10个循环。
7.一种权利要求1-6任一项所述猪脂肪组织的超声破碎方法在猪脂肪组织的染色质免疫共沉淀实验中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种猪脂肪组织的超声破碎方法的应用，其特征在于，所述猪脂肪组织的染色质免疫共沉淀方法为：向权利要求1-6任一项的蛋白核酸复合物的小片段中加入Protein G磁珠，清洗并洗脱磁珠吸附的蛋白-DNA复合物后解交联并纯化DNA，得到的DNA检测其浓度并用高通量测序检测全基因组范围内的DNA和目的蛋白的结合情况。
9.一种权利要求1-6任一项所述猪脂肪组织的超声破碎方法在猪脂肪组织DNA建库测序和生物信息学分析中的应用。
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Denomination of invention: A method for ultrasonic fragmentation of pig adipose tissue and its application Granted publication date: 20220315 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN IGENEBOOK BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980007417 |
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