CN113718017A - 一种单细胞ChIP-seq文库的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单细胞ChIP‑seq文库的制备方法,涉及表观遗传学领域,添加物包括辅助DNA添加物或者抗原类似物;单细胞ChIP‑seq文库制备方法为将单细胞分选到96孔板中,经过染色质开放处理之后,每个样品孔中加入带有特异序列标签的Tn5转座酶,在转座酶的作用下,实现对单个细胞核的标记。经过特异性抗体捕获之后,对所得样品进行扩增和纯化。文库由Illumina Nextseq 500测序平台进行测序。本发明添加辅助DNA,降低样品损失;添加抗原类似物,降低抗体的非特异性吸附,增加免疫沉淀反应效率;还提供一种Tn5转座酶介导的染色质打断技术,避免了低效率的传统TruSeq建库法。
Description
技术领域
本发明涉及表观遗传学领域,尤其涉及一种单细胞ChIP-seq文库的制备方法。
背景技术
随着人类基因组计划的逐步完成,研究者越来越重视表观遗传学的研究。表观遗传学(epigenetics)主要研究在基因核苷酸序列不发生改变的情况下,DNA及有关蛋白分子发生的可遗传修饰,即探索从基因演义为表型的过程和机制的一门新兴学科。其研究内容主要包括两类,一类为基因选择性转录表达的调控,有DNA甲基化、基因印记、组蛋白共价修饰和染色质重塑;另一类为基因转录后的调控,包括基因组中非编码RNA、微小RNA、反义RNA、内含子及核糖开关等。
染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
主要流程包括:(1)用甲醛将DNA和蛋白质交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布;(2)采用超声或者酶切等方法将染色质断裂成大小合适的片段;(3)用特异性的抗体沉淀并富集DNA与蛋白质的复合体;(4)将捕获的DNA与蛋白质的复合体进行解交联,释放DNA片段;(5)将纯化后的ChIP DNA构建测序文库;(6)通过高通量测序技术对文库进行测序,最后通过序列比对,将测序获得的序列信息定位到基因组上。这样就获得了与目的蛋白相互作用的DNA片段的序列和位置信息。
多细胞生物体由具有相同基因组的不同细胞类型组成,在器官组织发育过程中,细胞状态和细胞命运决定的机制一直是领域普遍关心的问题。无论在发育过程还是疾病状态下,表观遗传因素(不改变DNA序列的情况下却能引起基因表达变化或表型)在细胞命运决定中起着指导性作用。细胞类型和功能异质性往往通过调控基因表达来实现。单细胞相关的技术方法目前多集中在转录组水平,单细胞水平解析表观调控机制的技术鲜有报道,而单细胞水平的全基因组范围研究组蛋白修饰和转录因子如何控制细胞谱系发生、命运决定的技术更是少见。
因受限于实验原理和仪器设备,ChIP-seq技术在单细胞水平的研究和应用一直进展缓慢,目前还缺乏一种具有普适性、易操作、高质量的单细胞ChIP-seq技术。
目前报道的单细胞ChIP-seq技术主要存在以下缺陷:
1、样品在实验过程中损失严重
以少量细胞或者单细胞为起始材料时,DNA片段在实验过程中丢失太多,导致最终文库主要信息丢失,实验失败几率高,也无法得到全基因组水平上的蛋白与DNA相互作用图谱。
2、免疫共沉淀效率低,导致文库背景较高
目前限制少量样品ChIP实验的一个重要因素是,当样品量极低时,免疫共沉淀效率低下,非特异性吸附增强,导致最终文库背景较高,导致实验失败。
3、建库效率低,导致做少量细胞时文库信息丢失严重
基于Protein A-MNase切割反应来片段化染色质的实验,需要采用传统的TruSeq的建库策略对捕获的DNA进行建库,由于样品量极低,建库时Adaptor和DNA片段连接效率也会极低。从而导致文库主要信息丢失,实验失败率升高。
有鉴于此,本领域的技术人员致力于开发一种能够有效降低样品损失、提高免疫共沉淀和文库建立的效率、降低文库背景的ChIP-seq技术。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是如何开发一种能够有效降低样品损失、提高免疫共沉淀和文库建立的效率、降低文库背景的ChIP-seq技术。
为实现上述目的,本发明提供了一种制备单细胞ChIP-seq文库的添加物,包括辅助DNA添加物和抗原类似物。
进一步地,辅助DNA添加物以噬菌体DNA为模板、以dATP、dUTP、dCTP、dGTP为原料,通过特异引物PCR扩增获得;PCR扩增正向引物为:CGCTCAGGGGAACAAACA,如序列表SEQ IDNO:1所示;反向引物为:GCGTATTCAGTGCGTCAGG,如序列表SEQ ID NO:2所示;PCR产物长度为87bp;抗原类似物能与抗体特异性结合。
进一步地,抗原类似物为包含所结合的抗体氨基酸的多肽,多肽包括组蛋白H3K4三甲基多肽或者组蛋白H3K27乙酰基多肽。
本发明还提供一种单细胞ChIP-seq文库制备方法,包括以下步骤:
步骤一、Tn5转座元件组装,合成一段同时带有Tn5寡核苷酸、细胞身份标签和测序引物接头的DNA片段,与Tn5转座酶组装,即合成Tn5转座子;
步骤二、细胞经过甲醛固定后,用流式细胞仪分配单细胞到96孔板中,利用步骤一获得的Tn5转座酶,对每个细胞进行身份标记,得到完成身份标记的细胞;
步骤三、在步骤二获得的完成身份标记的细胞中补加含有dUTP的λDNA,将所有单细胞合并到一个离心管中;
步骤四、通过非接触式超声,释放单细胞中的染色质DNA,收集染色质DNA;
步骤五、取特异性抗体与免疫磁珠孵育、结合,得到“抗体-磁珠”复合物;
步骤六、在步骤四收集的染色质DNA中加抗原类似物,一起与步骤五所得“抗体-磁珠”复合物共同孵育过夜,进行免疫共沉淀反应,得到免疫共沉淀反应物;
步骤七、用缓冲液洗去步骤六得到的免疫共沉淀反应物中的非特异性结合物后,得到样品液,用蛋白酶K对样品液进行解交联,得到ChIP DNA初溶液;
步骤八、对步骤七的ChIP DNA初溶液用混合酚抽提、乙醇沉淀来纯化收集ChIPDNA;
步骤九、用USER(尿嘧啶DNA糖基化酶UDG和DNA糖基化酶-裂解酶Endo VIII的混合物)去除添加的补加辅助DNA添加物;步骤十、用可以识别步骤一中测序引物接头的引物,对步骤八获得的ChIP DNA进行扩增,完成测序文库的构建;
步骤十一、上机测序与数据分析。
进一步地,上述步骤五中取特异性抗体5μg,免疫磁珠20μL;步骤六中加入抗原类似物0.1ng。
进一步地,步骤五中特异性抗体包括H3K27ac;步骤六中加入的抗原类似物为组蛋白H3K27乙酰基多肽。
进一步地,步骤五中特异性抗体还包括H3K4me3;步骤六中加入的抗原类似物为组蛋白H3K4三甲基多肽。
进一步地,步骤二中Tn5转座酶与带有不同序列标签的DNA片段组装后,在打断染色质的同时在染色质片段两端添加序列标签,序列标签带有特异扩增引物的结合位点。
进一步地,步骤二中Tn5转座酶,可以识别一段特异性DNA序列Tn5寡核苷酸,并可以将其随机插入到基因组DNA中。
进一步地,步骤八中混合酚为等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合。
进一步地,辅助DNA添加物可以被USER酶(尿嘧啶DNA糖基化酶UDG和DNA糖基化酶-裂解酶Endo VIII的混合物)消化分解,不会干扰最终文库。
进一步地,抗原类似物可以降低抗体的非特异性吸附,增加免疫沉淀反应效率。
进一步地,序列标签带有特异扩增引物的结合位点,可以通过PCR扩增来构建文库,避免了低效率的传统TruSeq建库法。
进一步地,Tn5酶是一种转座酶,具有“剪切-粘贴”的功能,Tn5转座酶可以识别一段特异性DNA序列(称为Tn5寡核苷酸),并可以将其随机插入到基因组DNA中。
进一步地,步骤一中合成的同时带有Tn5寡核苷酸、细胞身份标签、测序引物接头的DNA片段,可以被Tn5酶所识别并将其插入到基因组DNA中,在插入DNA片段时完成基因组DNA的片段化,同时该基因组DNA带有了可以区别于其他DNA的身份标签(barcode)。
进一步地,单细胞ChIP实验过程中,在DNA片段化结束后,补加辅助DNA。
进一步地,单细胞ChIP实验的免疫共沉淀过程中,补加抗原类似物。
进一步地,通过PCR法构建适合Nextseq 500平台测序的文库。
在本发明的较佳实施例1中,详细说明合成一段含dUTP的λDNA;
在本发明的另一较佳实施例2中,详细说明Tn5转座酶的组装过程;
在本发明的另一较佳实施例3中,详细说明单细胞ChIP-seq实验流程;
在本发明的另一较佳实施例4中,详细说明上机测序过程及测序结果。
本发明提供了一种添加在单细胞样品中的添加辅助DNA,可以降低单细胞操作过程中样品的损失。
本发明还提供了一种可以添加在微少量样品免疫共沉淀反应过程中的抗原类似物,抗原类似物可以降低抗体的非特异性吸附,增加免疫沉淀反应效率。
本发明还提供了一种Tn5转座酶介导的染色质打断技术,片段化的DNA片段可以通过PCR扩增的方式构建文库,避免了低效率的传统TruSeq建库法。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例3的单细胞ChIP实验操作流程图;
图2是本发明的一个较佳实施例3的文库结构示意图;
图3是本发明的一个较佳实施例3的sanger测序结果示意图;
图4是本发明的一个较佳实施例3的ChIP DNA富集效率的验证结果图;
图5是本发明的一个较佳实施例3的文库片段分布示意图;
图6是本发明的一个较佳实施例4的利用Nextseq 500测序平台进行测序测序模式示意图;
图7是本发明的一个较佳实施例4的单细胞特异性位点高通量测序结果示意图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1合成一段含dUTP的λDNA
(1)以噬菌体λDNA为模板,在扩增过程中用dUTP代替dTTP,用Taq酶进行PCR扩增。反应体系如表1所示:
表1反应体系
Primer F(正向引物):CGCTCAGGGGAACAAACA
Primer R(反向引物):GCGTATTCAGTGCGTCAGG
反应条件如表2所示:
表2反应条件
(2)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,收集90bp左右的目的片段,利用胶回收试剂盒,对目的片段进行回收。
实施例2Tn5转座酶的组装
(1)引物稀释与退火处理
按照图2设计的文库结构,合成引物,引物序列如表3所示;
表3引物序列
取出合成的干粉状态的引物进行稀释;将订制引物(T5或者T7)与等摩尔数的Tn5通用退火引物(Tn5MErev)混合,然后按照表4所示程序进行退火:
表4退火程序
反应结束后,退火产物用于下一步接头包埋反应。
(2)转座酶接头包埋
反应物成分和体积比如表5所示,反应液混合均匀,25℃孵育1小时,完成Tn5转座酶的接头包埋。
表5接头包埋反应物成分和体积比
实施例3单细胞ChIP-seq实验流程
细胞ChIP-seq流程如图1所示,首先将单细胞分选到96孔板中,经过染色质开放处理之后,每个样品孔中加入带有特异序列标签的Tn5转座酶,在转座酶的作用下,实现对单个细胞核的标记。经过特异性抗体捕获之后,对所得样品进行扩增和纯化。具体实验流程如下:
(1)准备一个96孔PCR板,每孔添加5μL低渗缓冲液;
(2)经甲醛固定的ES细胞,用流式细胞仪将单细胞分到96孔PCR板中;
(3)将细胞37℃600rpm处理1小时,可以使致密结构的染色质打开;
(4)加1.2μL 10%Triton X-100 37℃处理1小时中和SDS;
(5)加2μL TMgCl-DMF反应缓冲液、0.85μM Tn5-T5和0.85μM Tn5-T7,用ddH2O补足10μL体系,37℃反应50min,55℃反应10min;
(6)加2μL 250mM EDTA室温孵育20min终止Tn5反应;
(7)每孔加入5ng含有dUTP的λDNA片段,减少接下来样品转移过程中的损失;
(8)将96孔板中的细胞合并到1.5mL的离心管中,4℃12,000g离心3min,弃掉上清;
(9)加20μL染色质释放缓冲液,室温下放置30min;
(10)用非接触式超声破碎仪(Bioruptor plus,Diagenode)超声5个循环(lowlevel,15s“on”30s“off”),充分释放染色质DNA;
(11)加100μL ChIP稀释缓冲液稀释SDS;
(12)用预冷到4℃的离心机20,000g离心15min,取出上清后,所得可溶性染色质进行免疫共沉淀反应;
(13)取20μL Magna ChIP Protein A+G Magnetic beads(millipore,16-663)用1mL低盐裂解缓冲液洗2次,用1mL低盐裂解缓冲液重悬磁珠,加入4μL H3K27ac抗体(abcam,ab4729),于4℃旋转混合仪上(设置程序为F1,转速为40rpm)孵育2小时,用低盐裂解缓冲液洗磁珠2次,用1mL低盐裂解缓冲液重悬磁珠。
(14)将步骤(12)获得的样品加入到以上“磁珠-抗体”复合物中,补加0.2μL抗原类似物(组蛋白H3K27乙酰基多肽(abcam,ab24404)),于4℃旋转混合仪上(程序F1,转速40rpm)孵育过夜。
(15)将离心管从旋转混合器上取下,用1mL低盐裂解缓冲液洗一次,再依次用1mL高盐裂解缓冲液,1mL LiCl缓冲液和1mL TE缓冲液各洗磁珠两次,
(16)用400μL洗脱缓冲液重悬磁珠,加5μL蛋白酶K,在55℃、800rpm条件下处理6h,进行解交联。
(17)将上清取出加到一个新的离心管中,加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇,混合均匀,1,3000rpm离心5min,小心将上清取出。补加50ng含有dUTP的λDNA助沉降,加2.5倍体积的无水乙醇、1/10体积3M NaAc(pH 5.2)和1μL糖原,混合均匀,-80℃放置30min后,4℃、1,3000rpm离心30min,将上清弃掉,用75%乙醇洗沉淀一次,待沉淀风干后,加16μL 10mMpH 8.0的Tris-HCl溶解沉淀DNA。
(18)在纯化的DNA样品中,加5μL USER酶(NEB,M5505L),37℃处理6小时,清除添加的λDNA。
(19)按照表6所示体系配制PCR反应液,对ChIP DNA进行扩增:
表6 PCR反应体系
PCR反应程序如表7所示:
表7 PCR反应程序
扩增产物用0.8×Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter,A63880)纯化。
(20)通过定量PCR、sanger测序、2100对文库质量进行质检,对符合上机测序要求的样品进行精确定量。
以上实施例中所使用到的定量PCR引物为PGK1正向引物、PGK1反向引物、Hsp90ab1正向引物、Hsp90ab1反向引物、CDX2正向引物、CDX2反向引物、control正向引物、和control反向引物,其对应的序列见表8。
表8定量PCR引物序列
(21)按照KAPA Library Quantification Kit(KK4824)说明书,对样品进行精确定量,准备上机测序。
其中sanger测序结果示意图如图3所示,其中P5和P7为测序引物结合位点,“Tn5oligo”为Tn5酶特异性识别位点,“T7 barcode”为单细胞身份标记;ChIP DNA定量PCR结果如图4所示,结果显示检测的3个目的基因的富集倍数均在100倍以上,说明单细胞ChIP实验富集效果良好,可以用于后续高通量测序;文库片段分布示意图如图5所示,DNA片段集中分布在300-1,200bp范围内,说明Tn5酶对染色质的片段化效果良好,所得文库符合上机测序的要求。
实施例4上机测序
文库样品在Illumina Nextseq 500测序仪上进行高通量测序,如图6测序模式示意图所示,样品上机具体操作如下:
(1)测序引物稀释到2mL 0.3M。
(2)所有待测样品根据测序通量混样,稀释到4nM。
(3)配制0.2N NaOH溶液:9μL HT1缓冲液加1μL 2N NaOH溶液。
(4)测序样品变性:5μL 4nM样品加5μL 0.2N NaOH溶液,室温放置5min。
(5)将文库稀释到20pM:10μL 2nM文库加990μL HT1缓冲液。
(6)将文库稀释到1.2pM上样:78μL 20pM文库加1222μL HT1缓冲液。
(7)上样:1.3μL样品加入到测序试剂盒样品孔⑩;读取1(Read 1)测序引物加入到⑦;读取2(Read 2)测序引物加入到⑧;标签1(Index 1)测序引物加入到⑨。
(8)样品上机测序,设置测序方式为Read Type:Paired End,Read Length:Read1:65bp(测ChIP DNA序列)、Read 2:11bp(测单细胞身份标签)、Index 1:8bp(测文库身份标签),Custom Primers包括Read 1、Read 2、Index 1。当上机测序的文库混合样品通过一个文库标签(Index 1)就可以区分开时,可以不测第二个标签(Index 2)。
以上实施例中所使用到的试剂配方见表9。
表9试剂配方
如图7单细胞特异性位点高通量测序结果示意图所示,图中从上到下依次展示了大量细胞的ChIP-seq峰型(阳性对照)、合并在一起的单细胞ChIP-seq的峰型以及12个单细胞ChIP-seq的峰型,从结果可以看出,单细胞ChIP-seq中检测到的信号基本落在大量细胞的ChIP-seq的峰(信号)内。说明了该单细胞ChIP-seq技术的可靠性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种单细胞ChIP-seq文库的添加物及制备方法
<130> 20210810
<160> 117
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctatgaggct agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 39
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcagaatc agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 40
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcactacga agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttgtcgtag agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaccactta agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgttgtccg agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctatccatat agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcttgcgc agatgtgtat aagagacag 59
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<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagtatctt agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgacgctcc agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgacgctcc agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttgcattgc agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctattggaac agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 51
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgccaaggt agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcgagatat agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 53
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttagagcgc agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 54
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaacctgtt agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggttcacc agatgtgtat aagagacag 59
<210> 56
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 56
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcattgttg agatgtgtat aagagacag 59
<210> 57
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 57
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttgccacca agatgtgtat aagagacag 59
<210> 58
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 58
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgttcgccg agatgtgtat aagagacag 59
<210> 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 59
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcacgagcg agatgtgtat aagagacag 59
<210> 60
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 60
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacgccgca agatgtgtat aagagacag 59
<210> 61
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 61
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtattatg agatgtgtat aagagacag 59
<210> 62
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 62
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgatagatc agatgtgtat aagagacag 59
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<400> 63
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagcgagct agatgtgtat aagagacag 59
<210> 64
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 64
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcagttccg agatgtgtat aagagacag 59
<210> 65
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<400> 65
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttgacctta agatgtgtat aagagacag 59
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<400> 66
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctctaggcaa agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttcgaatgg agatgtgtat aagagacag 59
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<400> 68
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcttagtgt agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttccgacac agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaacaggaa agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggtgaagg agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcctgtggc agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctttcacaat agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacacgagt agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgtagac agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgttaattg agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaccggcca agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggagtact agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaagacgtc agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtctcgca agatgtgtat aagagacag 59
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctactctatg agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcgcctgt agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctatattcac agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctctacagtt agatgtgtat aagagacag 59
<210> 85
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<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttcgtgacc agatgtgtat aagagacag 59
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<213> unknown comment
<400> 86
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggaagcag agatgtgtat aagagacag 59
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<213> unknown comment
<400> 87
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaggatga agatgtgtat aagagacag 59
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<213> unknown comment
<400> 88
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttataacct agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcgcggttc agatgtgtat aagagacag 59
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 90
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctttggtgag agatgtgtat aagagacag 59
<210> 91
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 91
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctccaacaga agatgtgtat aagagacag 59
<210> 92
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 92
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgcgata agatgtgtat aagagacag 59
<210> 93
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 93
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacatagcg agatgtgtat aagagacag 59
<210> 94
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<213> unknown comment
<400> 94
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgaacatac agatgtgtat aagagacag 59
<210> 95
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<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 95
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcgcagacg agatgtgtat aagagacag 59
<210> 96
<211> 59
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 96
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaggtgcgt agatgtgtat aagagacag 59
<210> 97
<211> 59
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 97
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttatgagta agatgtgtat aagagacag 59
<210> 98
<211> 59
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 98
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgatatcga agatgtgtat aagagacag 59
<210> 99
<211> 59
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 99
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctagcgctag agatgtgtat aagagacag 59
<210> 100
<211> 52
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 100
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagatgtg tataagagac ag 52
<210> 101
<211> 57
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 101
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tagaggcaca ctctttccct acacgac 57
<210> 102
<211> 57
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 102
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg gctctgaaca ctctttccct acacgac 57
<210> 103
<211> 54
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 103
caagcagaag acggcatacg agattctccg gagtgactgg agttcagacg tgtg 54
<210> 104
<211> 54
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 104
caagcagaag acggcatacg agataatgag cggtgactgg agttcagacg tgtg 54
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 105
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 106
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 107
<211> 33
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 107
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 108
<211> 34
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 108
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 109
<211> 33
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 109
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33
<210> 110
<211> 19
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 110
tttctgcgtc ctaactgct 19
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 111
cgtccattct cgctacaag 19
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 112
ttggggtgag gaacaacttt a 21
<210> 113
<211> 19
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 113
tgagtggtca cggtggagc 19
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 114
accgacccct tcagtagacc 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 115
cgcattcctt acaccgttcc 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 116
tgcagaattc ctcgttgaca 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown comment
<400> 117
ggctcagggg gaaaataaga 20
Claims (10)
1.一种制备单细胞ChIP-seq文库的添加物,其特征在于,所述添加物包括辅助DNA添加物和抗原类似物。
2.如权利要求1所述的添加物,其特征在于,所述辅助DNA添加物以噬菌体DNA为模板、以dATP、dUTP、dCTP、dGTP为原料,通过特异引物PCR扩增获得;所述PCR扩增正向引物如序列表SEQ ID NO:1所示,反向引物如序列表SEQ ID NO:2所示;所述PCR产物长度为87bp;所述抗原类似物能与抗体特异性结合。
3.如权利要求2所述的添加物,其特征在于,所述抗原类似物为包含所结合的抗体氨基酸的多肽,所述多肽包括组蛋白H3K4三甲基多肽或者组蛋白H3K27乙酰基多肽。
4.一种单细胞ChIP-seq文库制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤一、Tn5转座元件组装,合成一段同时带有Tn5寡核苷酸、细胞身份标签和测序引物接头的DNA片段,与Tn5转座酶组装,即形成Tn5转座子;
步骤二、细胞经过甲醛固定后,用流式细胞仪分配单细胞到96孔板中,利用步骤一获得的Tn5转座子,对每个细胞进行身份标记,得到完成身份标记的细胞;
步骤三、在步骤二获得的完成身份标记的细胞中补加含有dUTP的λDNA,将所有所述单细胞合并到一个离心管中;
步骤四、通过非接触式超声,释放所述单细胞中的染色质DNA,收集所述染色质DNA;
步骤五、取特异性抗体与免疫磁珠孵育、结合,得到“抗体-磁珠”复合物;
步骤六、在步骤四收集的染色质DNA中加抗原类似物,一起与步骤五所得“抗体-磁珠”复合物共同孵育过夜,进行免疫共沉淀反应,得到免疫共沉淀反应物;
步骤七、用缓冲液洗去步骤六得到的免疫共沉淀反应物中的非特异性结合物后,得到样品液,用蛋白酶K对所述样品液进行解交联,得到ChIP DNA初溶液;
步骤八、在步骤七所述的ChIP DNA初溶液中补加辅助DNA添加物,然后用混合酚抽提、乙醇沉淀来纯化收集ChIP DNA;
步骤九、用USER(尿嘧啶DNA糖基化酶UDG和DNA糖基化酶-裂解酶Endo VIII的混合物)去除添加的补加辅助DNA添加物;
步骤十、用可以识别步骤一中所述测序引物接头的引物,对步骤八获得的ChIP DNA进行扩增,完成测序文库的构建;
步骤十一、上机测序与数据分析。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤五中取所述特异性抗体5μg,所述免疫磁珠20μL;所述步骤六中加入所述抗原类似物0.1ng。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤五中所述特异性抗体包括H3K27ac;所述步骤六中加入的所述抗原类似物为组蛋白H3K27乙酰基多肽。
7.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤五中所述特异性抗体还包括H3K4me3;所述步骤六中加入的所述抗原类似物为组蛋白H3K4三甲基多肽。
8.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤二中所述Tn5转座酶与带有不同序列标签的所述DNA片段组装后,在打断染色质的同时在染色质片段两端添加所述序列标签,所述序列标签带有特异扩增引物的结合位点。
9.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤二中所述Tn5转座酶,识别一段特异性DNA序列Tn5寡核苷酸,并将其随机插入到基因组DNA中。
10.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤八中所述混合酚为等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合。
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