CN107787371A - 检测和定量次要变体的并行式方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于检测具有低丰度变体和高丰度变体的多种靶核酸变体的存在与否和量的并行式方法。

Description

检测和定量次要变体的并行式方法

相关专利申请

本专利申请要求2015年4月25日提交的题为“检测和定量次要变体的并行式方法”，以Anders Nygren为发明人且以律师案卷号AGB-6071-PV指定的美国临时申请第62/152,698号的权益。另外，本申请涉及2012年7月17日提交的名为“用于并行式核酸鉴定的产品和方法”，以Christiane Honisch、Dirk J.Van Den Boom、Michael Mosko和AndersNygren为发明人且以律师案卷号AGB-6020-CT2t指定的美国专利申请号13/551,486，其是2012年5月18提交的名为“用于并行式核酸鉴定的产品和方法”，以Christiane Honisch、Dirk Johannes Van Den Boom、Michael Mosko和Anders Nygren为发明人的国际专利申请号PCT/US2012/038710的继续申请。前述专利申请的全部内容通过引用纳入本文，包括其文本、表格和附图。

技术领域

该技术部分涉及核酸鉴定方法，其中可以在一个过程中检测多重靶核酸。该技术还部分涉及核酸修饰的鉴定。

背景技术

检测特异性核酸是诊断医学和分子生物学研究的重要工具。当前，核酸试验在例如鉴定感染生物体(如细菌和病毒)，探测正常基因的表达和鉴定突变基因(如致癌基因)，组织移植前针对相容性的组织分型，为法医学所进行的组织和血液样品匹配，以及对不同物种的基因进行同源性分析中起作用。

发明内容

在一些方面提供了用于检测多种核酸的变体存在与否的并行式方法，其包括制备(a)衍生自多种靶核酸或其部分的多种扩增子，其中各种靶核酸序列含有低丰度的变体和高丰度的变体。扩增子与多种寡核苷酸在单一反应中杂交从而生成杂交的寡核苷酸，各种寡核苷酸与靶核酸的扩增子各自特异性对应，其中(i)寡核苷酸与衍生自靶核酸的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5’位置处杂交，所述靶核酸低丰度变体的单碱基位置与所述高丰度变体的所述单碱基位置不同，(ii)多种靶核酸的各高丰度变体位于单碱基位置的核苷酸相同或不同，(iii)多种靶核酸低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸都相同，并且(iv)多种靶核酸的高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸与所述多种靶核酸的低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸无一相同。将杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包括针对低丰度变体特异性的终止核苷酸和针对一种或多种高丰度变体特异性的一个、两个或三个终止核苷酸；其中：(i)终止核苷酸包括捕获剂，(ii)针对高丰度变体特异性的一个、两个或三个终止核苷酸各自的浓度是相对于针对低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.1％至30％，(iii)延伸条件包括多重热循环，从而生成含有针对多种靶核酸的低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸，和含有针对多种靶核酸的高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸。将延伸的寡核苷酸与固相在捕获剂与固相相互作用的条件下接触，从而在固相上捕获延伸的寡核苷酸，其中所述固相包括捕获剂的结合伴侣，并通过在升高的温度条件下将固相与竞争物接触，释放延伸的寡核苷酸，其中所述竞争物含有与固相相互作用的捕获剂的游离形式。检测释放的延伸的寡核苷酸；从而检测多种核酸的变体存在与否。

在某些方面还提供了一种包括一种或多种延伸的寡核苷酸的方法，所述延伸的寡核苷酸含有当含有针对低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸未被检测到时，针对高丰度变体特异性的终止核苷酸作为假阴性结果的阳性对照。

在某些方面还提供了一种用于确定各种靶核酸相对于高丰度变体量的低丰度变体量的方法，其包括基于低丰度变体特异性终止核苷酸浓度和高丰度变体特异性终止核苷酸浓度之比的标准化。

下述说明、实施例、权利要求和附图中进一步描述某些实施方式。

附图简要说明

附图描述本技术的某些实施方式，但不具限制性。为了说明的清楚和方便，附图未按比例制作，并且在一些情况中，可能夸大或放大多个方面以协助对具体实施方式的理解。

图1示出了用于检测多种核酸的变体存在与否的并行式方法的一个实施方式的示意图。多重PCR后是单碱基延伸反应。该延伸反应由最少两个链终止核苷酸组成，其中一个靶向较多丰度变体(主要变体)，另一个靶向较少丰度变体(次要变体)。在延伸多种靶核酸的主要和次要变体的并行式反应中(未显示)，可以使用至多4个靶向任何可能的碱基组合的链终止核苷酸(低丰度变体的单一终止核苷酸和高丰度变体的1、2或3个不同的终止核苷酸)。以比靶向次要变体的链终止剂低的浓度提供靶向主要变体的链终止剂的浓度(大约是次要变体的链终止剂浓度的0.5％-10％)。延伸反应利用标记了用于固相捕获的部分的特定链终止剂。捕获和洗涤之后，分析洗脱的产物的质量，并且使用MALDI-TOF质谱分析法鉴定并表征靶核酸的主要和次要变体。通过将次要变体(突变体)信号与主要变体(野生型)信号的分数或比例值标准化进行定量。

具体实施方式

本文所述用于确定多种靶核酸存在与否的方法可由本领域普通技术人员(以下称为“普通技术人员”)找到多种用途。该方法可用于，例如：(a)快速确定样品中是否存在特定靶序列(例如，包含遗传变异的靶序列)；(b)进行混合物分析，例如鉴定混合物和/或其组合物或确定混合物中靶序列的频率(例如，混合群落，准种)；(c)检测样品中的序列变异(例如，突变，单核苷酸多态性)；(d)进行单倍型试验；(e)进行微生物(例如，病原体)分型；(f)检测样品中微生物靶序列的存在与否；(g)识别疾病标志物；(h)检测微卫星；(i)识别短串联重复；(j)识别一种或多种生物体；(k)检测等位变异；(l)确定等位基因频率；(m)确定甲基化模式；(n)进行表观遗传试验；(o)重新序列生物分子的区域；(p)在人类临床研究和医学中进行分析(例如，癌症标志物检测，序列变异检测；对特定药物给药有利或不利的序列特征的检测)，(q)进行HLA分型；(r)进行取证分析；(s)进行疫苗质量控制分析；(t)监测治疗；(u)进行矢量特征分析；(v)进行疫苗或生产菌株质量控制和(w)测试菌株特征(x)植物。这些方法也可以用于，例如，各种领域，包括但不限于商业，教育，医疗，农业，环境，疾病监测，军事防御和法医领域。

本文所述方法提供了低浓度的针对延伸靶核酸的高丰度变体(主要变体)特异性的链终止剂，以及高浓度的针对延伸靶核酸的低丰度变体(次要变体)特异性的链终止剂。本文所述方法因此提供了针对假阴性结果的阳性对照，允许对低丰度变体进行定量，并且对检测低丰度变体(次要变体)的存在与否具有高灵敏度。将多种靶核酸分组，以使得相同的链终止剂可以特异性地延伸允许并行式的各种靶核酸的低丰度变体(次要变体)。

在一些实施方式中提供了用于检测多种核酸物种的变体存在与否的并行式方法，所述核酸物种各自具有低丰度变体和高丰度变体，所述方法包括扩增反应，延伸反应，其产生含有针对低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸和含有针对高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸，延伸的寡核苷酸的捕获和释放以及检测延伸的寡核苷酸(参见图1)。在一些实施方式中，提供了针对假阴性结果的阳性对照。在一些实施方式中，提供了定量低丰度变体的方法。

靶核酸

如本文所用的术语“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸，包括但不限于，天然核酸(例如，脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA))，合成核酸，非天然核酸(例如，肽核酸(PNA))，未修饰的核酸，经修饰的核酸(例如，甲基化DNA或RNA，标记的DNA或RNA，具有一个或多个修饰的核苷酸的DNA或RNA)。以“多核苷酸”提及核酸是指通过共价键连接的两个或更多个核苷酸或核苷酸类似物。核酸可以是适用于本文所述方法的任何类型的核酸。某些实施方式中的核酸可以是DNA(例如，互补DNA(cDNA)，基因组DNA(gDNA)，质粒和载体DNA等)，RNA(例如，病毒RNA，消息RNA(mRNA)，短抑制性RNA(siRNA)，核糖体RNA(rRNA)，tRNA等)和/或DNA或RNA类似物(例如，含有碱基类似物，糖类似物和/或非天然骨架等)。核酸可以是可用于进行本文所述方法的任何形式(例如线性、环状、超螺旋、单链、双链等)。在某些实施方式中，核酸可以是或可以来自，质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体、细胞、细胞核或细胞的胞质。在一些实施方式中，核酸来自单个染色体(例如，核酸样品可来自从二倍体生物所得样品的一个染色体)。在胎儿核酸的情况下，核酸可以来自父系等位基因，母系等位基因或母系和父系等位基因。

如本文中关于靶核酸、扩增子、引物、序列标签、多核苷酸或寡核苷酸所使用的术语“物质”是指当核苷酸序列进行比对时，具有与来自另一核酸的核苷酸序列有一个或多个核苷酸差异的核苷酸序列的核酸。因此，当比对时，两种物质的序列相差一个或多个核苷酸(例如，约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或大于100个核苷酸差异)时，第一核酸与第二核酸不同。在某些实施方式中，核酸，如靶核酸、扩增子或延伸的寡核苷酸的数量，包括但不限于约2至约10000种核酸，约2至约1000种核酸，或约2至约500种核酸，或有时约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种核酸。

在一些实施方式中，寡核苷酸与核酸模板(例如，扩增子)杂交，从而形成双链核酸，并且与模板杂交的寡核苷酸在本文中称为杂交寡核苷酸。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸可以包含一个或多个不与模板杂交的核苷酸。例如，杂交的寡核苷酸可包含一个或多个错配的核苷酸(例如，非互补核苷酸)，并且有时可包含不杂交的核苷酸的5’和/或3’区域。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸包括标签(例如，质量可区分的标签、序列标签、发光标签或放射性标签)。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸包含捕获剂(例如，生物素或结合对的任何成员)。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸包含终止核苷酸。

如本文所用，术语“核苷酸”是指天然和非天然核苷酸。核苷酸包括但不限于天然存在的核苷单-，二-和三磷酸酯：脱氧腺苷单-，二-和三磷酸酯；脱氧鸟苷单-，二-和三磷酸酯；脱氧胸苷单-，二-和三磷酸酯；脱氧胞苷单-，二-和三磷酸酯；脱氧尿苷单-，二-和三磷酸酯；和脱肌苷单-，二-和三磷酸酯(本文中分别称为dA，dG，dT，dC，dU和dI，或A，G，T，C，U和I)。核苷酸还包括但不限于修饰的核苷酸和核苷酸类似物。修饰的核苷酸和核苷酸类似物包括但不限于，去氮嘌呤(deazapurine)核苷酸，例如7-去氮-脱氧鸟苷(7-脱氮-dG)和7-脱氮-脱氧腺苷(7-脱氮-dA)单-，二-和三磷酸脂，氘代-脱氧胸苷(氘代-dT)单-，二-和三磷酸酯，甲基化核苷酸，例如，5-甲基脱氧胞苷三磷酸酯，13C/15N标记的核苷酸和脱氧肌苷单-，二-和三磷酸酯。可以使用各种功能和附着位置的组合来获得修饰的核苷酸，同位素富集的核苷酸，耗尽的核苷酸，带标签和标记的核苷酸和核苷酸类似物。

本文中关于核酸使用的术语“组合物”是指包括一种或多种核酸的有形物。组合物有时是从来源提取的样品，而且是来源处的所有样品的组合物，并且有时是一种或多种核酸的来源。组合物可以包含核酸。在一些实施方式中，组合物可以包含基因组DNA。在一些实施方式中，组合物可以包含母体DNA，胎儿DNA或母体和胎儿DNA的混合物。在一些实施方式中，组合物可以包含基因组DNA的片段。在一些实施方式中，组合物可以包含衍生自病毒，细菌，酵母，真菌，哺乳动物或其混合物的核酸。

核酸样品可以衍生自一个或多个来源。例如，可以从生物体、矿物或地质场地(例如，土壤，岩石，矿物沉积物，化石)或法医现场(例如，犯罪现场，违禁品或疑似违禁品)收集样品。因此，来源可能是环境的，例如地质，农业，战区或土壤来源。来源还可以来自任何类型的生物体，例如任何植物、真菌、原生生物、原核生物、病毒或动物，包括但不限于人，非人，哺乳动物，爬行动物，牛，猫，狗，山羊，猪，猪，猴，猿，大猩猩，公牛，牛，熊，马，羊，家禽，小鼠，大鼠，鱼，海豚，鲸鱼和鲨鱼，或任何可能具有可检测核酸的动物或生物体。来源还可以指生物体的不同部分，例如，内部、外部、活或非活细胞、组织、流体等。因此，样品可以是“生物样品”，其是指从活来源或以前活来源获得的任何材料，例如，动物如人或其他哺乳动物，植物，细菌，真菌，原生生物或病毒。来源可以是任何形式，包括但不限于固体材料，例如组织，细胞，细胞沉淀，细胞提取物或活检，或生物流体如尿液，血液，唾液，羊水，来自感染或炎症区域的渗出液，或含有颊细胞的口腔清洗液，头发，脑脊髓液和滑液以及器官。样品还可以在与另一样品不同的时间点分离得到，其中各样品来自相同或不同的来源。核酸可来自核酸文库，例如cDNA或RNA文库。核酸可以是样品中核酸分子的核酸纯化或分离和/或扩增的产物。提供用于本文所述的序列分析方法的核酸可以包含来自一个样品或两个或更多个样品的核酸(例如，来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多样品)。

可以以多种方式处理核酸。例如，可以将核酸的尺寸减小(例如，剪切，由核酸酶或限制酶消化，去磷酸化，去甲基化)，尺寸增加(例如，磷酸化，与甲基化特异试剂反应，附着于可检测标记物)，用核酸切割抑制剂处理等。

在某些实施方式中，核酸可以不进行处理而被提供用于进行本文所述的方法。在一些实施方式中，提供核酸用于在处理后进行本文所述的方法。例如，可从样品提取、分离、纯化或扩增核酸。如本文所用术语“分离”指将核酸从其原始环境中取出(例如，天然发生核酸的天然环境，或外源表达核酸的宿主细胞)，因此核酸从其原始环境通过“人工”而被改变。与来源样品中的组分含量相比，分离的核酸一般带有较少的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质)。包含分离核酸的组合物可以是基本分离的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分)。本文所用术语“纯化”是指提供的核酸与其所衍生自的样品来源相比包含更少的核酸种类。包含核酸的组合物可以是基本纯化的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含其它核酸种类)。

核酸可以通过，在某些实施方式中，在为本文所述的方法提供核酸之前产生核酸片段的方法进行处理。在一些实施方式中，经过片段化或剪切的核酸可具有约5-约10,000个碱基对、约100-约1.00个碱基对、约100-500个碱基对或约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个碱基对的标称、平均或等比中数长度。可通过本领域已知的任何合适方法产生片段，且核酸片段的平均、等比中数或标称长度可通过选择适当的片段生成方法而加以控制。在某些实施方式中，较短长度的核酸可用来分析几乎不含序列变异和/或含有较大量的已知核苷酸序列信息的序列。在一些实施方式中，较长长度的核酸可用来分析含有较多序列变异和/或含有较少量未知核苷酸序列信息的序列。

如本文所用，术语“靶核酸”或“…种靶核酸”指样品中任何感兴趣的核酸。靶核酸包括但不限于(i)在两种或更多种可能的等位基因中的特定等位基因，和(ii)具有或不具有特定突变，核苷酸取代，序列变异，重复序列，标志或区别序列的核酸。如本文所用，术语“不同的靶核酸”指通过一个或多个特征不同的核酸。如本文所用，术语“遗传变异”是指通过一个或多个特征不同的核酸。如本文所用，术语“变体”是指通过一个或多个特征不同的核酸。特征包括不限于，一个或多个甲基或甲基化状态，一个或多个磷酸基团，一个或多个乙酰基，以及一个或多个核苷酸的一个或多个缺失、添加或取代。一个或多个核苷酸的一个或多个缺失、添加或取代的示例包括但不限于特定突变的存在与否，核苷酸取代的存在与否(例如，单核苷酸多态性(SNP))，重复序列(例如，二，三，四，五核苷酸重复)的存在与否，标记物(例如，微卫星)的存在与否以及区分序列(例如，区分一种生物体与另一种生物体的序列(例如，区分一种病毒株与其他病毒株的序列))存在与否。可以通过任何已知的方法来区分不同的靶核酸，例如，通过质量、结合、可区分标签等，如本文所述。

在一些实施方式中，一个变体可以比其它变体具有更大的丰度。在一些实施方式中，最大丰度的变体被称为野生型变体。在一些所述方法中，靶核酸包含第一和第二变体，其中第二变体表示出更大的丰度(存在更多的模板)，即高丰度变体和低丰度变体或主要变体和次要变体。以更大的丰度表示的变体通常以更高的浓度存在，或者当与另一种变体相比时由更多数量的分子(例如，拷贝)表示。更高的浓度可以是2倍以上。在一些实施方式中，更高的浓度为10倍或更多。在一些实施方式中，更高的浓度为100倍、1000倍或10000倍或更多。在一些实施方式中，第二变体表示野生型序列，并且以比第一变体高100倍或更高的浓度存在。在一些所述方法中，第一变体(低丰度变体)以显著低于第二变体(例如，野生型，高丰度变体)的浓度表示，其中第一变体表示较少的靶核酸。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占少于靶核酸的30％、20％、15％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.8％、0.75％、0.5％、0.1％、.05％、.01％或更少的低丰度变体的存在与否。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占靶核酸的约5％至约0.75％之间的低丰度变体的存在与否。在一些实施方式中，本文提供的方法可以用于检测占少于试验的总核酸的30％、20％、15％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.8％、0.75％、0.5％、0.1％、.05％、.01％或更少的低丰度变体的存在与否。在实施方式中，低丰度变体以相对于高丰度变体拷贝数的约1％或约2％至小于10％的拷贝数存在。在实施方式中，低丰度变体以高丰度变体拷贝数的2％或更小的拷贝数存在。在一些实施方式中，对各种靶核酸，低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000拷贝(分子)，并且低丰度变体占总拷贝数的0.1％。

本文所用术语“多种靶核酸”或“多种靶核酸物质”指超过一种靶核酸。在某些实施方式中，多种靶核酸可以是约2至约10000种核酸，约2至约1000种核酸，约2至约500种核酸，或有时约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种核酸。在某些实施方式中，通过本文所述的方法检测约50种或更多种靶核酸的存在与否。在一些实施方式中，检测约100种或更多种、150种或更多种、200种或更多种、250种或更多种、300种或更多种、325种或更多种、350种或更多种、375种或更多种、400种，或更多种、425种或更多种、450种或更多种、475种或更多种或500种或更多种靶核酸。在一些实施方式中，通过本文所述的方法检测约2种至500种(例如，约5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450种靶核酸)靶核酸的存在、不存在或量。在一些实施方式中，靶核酸是基因组DNA(例如，人、微生物、病毒、真菌或植物基因组DNA；任何真核生物或原核生物核酸(RNA和DNA))。

核酸的检测或鉴定导致对靶标的检测，并且可以指示特定突变、序列变异(突变或多态性)或遗传变异(例如，序列变异、序列差异或多态性)的存在与否。在多种靶核酸中，可以进行对相同或不同的靶核酸的检测。就鉴定而言，还可以对多种靶核酸进行定量鉴定以及定性鉴定。同样指如下的并行式。

扩增和延伸

在一些实施方式中，可以对核酸(例如，靶核酸)进行扩增。如本文所用，术语“扩增”及其语法变体是指产生模板核酸拷贝的方法。例如，核酸模板可以进行线性或指数生成具有与模板的核苷酸序列相同或基本上相同的核苷酸序列或模板的一部分的两个或多个核酸扩增子(拷贝)的过程。在某些实施方式中，核酸扩增通常是特异性的(例如，扩增子具有相同或基本上相同的序列)，并且有时可以是非特异性的(例如，扩增子具有不同的序列)。当样品中存在的靶序列的量低时，核酸扩增有时是有益的。通过扩增靶序列并检测合成的扩增子，可以提高试验的灵敏度，因为在用于检测靶核酸的试验开始时需要较少的靶序列。在某些实施方式中，在延伸寡核苷酸杂交之前，靶核酸有些时候未经扩增。

扩增条件是已知的，并且可以针对将被扩增的特定核酸选择。扩增条件包括某些试剂，其中一些可以包括但不限于，核苷酸(例如，核苷酸三磷酸酯)，修饰的核苷酸，寡核苷酸(例如，用于基于聚合酶的扩增的引物寡核苷酸和用于基于连接酶的扩增的寡核苷酸构建块)，一种或多种盐(例如，含镁盐)，一种或多种缓冲剂，一种或多种聚合剂(例如，连接酶，聚合酶)，一种或多种切口酶(例如，切割双链核酸的一条链的酶)和一种或多种核酸酶(例如，外切核酸酶，内切核酸酶，RNA酶)。可以使用适合于扩增的任何聚合酶，例如具有或不具有核酸外切酶活性的聚合酶，DNA聚合酶和RNA聚合酶，例如这些酶的突变体形式。可以使用适于将一个寡核苷酸的5'连接到另一寡核苷酸的3'端的任何连接酶。扩增条件还可包括某些反应条件，例如，等温或温度循环条件。在扩增过程中循环温度的方法是已知的，例如，通过使用热循环装置。术语“循环”是指利用单个引物或多个引物进行扩增(例如，扩增反应或延伸反应)，其中使用温度循环。在一些实施方式中，扩增条件也可以包括乳剂(例如，油)，其可以用于形成其中可以扩增单个核酸分子的多个反应室。扩增有时是指数产物生成过程，并且有时是线性产物生成过程。

在一些实施方式中，扩增反应包括重复多个温度循环以扩增靶核酸的量。在一些实施方式中，扩增反应循环2次或更多次。在一些实施方式中，扩增反应循环10次或更多次。在一些实施方式中，扩增反应循环约10、15、20、50、100、200、300次或更多次。在一些实施方式中，扩增反应循环20至50次。在一些实施方式中，扩增反应循环30至45次。

可以扩增单链核酸靶标的链，并且可以扩增双链核酸靶标的一条或两条链。在一些实施方式中，扩增产物(扩增子)长度为约10个核苷酸至约10,000个核苷酸，长度为约10至约1000个核苷酸，长度为约10至约500个核苷酸，长度为10至约100个核苷酸，并且有时长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。

可以选择任何合适的扩增技术和扩增条件用于特定核酸进行扩增。已知的扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、延伸和连接、连接扩增(或连接酶链反应(LCR))和基于使用Q-β复制酶或模板依赖性聚合酶的扩增方法(参见美国专利公开号US20050287592)。还可以使用链置换扩增(SDA)、嗜热SDA、基于核酸序列的扩增(3SR或NASBA)和转录相关扩增(TAA)。用于进行扩增方法的试剂、装置和硬件是可商购的，并且扩增条件是已知的，并且可以选择手头的靶核酸。

在某些实施方式中，可以通过使用通用引物实现基于聚合酶的扩增。在这些过程中，与一个或多个通用引物杂交的杂交区域被并入模板核酸中。可以将这样的杂交区域并入(i)与靶核酸杂交并延伸的引物，和/或(ii)连接到例如靶核酸或(i)的产物的寡核苷酸(例如，使用连接酶连接)。涉及通用引物的扩增方法可以提供例如仅使用一个或两个扩增引物扩增多种靶核酸的优点。

在某些实施方式中，可以延伸某些核酸。本文所用的术语“延伸”和其语法变体是指延长核酸的一条链。例如，在某些实施方式中，可延伸与靶核酸或由靶核酸产生的扩增子杂交的寡核苷酸。延伸反应在延伸条件下进行，并且各种这样的条件是已知的并且针对特定应用选择。延伸条件包括某些试剂，包括但不限于一种或多种寡核苷酸，延伸核苷酸(例如，核苷酸三磷酸酯(dNTP))，终止核苷酸(例如，一种或多种双脱氧核苷酸三磷酸酯(ddNTP))，一种或多种盐(例如，含镁盐)，一种或多种缓冲液(例如，使用β-NAD，曲通X-100)，和一种或多种聚合剂(例如，DNA聚合酶、RNA聚合酶)。在某些实施方式中，延伸可以在等温条件下或在非等温条件下进行(例如，热循环条件)。一种或多种核酸可以在延伸反应中延伸，并且各核酸的一个或多个分子可以被延伸。核酸可以延伸一个或多个核苷酸，并且在一些实施方式中，延伸产物长度为约10个核苷酸至约10,000个核苷酸，长度为约10至约1000个核苷酸，长度为约10至约500个核苷酸，长度为约10至约100个核苷酸，并且有时长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。结合终止核苷酸(例如ddNTP)，杂交位置或其他因素可以确定寡核苷酸延伸的长度。在某些实施方式中，扩增和延伸过程在相同的检测过程中进行。

在一些实施方式中，延伸反应包括重复多个温度循环以扩增反应中延伸产物的量。在一些实施方式中，延伸反应循环2次或更多次。在一些实施方式中，延伸反应循环10次或更多次。在一些实施方式中，延伸反应循环10、15、20、50、100、200、300、400、500或600次或更多次。在一些实施方式中，延伸反应循环20至50次。在一些实施方式中，延伸反应循环20至100次。在一些实施方式中，延伸反应循环20至300次。在一些实施方式中，延伸反应循环至少50次。

在一些实施方式中，靶核酸(例如，靶核酸、寡核苷酸、杂交的寡核苷酸或扩增子)在延伸组合物的存在下延伸，其中靶核酸延伸一个核苷酸。延伸组合物可以包含一种或多种缓冲液，盐，酶(例如，聚合酶，Klenow等)，水，模板(例如，DNA，RNA，扩增子等)，引物(例如，寡核苷酸)，核苷酸三磷酸酯，甘油，大分子排阻分子和本领域中使用的任何其它添加剂。延伸组合物可以包括终止核苷酸(例如，双脱氧核苷酸(例如ddNTP))，非终止或延伸核苷酸(例如，dNTP)或终止核苷酸和非终止核苷酸的混合物。基本上由一种或多种特定终止核苷酸组成的延伸组合物可以含有延伸组合物的任何其它组分(例如，缓冲液，盐，模板，引物等)，但除了上述的那些以外，不含任何其它终止核苷酸或核苷酸三磷酸酯(例如，dNTP)。例如，基本上由ddTTP和ddCTP组成的延伸组合物不含ddATP，ddGTP或任何其他dNTP。在一些实施方式中，延伸组合物中的核苷酸仅为终止核苷酸，并且靶核酸延伸一个核苷酸(即，延伸组合物中有时不存在延伸核苷酸)。在一些实施方式中，延伸组合物基本上由终止核苷酸(例如，ddNTP)组成。在一些实施方式中，终止核苷酸包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多种)捕获剂。在一些实施方式中，终止核苷酸包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多种)不同的捕获剂。在一些实施方式中，终止核苷酸包含(例如，是共价结合)一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多个)捕获剂分子。在一些实施方式中，终止核苷酸包含一个捕获剂分子。在一些实施方式中，第一终止核苷酸包含捕获剂，第二终止核苷酸包含不同的捕获剂。在一些实施方式中，延伸组合物包含一种或多种终止核苷酸，其中各终止核苷酸各包含不同的捕获剂。在一些实施方式中，延伸组合物包含一种或多种终止核苷酸，其中各终止核苷酸各包含捕获剂并且捕获剂都相同。在一些实施方式中，延伸组合物包括终止核苷酸和延伸核苷酸，并且核苷酸(例如，终止核苷酸和/或延伸核苷酸)中的一种或多种包括捕获剂。在一些实施方式中，终止核苷酸包括捕获剂，并且捕获剂是生物素或生物素类似物在一些实施方式中，延伸组合物基本上由结合一种或多种捕获剂的终止核苷酸组成。在一些实施方式中，捕获剂是生物素或生物素类似物。

可以选择和利用任何合适的延伸反应。可以采用延伸反应，例如，通过将脱氧核苷酸和/或双脱氧核苷酸掺入到与靶核酸中与SNP位点相邻的区域杂交的延伸寡核苷酸来区分SNP等位基因。引物通常用聚合酶延伸。在一些实施方式中，寡核苷酸仅延伸与SNP位点互补的一个脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸可以通过掺入dNTP延伸，并通过ddNTP终止，或者在某些实施方式中通过ddNTP掺入而终止但没有dNTP延伸。在一些实施方式中，在延伸反应中使用的一种或多种dNTP和/或ddNTP被标记有允许固化至固体支持物的部分(如，生物素)。在一些实施方式中，可以使用以下来进行延伸：未修饰的延伸寡核苷酸和未修饰的双脱氧核苷酸，未修饰的延伸寡核苷酸和生物素化的双脱氧核苷酸，含有脱氧肌苷的延伸寡核苷酸和未修饰的双脱氧核苷酸，含有脱氧肌苷的延伸寡核苷酸和生物素化的双脱氧核苷酸，通过生物素化的双脱氧核苷酸延伸或通过生物素化的脱氧核苷酸和/或未修饰的双脱氧核苷酸延伸。

在一些实施方式中，寡核苷酸可以在杂交条件下与邻近遗传变异或变体的模板(例如，靶核酸)杂交(例如，寡核苷酸的3'末端可位于遗传变异位点的5'末端，并且可距离遗传变异位点的5'末端0至10个核苷酸)。在靶核酸的遗传变异位点上可能存在几种变体。遗传变异有时是单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸变体。几个单核苷酸变体可以存在于位于杂交的寡核苷酸3'的模板靶标上的单个碱基位置。几个单核苷酸变体可以因模板靶上位于杂交寡核苷酸的3'的位置处的单碱基而不同。在一些实施方式中，寡核苷酸在变体位置延伸一个核苷酸。在一些实施方式中，根据存在的变体的数量，寡核苷酸可以由五种终止核苷酸(例如ddATP，ddUTP，ddTTP，ddGTP，ddCTP)中的任何一种延伸。靶核酸及其变体或相应的扩增子可以作为模板，并且部分地可以确定在延伸反应中哪个终止核苷酸被加入到寡核苷酸中。

在一些实施方式中，试验中存在的靶物质低丰度变体的量相对于靶物质高丰度变体(例如，野生型)的量是根据表示低丰度变体和高丰度变体的延伸的寡核苷酸检测确定的。因为高丰度终止核苷酸的掺入被抑制，但是仍然是线性的，需要归一化系数进行高和低丰度变体之间真实比例的定量。在一些实施方式中，通过使用系数将低丰度变体的信号与高丰度变体的信号的比例归一化来对靶核酸的低丰度变体的量(例如，拷贝数、浓度、百分比)进行定量。该系数与针对高丰度变体特异性的终止核苷酸浓度相较针对低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的分数值成反比，即高丰度变体特异性终止核苷酸的分数值越低，系数越高。

在一些实施方式中，在延伸组合物中存在(或在一些实施方式中不存在)的终止核苷酸确定将哪个终止核苷酸加入到寡核苷酸中。在一些实施方式中，延伸组合物包含一种或多种终止核苷酸(例如，ddNTP)。在一些实施方式中，延伸组合物包含一种或多种终止核苷酸和一种或多种非终止核苷酸(例如，dNTP)。在一些实施方式中，延伸组合物包含对应特定变体(例如，第一变体，次要变体或低丰度变体)的终止核苷酸，并因此仅允许延伸该特定变体。在一些实施方式中，可以允许延伸第二变体(例如，野生型，主要变体或高丰度变体)的终止核苷酸包含在延伸组合物中，因此允许延伸第二变体。在一些实施方式中，方法包括将杂交的寡核苷酸与含有一种或多种终止核苷酸的延伸组合物在延伸条件下接触，其中(i)一种或多种终止核苷酸中的至少一种含有捕获剂，并且(ii)杂交第一变体(例如，低丰度变体，较不丰富的SNP变体，次要变体)的杂交寡核苷酸通过终止核苷酸延伸，并且杂交第二变体(例如，野生型，高丰度变体，主要变体)的杂交寡核苷酸通过终止核苷酸延伸，因此生成延伸的寡核苷酸。

本文所用的术语“信噪比”是指通过在使用检测过程(例如，质谱)时量化信号相对于噪声的强度的比例来定量测量信号质量。在一些实施方式中，一个光谱上的强度峰比由另一光谱上相同分析物(例如，延伸的寡核苷酸)产生的低强度峰具有更大的信噪比。在一些实施方式中，由高丰度变体(例如，野生型等位基因、第二变体、野生型变体)衍生的延伸的寡核苷酸产生噪音。在一些实施方式中，由低丰度变体(例如，第一变体，次要变体，突变变体，突变等位基因，SNP)衍生的延伸的寡核苷酸产生的信号被较丰富的延伸的寡核苷酸(例如，第二变体，高丰度变体，主要变体，野生型变体，野生型等位基因)产生的噪音所遮蔽，例如，当使用质谱时。本文中的“信噪比”中使用的术语“信号”是指延伸的寡核苷酸的信号峰的强度。在一些实施方式中，术语“信噪比”中使用的术语“信号”通常是指较不丰富的变体(例如，第一变体，低丰度变体，突变变体，突变等位基因，SNP)衍生的延伸的寡核苷酸的信号峰的强度。在一些实施方式中，允许延伸高丰度变体(例如，第二变体，野生型或较丰富的变体)的终止核苷酸包括在延伸组合物中，其以比允许延伸低丰度变体的终止核苷酸低很多的浓度存在(即，调整或偏斜浓度)，因此不降低低丰度变体(例如，第一变体，突变变体，突变等位基因，SNP)的信噪比。在一些实施方式中，方法包括将杂交的寡核苷酸与含有一种或多种终止核苷酸的延伸组合物在延伸条件下接触，其中(i)一种或多种终止核苷酸中的至少一种含有捕获剂，并且(ii)杂交低丰度变体(例如，次要变体、较不丰富的SNP变体)的杂交寡核苷酸通过终止核苷酸延伸，并且杂交高丰度变体(例如，野生型或主要变体)的杂交寡核苷酸通过以比低丰度变体的终止核苷酸浓度低的浓度提供的终止核苷酸延伸，因此相较于在不存在高丰度变体延伸的情况下只有低丰度变体的情况，不降低信噪比。

在一些实施方式中，在(f)中的检测得到的信噪比大于在没有竞争物的竞争的释放之后检测的信噪比。在一些实施方式中，与不包括竞争物的竞争的释放相比，当释放步骤(e)包括竞争物的竞争时在(f)中的检测包括信噪比的增加。

在一些实施方式中，利用偏斜或调整的终止浓度和竞争物使得低丰度或次要变体的检测增强。在一些实施方式中，可以以高丰度变体拷贝数的2％或更小的拷贝数对低丰度变体或次要变体进行检测。低丰度变体的检测限是约0.1％丰度。可以对低于3％丰度的低丰度变体进行定量。对具有大于5％丰度的低丰度变体的定量是受阻的，因为从低丰度变体获得的高信号减少来自高丰度变体的信号。

本文所用的术语“灵敏度”是指当使用检测过程(例如，质谱)时可以给定的信噪比检测的分析物的量。在一些实施例中，可以通过降低背景或噪音水平来提高灵敏度。在一些实施方式中，由较丰富的变体(例如，野生型等位基因、第二变体、野生型变体)衍生的延伸的寡核苷酸产生噪音。在一些实施方式中，当检测到衍生自较丰富的延伸的寡核苷酸(例如，第二变体，野生型变体，野生型等位基因)的延伸的寡核苷酸产生的信号但强度降低时，灵敏度增加。在一些实施方式中，可以允许延伸较丰富的变体(例如，野生型，高丰度变体，主要变体)的终止核苷酸以降低的浓度包含在延伸组合物中，所述降低的浓度不减小检测低丰度变体(例如，次要变体，突变变体，突变等位基因，SNP)的灵敏度。在某些实施方式中，针对高丰度变体特异性的终止核苷酸浓度是相对于针对低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的10％或更少。在某些实施方式中，针对高丰度变体特异性的终止核苷酸处于针对低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的约0.5％至少于约20％之间，约0.5％至少于约15％之间，约1％至约15％之间，约1％至约10％之间或约2％至约10％之间。在某些实施方式中，针对高丰度变体特异性的终止核苷酸浓度是相对于针对低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.1％至30％。在某些实施方式中，针对高丰度变体特异性的终止核苷酸浓度是相对于针对低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.5％至10％。在某些实施方式中，针对高丰度变体特异性的终止核苷酸浓度是相对于针对低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的1％至2％。

任何合适类型的核苷酸都可以并入扩增产物或延伸产物中。在一些实施方式中，核苷酸可以是天然存在的核苷酸，终止核苷酸或非天然存在的核苷酸(例如，核苷酸类似物或衍生物)。在一些实施方式中，某些核苷酸可以包括可检测的标记物和/或结合对的成员(例如，结合对的另一个成员可以连接至固相)。

可以对包含通过扩增方法产生的扩增子的溶液或含有通过延伸方法产生的延伸产物的溶液进行进一步处理。例如，可将溶液与从未掺入扩增子或延伸产物的游离核苷酸中除去磷酸部分的试剂接触。这种试剂的一个示例是磷酸酶(例如，碱性磷酸酶)。在一些实施方式中，碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。扩增子和延伸产物还可以与固相结合，可以被洗涤，可以与除去末端磷酸(例如，暴露于磷酸酶)的试剂接触，可以与除去末端核苷酸的试剂(例如，外切核酸酶)接触，可以与切割的试剂(例如，内切核酸酶，核糖核酸酶)接触等。

本文所用术语“寡核苷酸”是指通过共价键连接的两个或多个核苷酸或核苷酸类似物。寡核苷酸具有任何方便的长度，并且在一些实施方式中，长度为约5至约200个核苷酸，长度为约5至约150个核苷酸，长度为约5至约100个核苷酸，长度为约5至约75个核苷酸或长度为约5至约50个核苷酸，并且有时长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、或200个核苷酸。寡核苷酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，天然存在和/或非天然存在的核苷酸或其组合，及其任何化学或酶修饰(例如，甲基化DNA，修饰的核苷酸的DNA)。寡核苷酸的长度有时短于扩增子或靶核酸的长度，但不一定比用于扩增的引物或多核苷酸短。寡核苷酸通常包含与扩增子、靶核酸或其互补序列互补或基本互补的核苷酸子序列或杂交序列(例如，比对时与扩增子或靶核酸互补序列约95％、96％、97％、98％、99％或超过99％相同)。寡核苷酸可包含与扩增子、靶核酸或其互补序列不互补或基本上不互补的核苷酸子序列(例如，在与扩增子互补或基本互补的引物中核苷酸子序列的3'或5'末端处)。某些实施方式中的寡核苷酸可含有可检测分子(例如，标签，荧光团，放射性同位素，比色剂，颗粒，酶等)和/或(在某些实施方式中)结合对成员(例如，生物素/亲和素，生物素/链霉亲和素)。

本文所用的术语“溶液中”是指液体，例如含有一种或多种核酸的液体。溶液中的核酸和其它组分可以分散在整个溶液中，并且溶液通常包含水(例如，水溶液)。溶液可包含任何方便数量的寡核苷酸，并且通常至少存在与待检测的扩增子或靶核酸相同数量的寡核苷酸。

本文所用的术语“杂交序列”是指能够与扩增子、靶核酸或其互补序列特异性杂交的寡核苷酸中的核苷酸序列。杂交序列易于设计和选择，并且其长度可适于与如本文所述的溶液中的扩增子、靶序列或其互补序列杂交。在一些实施方式中，各寡核苷酸中的杂交序列的长度为约5至约200个核苷酸(例如，长度为约5至10，约10至15，约15至20，约20至25，约25至30，约30至35，约35至40，约40至45，或约45至50，约50至70，约80至90，约90至110，约100至120，约110至130，约120至140，约130至150，约140至160，约150至170，约160至180，约170至190，约180至200个核苷酸)。

本文所用的术语“杂交条件”是指具有互补核苷酸序列的两个核酸可以彼此相互作用的条件。杂交条件可以是高严格性，中等严格性或低严格性，并且这些不同程度的严格性的条件是已知的。通常根据感兴趣的应用选择允许扩增和/或延伸的杂交条件。

本文使用的术语“与一个扩增子或靶核酸特异性杂交”是指基本上与一个扩增子或靶核酸杂交，并且基本上不与溶液中的其它扩增子或靶核酸杂交。特异性杂交排除错配，使得例如可以设计寡核苷酸以与特定等位基因特异性杂交，并且仅与该等位基因杂交。与等位基因均匀匹配或互补的寡核苷酸将与该等位基因特异性杂交，而如果存在一个或多个碱基错配，则不会发生杂交。

本文所用的术语“杂交位置”是指另一核酸杂交的扩增子或靶核酸上的特定位置。在某些实施方式中，寡核苷酸的末端相邻于或基本上相邻于扩增子或靶核酸上具有与另一个扩增子或靶核酸不同序列的位点。当位点和寡核苷酸末端之间没有核苷酸时，寡核苷酸末端与该位点“相邻”。在某些实施方式中，当位点和寡核苷酸末端之间存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸时，寡核苷酸末端与位点“基本相邻”。

捕获剂和固相

本文所述方法可以利用一种或多种捕获剂。几种不同类型的捕获剂可以用于本文所述的方法，包括但不限于，例如，结合对的成员。结合对的示例包括但不限于(a)非共价的结合对(例如，抗体/抗原，抗体/抗体，抗体/抗体片段，抗体/抗体受体，抗体/蛋白A或蛋白G，半抗原/抗半抗原，生物素/亲和素，生物素/链霉亲和素，叶酸/叶酸盐结合蛋白，受体/配体或其结合部分，以及维生素B12/内源因子)；和(b)共价结合的对(巯基/马来酰亚胺，巯基/卤化乙酰基衍生物，胺/异硫氰酸，胺/琥珀酰亚胺酯和胺/磺酰卤化物)，等等。在一些实施方式中，结合对的一个成员与延伸的寡核苷酸或扩增产物相关联，而另一个成员与固相相关联。本文所用术语“与…相关联”指至少两个单元之间的相互作用，例如，其中两个单元是结合的或与另一个相连接的。

在某些实施方式中，捕获剂包括结合对的成员。在一些实施方式中，捕获剂包括生物素或生物素类似物，并且在一些实施方式中，固相包括亲和素或链霉亲和素。在一些实施方式中，捕获剂包括亲和素或链霉亲和素，并且在一些实施方式中，固相包括生物素。在某些实施方式中，(c)例如，通过用一种或多种核苷酸延伸与扩增子杂交的寡核苷酸产生包括捕获剂的延伸的寡核苷酸，其中一种或多种核苷酸中的一种是终止核苷酸，并且一种或多种被加至所述寡核苷酸的核苷酸包括所述捕获剂。

在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸的末端核苷酸包含捕获剂。在某些实施方式中，延伸的寡核苷酸的一个或多个非末端核苷酸包含捕获剂。在一些实施方式中，杂交序列的长度是约5至约200个核苷酸。在一些实施方式中，各寡核苷酸中的杂交序列的长度是约5至约50个核苷酸。在某些实施方式中，延伸的寡核苷酸的末端核苷酸包含捕获剂，并且有些时候延伸的寡核苷酸的一个或多个非末端核苷酸包含捕获剂。在一些实施方式中，捕获剂包含生物素，或任选地亲和素或链霉亲和素，在这样的情况下固相分别包含亲和素或链霉亲和素，或生物素。

生物素类似物可以是任何经修饰的生物素，其影响生物素与亲和素或链霉亲和素的结合性质(例如，9-甲基生物素，生物素甲酯(MEBio)，脱硫生物素(DEBio)，2'-亚氨基生物素(IMBio)，e-N-生物素基-L-赖氨酸，二氨基生物素(DABio)，包括Lai-Qiang等.(Lai-Qiang Ying和Bruce P.Branchaud,Chemical Communications,2011,47,8593-8595)中公开的所有生物素类似物)。在一些实施方式中，捕获剂是亲和素，链霉亲和素或亲和素或链霉亲和素的修饰形式(例如，硝基亲和素、硝基链霉亲和素、中性亲和素、Captavidin和其衍生物)。

本文所用术语“竞争物”指与捕获剂竞争与固相相互作用(例如，结合)的任何分子。竞争物的非限制性示例包括，游离的捕获剂(例如，结合对的一个或另一个成员，游离生物素，游离的亲和素/链霉亲和素)，捕获剂的竞争性片段(例如，生物素或亲和素/链霉亲和素的竞争性片段)，捕获剂的竞争性多聚体(例如，生物素多聚体)，其它竞争性分子或其片段或多聚体，特异性竞争结合固相的分子，升高的盐条件，升高的温度条件或其组合。在一些实施方式中，捕获剂的多聚体含有约2至约50个单体。在一些实施方式中，捕获剂的多聚体含有约2至约10个单体。在一些实施方式中，捕获剂的多聚体含有约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体。在一些实施方式中，含有捕获剂的多聚体的捕获剂含有相互之间共价结合的单体。在一些实施方式中，含有捕获剂的多聚体的捕获剂含有相互之间非共价结合的单体。本文所用术语“游离的捕获剂”指不与固相或延伸的寡核苷酸相关联的捕获剂。在一些实施方式中，游离的捕获剂可以是生物素或其竞争性部分或片段。在一些实施方式中，游离的捕获剂可以是亲和素、链霉亲和素或其竞争性部分或片段。术语“竞争性部分或片段”指这样的捕获剂，其尺寸小于全尺寸，但仍然保持完整捕获剂与结合对的另一个成员(例如，仍然可以结合亲和素或链霉亲和素的生物素片段或部分，仍然可以结合生物素的亲和素或链霉亲和素片段或部分)相互作用方面的功能性(例如，与捕获剂和固体支持物相互作用活性相同、小于或大于)。在一些实施方式中，游离的捕获剂的片段(例如，生物素的片段)的尺寸是仍然保持完整捕获剂功能性的任何尺寸。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，生物素的片段)的尺寸是仍然保持完整捕获剂的一些功能性的任何尺寸。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，生物素的片段)的尺寸是仍然保持完整捕获剂约30％至约100％之间功能性的任何尺寸。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，生物素的片段)的尺寸是仍然保持完整捕获剂约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％功能性的任何尺寸。

在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，游离生物素)以约0.1至约5000ug/ml的浓度添加。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，游离生物素)以约0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、400、800、1000、2000、4000、5000ug/ml或更高的浓度添加。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，游离生物素)以约10至约100ug/ml的浓度添加。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，游离生物素)以约10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ug/ml的浓度添加。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，游离生物素)以约25ug/ml的浓度添加到含有延伸的寡核苷酸的组合物。

在一些实施方式中，通过用竞争物进行竞争来释放延伸的寡核苷酸是在升高的温度条件下进行的。在某些实施方式中，升高的温度条件包括以下处理：以约80摄氏度至约100摄氏度之间的温度(例如，约80摄氏度(℃)、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃或100℃)处理约1分钟至约10分钟之间(例如，约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟或约10分钟)。在一些实施方式中，升高的温度条件包括在约90摄氏度下处理约5分钟。

如本文所用术语“固体支持物”或“固相”指核酸能与之结合的不溶性材料。用于本文所述步骤的固体支持物的示例包括但不限于，阵列、珠(例如，顺磁珠、磁珠、微珠、纳米珠)和颗粒(例如，微粒、纳米粒)。可使用标称、平均或均值直径为约1纳米至约500微米的颗粒或珠，例如标称、平均或均值直径为约10纳米至约100微米、约100纳米至约100微米；约1微米至约100微米；约10微米至约50微米；约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800或900纳米；或约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500微米的那些颗粒或珠。本文所用术语“顺磁性”指通常仅在外部施加的磁场存在时出现的磁性。因此，顺磁珠可以被外部施加的磁源所吸引，但是没有外部施加的磁场的情况下通常不施加其自身磁场。包含铁芯的磁珠通常施加其自身的磁场。

在某些实施方式中，固相选自平坦表面、硅芯片、珠子、球体或前述的组合。固相有些时候是顺磁性的。在一些实施方式中，固相是顺磁珠，并且在一些实施方式中，固相包括捕获剂。

固体支持物可以包含基本上任何不溶性或固体材料，并通常选用不溶于水的固体支持物组合物。例如，固体支持物可以包含硅胶、玻璃(如可控孔度玻璃(controlled-poreglass，CPG))、尼龙、纤维素、金属表面(如，钢、金、银、铝、硅和铜)、磁性材料、塑料材料(如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF))等，或基本由其组成。珠或颗粒可以是可溶胀的(例如，聚合物珠如王氏树脂)或不可溶胀的(如CPG)。珠的市售示例包括但不限于王氏树脂、梅氏树脂(Merrifield resin)和与SoluLink。固相(例如，珠)可以包含结合对的成员(例如，亲和素、链霉亲和素或其衍生物)。在一些实施方式中，固相基本上是亲水性的。在一些实施方式中，固相(例如，珠)基本上是疏水性的。在一些实施方式中，固相包含结合对的成员(例如，亲和素、链霉亲和素或其衍生物)并且基本上是疏水性或基本上是亲水性的。在一些实施方式中，固相包含结合对的成员(例如，亲和素、链霉亲和素或其衍生物)并且具有大于约1350pmole游离的捕获剂(例如，游离生物素)/mg固体支持物的结合能力。在一些实施方式中，包含结合对的成员的固相的结合能力大于800、900、1000、1100、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1800、2000pmole游离的捕获剂/mg固体支持物。

可在固体支持物的集合中提供固体支持物。固体支持物集合包含两种或多种不同的固体支持物材料。本文所用术语“固体支持物物质”指与一种特定的固相核酸种类或者不同固相核酸种类的特定组合物相结合的固体支持物。在某些实施方式中，固体支持物集合包含2至10,000种固体支持物种类、10至1,000种固体支持物种类或者约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种独特的固体支持物种类。固体支持物的集合中的固体支持物(例如，珠)可以是同种的(例如，所有的都是王氏树脂珠)或异种的(例如，一些是王氏树脂珠，一些是磁珠)。固体支持物的集合中的各种固体支持物物质有些时候是使用特定识别标签标记的。用于特定固相支持物物质的识别标签有时是核酸(如，“固相核酸”)，在某些实施方式中所述核酸具有独特的序列。识别标签可以是能够检测并区分其它固体支持物物质上的识别标签的任何分子。

在延伸的寡核苷酸与固相结合之后(即，捕获后)，常常洗掉或降解未延伸的寡核苷酸和/或未结合的不需要的反应组合物。在一些实施方式中，在延伸的寡核苷酸被捕获后，洗涤固相。在一些实施方式中，在延伸的寡核苷酸被捕获后以及释放延伸的寡核苷酸之前，洗涤固相。在一些实施方式中，对固相的洗涤去除盐。在一些实施方式中，对固相的洗涤去除在质谱中产生干扰性加合物的盐。在一些实施方式中，对固相的洗涤去除干扰质谱的盐。在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸在固相洗涤之后与阴离子交换树脂接触。在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸在固相洗涤之后不阴离子交换树脂接触。在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸被捕获在固相上，洗涤一次或多次，从固相释放并且不与阴离子交换树脂接触。延伸的寡核苷酸在检测之前可以通过一个或多个步骤进行处理。例如，延伸的寡核苷酸在检测之前可以进行调节(例如，通过离子交换使与捕获的核酸相结合的阳离子和/或阴离子的类型均质化)。在某些实施方式中，延伸的寡核苷酸在检测之前，可以从固相释放。

在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸(例如，延伸的寡核苷酸)与包含结合对的一个成员的捕获剂(例如，生物素或亲和素/链霉亲和素)相关联。在某些实施方式中，通过将结合对成员与含有结合对的另一个成员(例如，亲和素/链霉亲和素或生物素)的固相接触，捕获包含捕获剂的延伸的寡核苷酸。在某些实施方式中，延伸的寡核苷酸是生物素化的，并且通过将生物素部分与亲和素或链霉亲和素包覆的固相接触，捕获具有延伸的寡核苷酸产物的生物素部分。在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸包含质量可区分标签或其他标记物，并且在某些实施方式中，检测质量可区分标签或其他标记物包括检测延伸的寡核苷酸的存在与否。在一些实施方式中，通过与竞争物竞争从固相释放结合固相的延伸的寡核苷酸，并且检测到延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，通过与竞争物竞争从固相释放结合固相的延伸的寡核苷酸，并且检测到延伸的核苷酸的，或与其相关联的可区分标记物。在一些实施方式中，通过与竞争物竞争从固相释放结合固相的延伸的寡核苷酸，从延伸的寡核苷酸释放可区分标记物，并且检测到释放的可区分标记物。

可区分标记物、检测和释放

如本文所用，术语“可区分标记物”和“可区分标签”是指可以彼此区分并用于鉴定标签所附着的核酸的标记物或标签的类型。本文的并行式方法可选择并使用多种类型的标记物和标签。例如，寡核苷酸、氨基酸、小有机分子、发光分子、光吸收分子、光散射分子、发光分子、同位素、酶等可用作可区分标记物或标签。在某些实施方式中，具有不同长度，不同质荷比，不同电泳迁移率(例如，毛细管电泳迁移率)和/或不同质量的寡核苷酸、氨基酸、和/或小分子有机分子也可用作可区分标记物或标签。因此，荧光团、放射性同位素、比色剂、发光剂、化学发光剂、光散射剂等可用作标记物。标记物的选择取决于所需灵敏度、与核酸偶联的难易程度、稳定性要求和可用仪器。本文中关于可区分标记物和标签使用的术语“可区分特征”是指可以与一种标记物或标签区分的另一种标记物或标签的任何特征(例如，本文所述的质量和其他)。在一些实施方式中，标记物接合至链终止核苷酸。在一些实施方式中，可以选择和/或设计可区分标记物和标签的标记物组成以在质谱仪中产生最佳的飞行行为(flight behavior)，并允许以高并行式水平区分标记物和标签。在一些实施方式中，诸如荧光标记物之类的标记物与实现空间分离的方法(诸如阵列，珠或毛细管电泳)一起使用。

可检测标记物包括但不限于，核苷酸(带标记或不带标记)、复合体(compomer)、糖、肽、蛋白质、抗体、化学化合物、导电聚合物、结合部分如生物素、质量标签、氧化铁粒子或珠、比色剂、发光剂、化学发光剂、光射散剂、荧光标签、放射性标签、负荷标签(荷电或磁)、挥发标签和疏水标签、生物分子(例如，结合对的成员、抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体片段、抗体/抗体受体、抗体/蛋白A或蛋白G、半抗原/抗半抗原、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、维生素B12/特性因子、化学反应基团/互补化学反应基团(例如，巯基/马来酰亚胺、巯基/卤化乙酰衍生物、胺/异硫氰酸酯、胺/琥珀酰亚胺酯和胺/磺酰卤化物)等，其中一些将在如下进一步描述。在一些实施方式中，探针可含有信号生成部分，所述部分与靶杂交、改变靶核酸通过纳米孔的通路并且能在当其通过纳米孔从靶核酸上释放(例如，改变通过已知大小的孔的速度或时间)时生成信号。

本文所用的术语“检测”标签是指鉴定标记物质。任何合适的检测装置可用于区分样品中的标记物质。适用于检测大量可区分标记物的检测装置包括，但不限于，某些质谱和凝胶电泳装置。质谱形式的示例包括但不限于，基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)，MALDI正交TOF MS(OTOF MS；二维)，激光解吸质谱(LDMS)，电喷雾(ES)MS，离子回旋共振(ICR)MS和傅里叶变换MS。本文所述的方法可以容易地应用于其中分析物挥发和离子化的质谱形式(“电离MS”，例如，MALDI-TOF MS，LDMS，ESMS，线性TOF，OTOF)。正交离子提取MALDI-TOF和轴向MALDI-TOF可以产生相对高的分辨率，从而相对高的并行式水平。适用于检测发光，光吸收和/或光散射标记物的检测装置包括但不限于，某些光检测器和光学检测器(例如，用于荧光，化学发光，吸收和/或光散射标签)。

对应低丰度(次要)和高丰度(主要)变体的标记的延伸产物可以通过多种方法分析，包括但不限于，质谱，MALDI-TOF质谱，荧光检测，DNA测序凝胶，自动DNA测序机上的毛细管电泳，微通道电泳和其他测序方法，质谱，飞行时间质谱，四极杆质谱，扇形磁场质谱，电子质谱红外光谱，紫外光谱，恒电势电流测定法，电流/电化学信号测量或通过DNA杂交技术，包括Southern印迹，Slot印迹，Dot印迹和DNA微阵列，其中DNA片段可用作“探针”和“靶标”，ELISA，荧光试验，荧光共振能量转移(FRET)，SNP-IT，GeneChips，HuSNP，BeadArray，TaqMan试验，Invader试验，或方法。

通过本文提供的方法获得的对应于高丰度变体(主要变体)和低丰度变体(次要变体)的延伸产物可以通过多种方法检测。例如，延伸引物(UEP)和/或链终止剂可以用允许检测信号和/或定量信号的任何类型的化学基团或部分标记，包括但不限于，质量标记物、放射性分子、荧光分子、抗体、抗体片段、半抗原、碳水化合物、生物素、生物素衍生物、磷光部分、发光部分、电化学发光部分、在氧化或还原时产生电化学信号的部分，例如铁，钌或锇的复合物(参见例如，由Genmark诊断公司(Genmark Diagnostics，Inc)使用的eSensor技术，例如Peirce等，J.Clin.Micribiol.,50(11):3458-3465(2012)中所述)、色度部分和具有可检测的电子自旋共振、电容、介电常数或电导率的部分、或其标记物的任何组合。

对于本文使用的方法，特定的靶核酸，扩增子和/或延伸的寡核苷酸通常与可区分的可检测标记物质配对，使得特定标记物或标签物质的检测直接鉴定特定组合物中的特定靶核酸、扩增子和/或延伸的寡核苷酸的存在。因此，可以使用标记物质的一个可区分的特征，例如，以鉴定组合物中的一个靶核酸，因为该特定可区分的特征对应于特定的靶核酸。标记物和标签可以通过任何已知方法并在任何位置(例如，寡核苷酸的5'处)连接到核酸(例如，寡核苷酸)。因此，如本文所用，对于每个特定的标记物质，对于每个特定的靶核酸来说，”特异性对应”是指与一种靶物质配对的一种标记物质。某些实施方式中，当检测到标记物质的存在时，检测到与该标记物质相结合的靶核酸的存在。

本文中关于可区分标签或标记物(统称为“标记物”)使用的术语“物质(species)”是指与一种标记物可检测地区分的另一种标记物。在某些实施方式中，标记物质的数量包括但不限于约2至约10000种标记物质，约2至约500,000种标记物质，约2至约100,000，约2至约50000，约2至约10000和约2至约500种标记物质，或有时约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000种标记物质。

本文所用的术语“质量可区分标记物”是指以质量作为特征区分的标记物。在一些实施方式中，可区分标签由核苷酸组成，并且有些时候，标签的长度是约5个核苷酸至约50个核苷酸。在某些实施方式中，可区分标签是核苷酸复合体，其中有些时候，其长度是约5个核苷酸至约35个核苷酸。在某些实施方式中，可区分标签是肽，其中有些时候，其长度是约5个氨基酸至约100个氨基酸。在某些实施方式中，可区分标签是有机分子单元的多联体。在一些实施方式中，标签是三苯甲基分子多联体。

可以选择和使用各种质量可区分的标记物，例如，复合体、氨基酸和/或多联体。核苷酸串(例如，核酸；复合体)，氨基酸串(例如，肽；多肽；复合体)和/或多联体的不同长度和/或组成可以通过质量来区分并用作标记物。任何数量的单元都可以在质量可区分的标记物中使用，并且这些单元的上限和下限部分取决于用于检测和区分这些标签的系统的分辨率和质量窗口。因此，可以部分地基于用于检测和可区分标记物的检测器的分辨率和质量窗口来选择质量可区分标记物的长度和组成。

本文所用的术语“复合体”是指一组单体单元的组成，并且不是单体单元的特定顺序。对于核酸，术语“复合体”是指以碱基作为单体单元的核酸的碱基组合物。每种类型的碱基的数量可以由Bn表示(即，AaCcGgTt，其中A0C0G0T0表示“空”复合体或不含碱基的复合体)。天然复合体是所有组分单体单元(例如，对于核酸是碱基并且对于多肽是氨基酸)大于或等于零的复合体。在某些实施方式中，a、c、g或t中的至少一个等于1或更大(例如，A0C0G1T0、A1C0G1T0、A2C1G1T2、A3C2G1T5)。为了比较序列以确定序列变异，在本文提供的方法中，可以通过用于处理数据的算法产生含有负数的单体单元的“非天然”复合体。对于多肽，复合体是指多肽片段的氨基酸组成，其中类似地表示每种类型的氨基酸的数量。复合体可对应于多个序列。例如，聚合物A2G3对应于序列AGGAG、GGGAA、AAGGG、GGAGA等。通常，存在对应于序列的唯一复合体，但是超过一个序列可以对应于相同复合体。在某些实施方式中，一个复合体与(例如，对应于)一个靶核酸、扩增子和/或寡核苷酸配对。在本文的实施方式中(例如，A0C0G5T0和A0C5G0T0是不同的和质量可区分的复合体)，不同的复合体具有不同的碱基组成，和可区分的质量。在一些实施方式中，一组复合体的碱基组成不同并具有相同的长度。在某些实施方式中，一组复合体的碱基组成和长度不同。

用作质量可区分标记物的核苷酸复合体可以具有任何长度，其中所有复合体可以可检测地区分，例如长度为约1至15、5至20、1至30、5至35、10至30、15至30、20至35、25至35、30至40、35至45、40至50、或25至50，或有时约55、60、65、70、75、80、85、90、85或100个核苷酸。用作质量可区分标记物的肽或多肽复合体可以具有任何长度，其中所有复合体可以可检测地区分，例如长度为约1至20、10至30、20至40、30至50、40至60、50至70、60至80、70至90个或80至100个氨基酸。如上所述，复合体中单元数量的限制通常受到用于区分多联体的检测方法的分辨率和质量窗口的限制。

术语“多联体”和“串联体”在本文中同义使用(统称为“多联体”)，并且是指包含彼此连接的两个或更多个单元的分子(例如，通常连续连接；在某些实施方式中有时分支)。在一些实施方式中，多联体有时是核酸和/或人造聚合物。在一些实施方式中，多联体可以包含相同类型的单元(例如，同多联体)，并且有时多联体可以包含不同类型的单元(例如，异多联体)。多联体可包含任何类型的单元，包括核苷酸单元、氨基酸单元、小有机分子单元(例如，三苯甲基)、特定核苷酸序列单元、特定氨基酸序列单元等。在一个实施方式中，三个特定序列单元ABC的同多联体是ABCABCABC。只要可以将各多联体与其他物质区分开，多联体可以包含任何数量的单元。例如，在一些实施方式中，三苯甲基多联体可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个三苯甲基单元。

在某些实施方式中，可以从核酸产物(例如，延伸的寡核苷酸)释放可区分的标记物。可区分标记物和核酸之间的连接可以是可被转录并切割，切割并允许检测释放的一种或多种标记物的任何类型(例如，Ehrich等的题为“靶标特异性复合体及使用方法”的美国专利申请公开号为US20050287533A1)。这种连接和切割连接的方法(“切割条件”)是已知的。在某些实施方式中，标记物可以与其所连接的分子的其它部分分离。在一些实施方式中，标记物(例如，复合体)从更大的核苷酸串(例如，延伸的寡核苷酸)切割。连接的非限制性示例包括，可由核酸酶(例如，核糖核酸酶，内切核酸酶)切割的连接；可由化学物质切割的连接；可通过物理处理切割的连接；和可被光切割的光可切割接头(例如，邻硝基苄基，6-硝基维酰氨基氧羰基，2-硝基苄基)。当使用发射光的检测系统(例如，基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱涉及激光发射光)时，光可切割接头提供了优点，因为切割和检测在单个步骤中结合并进行。

在某些实施方式中，标记物可以是较大单元的一部分，并且可以在检测之前与该单元分离。例如，在某些实施方式中，标记物是较大核苷酸序列中的一组连续核苷酸，并且从较大的核苷酸序列切下标记物。在这样的实施方式中，标记物通常位于其所在的核苷酸序列或核酸的一个末端处。在一些实施方式中，标记物或其前体位于转录盒中，转录盒包括与编码标记物的前体序列可操作地连接的启动子序列。在后一个实施方式中，启动子有时是产生包含标记物或由标记物组成的RNA的RNA聚合酶募集启动子。包含标记物的RNA可以在检测之前被切割以释放标记物(例如，用RNA酶)。

在某些实施方式中，可区分的标记物或标签不从延伸的寡核苷酸切下，并且在一些实施方式中，可区分的标记物或标签包含捕获剂。在某些实施方式中，检测可区分的特征包括检测延伸的寡核苷酸的存在与否，并且在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸包含捕获剂。在一些实施方式中，通过与竞争物竞争从固相释放延伸的寡核苷酸，并且在某些实施方式中，与竞争物竞争包括将固相与竞争物接触。在一些实施方式中，从固相释放延伸的寡核苷酸是在升高的温度条件下进行的。在某些实施方式中，升高的温度条件是在约80摄氏度和约100摄氏度之间。在一些实施方式中，从捕获剂释放延伸的寡核苷酸在升高的温度条件下进行约1分钟至约10分钟之间。在某些实施方式中，从固相中释放延伸的寡核苷酸包括用竞争物(例如，游离的捕获剂、游离的捕获剂的竞争性片段、游离的捕获剂的多聚体、特异性竞争结合固相的任何分子等等及其组合)在约90摄氏度处理约5分钟。在一些实施方式中，竞争物是生物素，并且固相包括亲和素/链霉亲和素，并且在某些实施方式中，竞争物是亲和素/链霉亲和素，并且固相包括生物素。

在某些实施方式中，并行式试验包括在延伸之后一些延伸的寡核苷酸和一些没有延伸的寡核苷酸。在这样的实施方式中，没有延伸的寡核苷酸常常没有结合至固相。

在一些实施方式中，竞争物与接合至核苷酸或核酸的捕获剂(例如，具有掺入的捕获剂(例如，生物素)的延伸的寡核苷酸)的比例可以是1：1。在某些实施方式中，可以使用超过与寡核苷酸结合的捕获剂的竞争物，并且在一些实施方式中，与寡核苷酸结合的捕获剂可以超过竞争物。在这样的实施方式中，所述超过有时是超过约5倍至超过约50,000倍(例如，超过约10倍、超过约100倍、超过约1,000倍或超过约10,000倍)。

并行式(Multiplexing)

本文提供的方法允许高通量检测和定量多个靶核酸中的靶核酸及其高丰度和低丰度变体。并行式指同时检测超过一种靶核酸。已知与质谱联合进行并行式反应的常规方法(参见美国专利号6,043,031、5,547,835与国际PCT申请号WO 97/37041)。相较于各单独靶核酸必须在分开的质谱分析中进行，并行式提供的优势能在少至单个质谱中鉴定多个靶核酸和其变体(例如，一些具有不同的序列变异)。在一些实施方式中，本文提供的方法适用于高通量、高度自动化的用于以高速度和精确度分析序列变化的方法。在一些实施方式中，本文的方法可在单一反应中以高水平并行式。当多态性基因座处的基因型未知，并且在一些实施方式中，基因座上的基因型已知时，可以应用并行式。在一些实施方式中，并行式利用所述的检测方法而不是质谱分析。

在某些实施方式中，并行式的靶核酸的数量包括但不限于约2至1000种，并且有时约1至3、3至5、5至7、7至9、9至11、11至13、13至15、15至17、17至19、19至21、21至23、23至25、25至27、27至29、29至31、31至33、33至35、35至37、37至39、39至41、41至43、43至45、45至47、47至49、49至51、51至53、53至55、55至57、57至59、59至61、61至63、63至65、65至67、67至69、69至71、71至73、73至75、75至77、77至79、79至81、81至83、83至85、85至87、87至89、89至91、91至93、93至95、95至97、97至101、101至103、103至105、105至107、107至109、109至111、111至113、113至115、115至117、117至119、121至123、123至125、125至127、127至129、129至131、131至133、133至135、135至137、137至139、139至141、141至143、143至145、145至147、147至149、149至151、151至153、153至155、155至157、157至159、159至161、161至163、163至165、165至167、167至169、169至171、171至173、173至175、175至177、177至179、179至181、181至183、183至185、185至187、187至189、189至191、191至193、193至195、195至197、197至199、199至201、201至203、203至205、205至207、207至209、209至211、211至213、213至215、215至217、217至219、219至221、221至223、223至225、225至227、227至229、229至231、231至233、233至235、235至237、237至239、239至241、241至243、243至245、245至247、247至249、249至251、251至253、253至255、255至257、257至259、259至261、261至263、263至265、265至267、267至269、269至271、271至273、273至275、275至277、277至279、279至281、281至283、283至285、285至287、287至289、289至291、291至293、293至295、295至297、297至299、299至301、301至303、303至305、305至307、307至309、309至311、311至313、313至315、315至317、317至319、319至321、321至323、323至325、325至327、327至329、329至331、331至333、333至335、335至337、337至339、339至341、341至343、343至345、345至347、347至349、349至351、351至353、353至355、355至357、357至359、359至361、361至363、363至365、365至367、367至369、369至371、371至373、373至375、375至377、377至379、379至381、381至383、383至385、385至387、387至389、389至391、391至393、393至395、395至397、397至401、401至403、403至405、405至407、407至409、409至411、411至413、413至415、415至417、417至419、419至421、421至423、423至425、425至427、427至429、429至431、431至433、433至435、435至437、437至439、439至441、441至443、443至445、445至447、447至449、449至451、451至453、453至455、455至457、457至459、459至461、461至463、463至465、465至467、467至469、469至471、471至473、473至475、475至477、477至479、479至481、481至483、483至485、485至487、487至489、489至491、491至493、493至495、495至497、497至501种或更多。

用并行式试验获得解析质谱的设计方法可包括引物和寡核苷酸设计方法和反应设计方法。就并行式试验中的引物与寡核苷酸设计而言，采用与单重反应相同的引物设计总体方针，例如避免假引发和引物二聚体，只是并行反应涉及更多引物。此外，在某一试验质谱中的分析物峰从该试验与之并行式的任意试验的产物中充分解析，包括暂停峰(pausing peak)和任意其它副产物峰。此外，分析物峰最佳地落入用户指定的质量窗口内，例如在5,000至8,500Da的范围内。在一些实施方式中，可以相对于给定SNP链的靶序列设计延伸寡核苷酸。在这样的实施方式中，长度通常在可以是例如用户指定的限制之间(例如，17至24个碱基或17至26个碱基)，并且通常不包含靶序列中不确定的碱基。杂交强度有时通过计算序列依赖性熔化(或杂交/解离)温度T_m来测量。由于其发夹潜力、假引发潜力、引物二聚体潜力、低复杂度区域和有问题的子序列(如GGGG)，特定的引物选择可能不允许或相对于引物的其他选择不利。用于设计延伸寡核苷酸的方法和软件(例如，根据这些标准)是已知的，并且包括，例如SpectroDESIGNER(塞昆纳姆公司(Sequenom))。这样设计并行式试验从而使得包括在相同重中的靶核酸具有共同的低丰度变体(即，相同的突变基因型)。

在一些实施方式中，本文提供的并行式试验是为单碱基延伸设计的，并且包括在相同重中的靶核酸具有共同的低丰度变体。试验是部分利用下述标准设计的：

a.寡核苷酸与衍生自靶核酸的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在对单碱基位置的5’位置处杂交，所述单碱基位置在靶核酸的低丰度变体和高丰度变体之间不同。

b.在重中的多种靶核酸的每个高丰度变体位于单碱基位置的核苷酸相同或不同。

c.在重中的多种靶核酸的每个低丰度变体位于单碱基位置的核苷酸都相同(即，在重中的所有试验具有相同的低丰度或共同的突变碱基)。

d.在重中的多种靶核酸的高丰度变体位于单碱基位置的核苷酸与多种靶核酸中的低丰度变体位于单碱基位置的核苷酸是不相同的。

并行式试验是基于使用针对延伸包括在单一重中的靶核酸的低丰度变体特异性的单一终止核苷酸。并行式试验可以包括1、2或3种不同的终止核苷酸，其针对在试验中延伸靶核酸的高频率变体有特异性。例如，如果低丰度变体是通过ddTTP延伸，那么延伸混合物可以包括ddATP、ddGTP和ddCTP中的一种、两种或三种。

设计了4个并行式试验(重)，各重靶向不同的低丰度变体。具有相同低丰度变体的靶核酸被组合在单一重内。

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并行C

低丰度变体-C

可能的高丰度变体-G、A、T

并行A

低丰度变体A

可能的高丰度变体-G、C、T

并行T

低丰度变体T

可能的高丰度变体-G、A、C

并行G

低丰度变体G

可能的高丰度变体-C、A、T

在正向和反向询问各低丰度变体以促进所有可能的高丰度变体/低丰度变体组合的需求。该设计避免了来自延伸寡核苷酸和PCR引物的重叠，从而避免了任何潜在的外切核酸酶衍生的额外信号。

如本文所使用的，术语“检出率”或“判定率”是指相对于尝试获得的检出的数量的获得的检出的数量(例如，确定的基因型)。换而言之，对于12-重反应，如果10种基因型最终通过进行本文提供的方法确定，则10次检出已经获得，检出率为10/12。不同的事件可能导致特定尝试试验的失败，并导致检出率低于100％。偶尔，在用于终止dNTP和ddNTP的混合的情况下，例如，在引入一种非终止核苷酸(即，dNTP)后，通过暂停聚合酶可以发生不适合的延伸产物。多态性位点处的这种错误终止和正确终止的引物扩展反应之间的质量差异有时太小而不能一致地解析，如果使用不适当的终止混合物，则可能导致错判。在正确终止和错误终止之间的质量差异(即由暂停引起的)以及正确的终止和盐加合物以及正确的终止和非特异性并入之间的质量差异通常被最大化以减少错判的数量。

可以通过在一个或多个试验中评估获得的检出的数量(例如，正确或准确评估)和/或假阳性和/或假阴性事件的数量来确定并行式试验准确度。也可以通过比较每个并行式试验中评估的目标的相应单重试验的准确性评估准确性。在某些实施方式中，可以使用一种或多种方法来确定判定率。例如，可以结合用于进行检出的自动化或计算机方法来使用手动方法，并且在一些实施方式中，可以将每种方法的检出率相加以计算总体检出率。在某些实施方式中，当并行式两种或更多种靶核酸(例如，50或更多种靶核酸)时，检出率或准确度可以为约99％或更大，例如，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，87-88％，85-86％，83-84％，81-82％，80％，78％-79％或76-77％。在一些实施方式中，包括约2至200种靶物质的并行式试验中每种靶物质的检出率大于或等于80％或更多(例如，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或以上)。

在某些实施方式中，错误率可以基于检出率或准确率来确定。例如，错误率可能是错误的检出数。在一些实施方式中，例如，错误率可以是检出率或精确率的不到100％。错误率也可以称为“失败率”。识别假阳性和/或假阴性可以再调整检出率和错误率。在某些实施方式中，运行更多试验还可以帮助鉴定假阳性和/或假阴性，从而调整检出和/或错误率。在某些实施方式中，当并行式两种或多种靶核酸(例如，50种或更多种靶核酸)时，错误率可以是约1％或更少，例如，2％、3％、4,％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。

实施例

下述实施例说明但不限制本技术。

实施例1：偏斜终止子变体检测

以下方法使用涉及如本文之前所述的低丰度变体和高丰度变体的终止子的偏斜浓度以询问单一反应内的多重信息变体。

试验设计

每个试验由三种引物、两种PCR引物和一种单碱基延伸引物组成。所有扩增子的长度都在150bp以下，以确保成功扩增循环细胞游离的DNA，并且将质量标签添加到引物的5'末端以将未掺入的PCR引物移出分析质量窗口。延伸探针设计也有几个要求。首先，延伸的产物的质量必须隔开充足的质量以确保试验之间没有冲突。其次，并行式是基于突变等位基因(低丰度变体)，因此在一个反应中，只有在单碱基延伸期间具有相同的核苷酸掺入的次要等位变体(低丰度变体)是一起并行式的。只要主要等位基因(高丰度变体)不同于次要等位基因，不需要担心主要等位基因(高丰度变体)。主要等位基因(高丰度变体)的延伸产物为从失败的试验中区分野生型结果提供了对照。例如，任选的对照试验可以包括捕获对照以验证珠捕获步骤、清洗步骤和洗脱步骤是否成功。

PCR扩增

以20μL的总体积进行PCR，用10μL的DNA模板，补充10μL的主混合物，其由补充有1mM MgCl₂，125μM dNTP，0.125U尿嘧啶-DNA糖基化酶(美国马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))，4U Taq聚合酶和100nM的各PCR引物组成。反应最初在30℃下孵育10分钟，然后在94℃下孵育2分钟。进行45个循环的94℃持续30秒，56℃持续30秒，和72℃持续1分钟的PCR。PCR以72℃下5分钟的最终孵育完成。5μL的扩增产物通过添加2μL的0.24x虾碱性磷酸酶(SAP)缓冲液中的0.5U SAP，总体积为7μL，在37℃下持续40分钟，然后将SAP酶在85℃下变性10分钟来调理。

单碱基延伸

通过加入2μL主混合物进行单碱基延伸，所述主混合物由0.2x延伸缓冲液，5.56μM次要等位基因变体核苷酸和不同浓度的浓度范围为0.03至1.25μM的主要等位基因变体核苷酸，不同浓度的延伸引物，和0.14U Pro酶组成。在9μL的总体积中进行单碱基延伸反应。反应参数包括在94℃下初始孵育30秒，之后40个循环的在94℃持续5秒钟和52℃持续5秒然后80℃持续5秒的五个嵌套循环。单碱基延伸以在72℃下孵育3分钟完成。

捕获和数据获取

在捕获之前，链霉亲和素包覆的磁珠在结合和洗涤缓冲液中调理。对珠进行两轮调节，并将其在结合和洗涤缓冲液中以1μg/μL的浓度重悬。将总体积为41μL的经调理的珠加入各9μL反应中，并且在恒定的旋转下以室温进行30分钟捕获。使用磁铁对具有捕获的产物的珠进行沉淀，并且去除结合和洗涤溶液。使用100μL的HPLC级水洗涤珠一次，使用13μL的洗脱液(溶液中游离生物素)重悬，并以95℃孵育5分钟。洗脱的产物使用5μL(3mg)阴离子交换树脂浆料进行调理。使用RS1000纳米分配器将分析物分配到 II固体支持物上。使用4仪器通过MALDI-TOF质谱获得数据。

实施方式示例

下文列出了本技术的某些实施方式的非限制性例子。

A1.一种检测多种核酸的变体存在与否的并行式方法，其包括：

(a)制备衍生自多种靶核酸或其部分的多个扩增子，其中各种靶核酸包括低丰度变体和高丰度变体；

(b)所述扩增子与多种寡核苷酸在单一反应中杂交从而生成杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自与靶核酸的扩增子特异性对应，其中(i)寡核苷酸与衍生自靶核酸所述低丰度变体和所述高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5’位置处杂交，所述靶核酸低丰度变体的所述单碱基位置与所述高丰度变体的所述单碱基位置不同，(ii)所述多种靶核酸各高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸相同或不同，(iii)所述多种靶核酸低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸都相同，并且(iv)所述多种靶核酸的高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸与所述多种靶核酸中的低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸无一相同；并且

(c)将杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包括针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸和针对一种或多种所述高丰度变体特异性的1、2或3种终止核苷酸；其中：(i)所述终止核苷酸包括捕获剂，(ii)所述针对一种或多种高丰度变体的1、2或3种终止核苷酸各自的浓度是相对于针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.1％至30％，(iii)所述延伸条件包括多重热循环，从而生成含有针对所述多种靶核酸的低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸，和含有针对所述多种靶核酸的高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸；

(d)将所述延伸的寡核苷酸与固相在所述捕获剂与所述固相相互作用的条件下接触，从而在所述固相上捕获所述延伸的寡核苷酸，其中所述固相包括(c)中所述捕获剂的结合伴侣；

(e)通过在升高的温度条件下将固相与竞争物接触，释放(d)中所述延伸的寡核苷酸，其中所述竞争物含有(d)中与所述固相相互作用的所述捕获剂的游离形式；并且

(f)检测在(e)中释放的所述延伸的寡核苷酸；从而检测多种核酸的变体存在与否。

A2.如实施方式A1所述的方法，其中所述变体是单核甘酸多态性(SNP)变体，所述低丰度变体是低丰度等位基因并且所述高丰度变体是高丰度等位基因。

A3.如实施方式A1所述的方法，其中所述低丰度变体是突变等位基因并且所述高丰度变体是等位基因的野生型。

A3.1如实施方式A1所述的方法，其中所述低丰度变体具有一个或多个插入或缺失并且所述高丰度变体不具有一个或多个插入和缺失。

A4.如实施方式A1至A3.1中任一项所述的方法，其中所述低丰度变体以所述高丰度变体拷贝数的2％或更小的拷贝数存在。

A4.1.如实施方式A1至A4中任一项所述的方法，其中所述低丰度变体以所述高丰度变体拷贝数的1％或更小的拷贝数存在。

A4.2.如实施方式A1至A4.1中任一项所述的方法，其中所述低丰度变体以相对于所述高丰度变体拷贝数的0.1％的拷贝数存在。

A5.如实施方式A1至A4.2中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由一种终止核苷酸组成。

A6.如实施方式A1至A4.2中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由两种不同的终止核苷酸组成。

A7.如实施方式A1至A4.2中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由三种不同的终止核苷酸组成。

A8.如实施方式A1至A7中任一项所述的方法，其中所述终止核苷酸独立选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。

A9.如实施方式A1至A7中任一项所述的方法，其中所述终止核苷酸包括一种或多种无环终止剂。

A9.1如实施方式A1至A9中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种、两种或三种终止核苷酸各自的浓度是相对于所述针对低丰度变体的特异性终止核苷酸浓度的0.5％至10％。

A9.2如实施方式A1至A9中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种、两种或三种终止核苷酸各自的浓度是相对于所述针对低丰度变体的特异性终止核苷酸浓度的1％至2％。

A10.如实施方式A1至A9.2中任一项所述的方法，其中各种核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数至少约1000个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的0.1％。

A11.如实施方式A1至A10中任一项所述的方法，其中(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述试剂去除所有未掺入扩增子的核苷酸的末端磷酸。

A12.如实施方式A1至A11中任一项所述的方法，其中通过将所述溶液与磷酸酶接触去除所述末端磷酸。

A13.如实施方式A12所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。

A14.如实施方式A13所述的方法，其中所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。

A15.如实施方式A1至A14中任一项所述的方法，其中所述多种靶核酸是10种或更多种靶核酸。

A16.如实施方式A1至A14中任一项所述的方法，其中所述多种靶核酸是20种或更多种靶核酸。

A17.如实施方式A1至A6中任一项所述的方法，其中(a)中所述延伸条件包括循环30至45次。

A18.如实施方式A1至A17中任一项所述的方法，其中(c)中所述延伸条件包括循环20至300次。

A19.如实施方式A1至A17中任一项所述的方法，其中(c)中所述延伸条件包括循环至少50次。

A20.如实施方式A1至A19中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包括亲和素、亲和素的类似物、链霉亲和素、链霉亲和素的类似物、生物素或生物素的类似物。

A21.如实施方式A1至A20中任一项所述的方法，其中所述结合伴侣选自下组：亲和素、亲和素的类似物、链霉亲和素、链霉亲和素的类似物、生物素或生物素的类似物。

A22.如实施方式A1至A21中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包括生物素，所述固相包括链霉亲和素并且所述竞争物包括游离生物素。

A23.如实施方式A1至A22中任一项所述的方法，其中所述升高的温度条件是约80℃至约100℃。

A24.如实施方式A1至A23中任一项所述的方法，其中所述升高的温度条件包括处理约1分钟至约10分钟。

A25.如实施方式A1至A24中任一项所述的方法，其中所述升高的温度条件包括以约90℃处理约5分钟。

A26.如实施方式A1至A25中任一项所述的方法，其中所述竞争物的浓度是约10ug/ml至约100ug/ml。

A27.A26的所述实施方式，其中所述竞争物是约25ug/ml浓度的游离生物素或游离生物素类似物。

A28.如实施方式A1至A27中任一项所述的方法，其中在没有检测到包含低丰度变体特异性终止核苷酸的延伸的寡核苷酸的情况下，对包含高丰度变体特异性终止核苷酸的延伸的寡核苷酸的检测提供针对假阴性结果的阳性对照。

A29.如实施方式A1至A28中任一项所述的方法，其中各延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。

A30.A29的所述实施方式，其中所述终止核苷酸包括可检测标记物。

A31.A29的所述实施方式，其中所述可检测标记物是荧光标记物。

A32.A31的所述实施方式，其中终止核苷酸包括荧光标记物。

A32.1A31或A32的所述实施方式，其中通过电泳或实时PCR检测所述荧光标记物。

A33.A29的所述实施方式，其中所述可检测标记物是质量标记物。

A34.A33的所述实施方式，其中所述质量标记物是质量可区分标签，其位于所述寡核苷酸与扩增子杂交的区域的5'处，或终止核苷酸含有所述质量可区分标签。

A35.如实施方式A33或A34所述的方法，其包括在捕获所述延伸的寡核苷酸之后洗涤所述固相。

A36.A35的所述实施方式，其中所述洗涤去除在质谱分析中产生干扰性加合物的盐。

A37.如实施方式A33至A36中任一项所述的方法，其中延伸的寡核苷酸不与离子交换树脂接触。

A38.如实施方式A1至A30和A33至A37中任一项所述的方法，其中检测是通过质谱分析。

A39.如实施方式A1至A38中任一项所述的方法，其还包括确定各种靶核酸相对于高丰度变体量的低丰度变体量，其包括基于所述低丰度变体特异性终止核苷酸浓度和所述高丰度变体特异性终止核苷酸浓度之比的标准化。

B1.一种检测多种核酸的变体存在与否以及量的并行式方法，其包括：

(a)制备衍生自多种靶核酸或其部分的多个扩增子，其中各种靶核酸包括低丰度变体和高丰度变体；

(b)所述扩增子与多种寡核苷酸在单一反应中杂交从而生成杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自与靶核酸的扩增子特异性对应，其中(i)寡核苷酸与衍生自靶核酸所述低丰度变体和所述高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5’位置处杂交，所述靶核酸低丰度变体的所述单碱基位置与所述高丰度变体的所述单碱基位置不同，(ii)所述多种靶核酸各高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸相同或不同，(iii)所述多种靶核酸低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸都相同，并且(iv)所述多种靶核酸的高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸与所述多种靶核酸中的低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸无一相同；并且

(c)将杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包括针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸和针对一种或多种所述高丰度变体特异性的1、2或3种终止核苷酸；其中：(i)所述终止核苷酸包括捕获剂，(ii)针对一种或多种高丰度变体特异性的所述1、2或3种终止核苷酸各自的浓度是相对于针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.1％至30％，(iii)所述延伸条件包括多重热循环，从而生成含有针对所述多种靶核酸的低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸，和含有针对所述多种靶核酸的高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸；

(d)将所述延伸的寡核苷酸与固相在所述捕获剂与所述固相相互作用的条件下接触，从而在所述固相上捕获所述延伸的寡核苷酸，其中所述固相包括(c)中所述捕获剂的结合伴侣；

(e)通过在升高的温度条件下将固相与竞争物接触，释放(d)中所述延伸的寡核苷酸，其中所述竞争物含有(d)中与所述固相相互作用的所述捕获剂的游离形式；

(f)检测在(e)中释放的所述延伸的寡核苷酸；从而检测多种核酸的变体存在与否，并且

(g)对于在(f)中检测到存在的多种核酸的变体，确定各种靶核酸相对于高丰度变体的量的低丰度变体的量。

B2.如实施方式B1所述的方法，其中所述变体是单核甘酸多态性(SNP)变体，所述低丰度变体是低丰度等位基因并且所述高丰度变体是高丰度等位基因。

B3.如实施方式B1所述的方法，其中所述低丰度变体是突变的等位基因并且所述高丰度变体是等位基因的野生型。

B3.1如实施方式B1所述的方法，其中所述低丰度变体具有一个或多个插入或缺失并且所述高丰度变体不具有一个或多个插入和缺失。

B4.如实施方式B1至B3.1中任一项所述的方法，其中所述低丰度变体以所述高丰度变体拷贝数的2％或更小的拷贝数存在。

B4.1.如实施方式B1至B4中任一项所述的方法，其中所述低丰度变体以所述高丰度变体拷贝数的1％或更小的拷贝数存在。

B4.2.如实施方式B1至B4.1中任一项所述的方法，其中所述低丰度变体以相对于所述高丰度变体拷贝数的0.1％的拷贝数存在。

B5.如实施方式B1至B4.2中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由一种终止核苷酸组成。

B6.如实施方式A1至A4.2中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由两种不同的终止核苷酸组成。

B7.如实施方式A1至A4.2中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由三种不同的终止核苷酸组成。

B8.如实施方式B1至B7中任一项所述的方法，其中所述终止核苷酸独立选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。

B9.如实施方式B1至B7中任一项所述的方法，其中所述终止核苷酸包括一种或多种无环终止剂。

B9.1如实施方式B1至B9中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种、两种或三种终止核苷酸各自的浓度是相对于所述针对低丰度变体的特异性终止核苷酸浓度的0.5％至10％。

B9.2.如实施方式B1至B9中任一项所述的方法，其中所述针对高丰度变体特异性的一种、两种或三种终止核苷酸各自的浓度是相对于所述针对低丰度变体的特异性终止核苷酸浓度的1％至2％。

B10.如实施方式B1至B9.2中任一项所述的方法，其中各种核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的0.1％。

B11.如实施方式B1至B10中任一项所述的方法，其中(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述试剂去除所有未掺入扩增子的核苷酸的末端磷酸。

B12.如实施方式B1至B11中任一项所述的方法，其中通过将所述溶液与磷酸酶接触去除所述末端磷酸。

B13.如实施方式B12所述的方法，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶。

B14.如实施方式B13所述的方法，其中所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。

B15.如实施方式B1至B14中任一项所述的方法，其中所述多种靶核酸是10种或更多种靶核酸。

B16.如实施方式B1至B14中任一项所述的方法，其中所述多种靶核酸是20种或更多种靶核酸。

B17.如实施方式B1至B6中任一项所述的方法，其中(a)中所述延伸条件包括循环30至45次。

B18.如实施方式B1至B17中任一项所述的方法，其中(c)中所述延伸条件包括循环20至300次。

B19.如实施方式B1至B17中任一项所述的方法，其中(c)中所述延伸条件包括循环至少50次。

B20.如实施方式B1至B19中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包括亲和素、亲和素的类似物、链霉亲和素、链霉亲和素的类似物、生物素或生物素的类似物。

B21.如实施方式B1至B20中任一项所述的方法，其中所述结合伴侣选自下组：亲和素、亲和素的类似物、链霉亲和素、链霉亲和素的类似物、生物素或生物素的类似物。

B22.如实施方式B1至B21中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包括生物素，所述固相包括链霉亲和素并且所述竞争物包括游离生物素。

B23.如实施方式B1至B22中任一项所述的方法，其中所述升高的温度条件是约80℃至约100℃。

B24.如实施方式B1至B23中任一项所述的方法，其中所述升高的温度条件包括处理约1分钟至约10分钟。

B25.如实施方式B1至B24中任一项所述的方法，其中所述升高的温度条件包括以约90℃处理约5分钟。

B26.如实施方式B1至B25中任一项所述的方法，其中所述竞争物的浓度是约10ug/ml至约100ug/ml。

B27.如实施方式B26所述的方法，其中所述竞争物是约25ug/ml浓度的游离生物素或游离生物素类似物。

B28.如实施方式B1至B27中任一项所述的方法，其中没有检测到包含低丰度变体特异性终止核苷酸的延伸的寡核苷酸情况下，对包含针对高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸的检测提供针对假阴性结果的阳性对照。

B29.如实施方式B1至B28中任一项所述的方法，其中各延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。

B30.B29的所述实施方式，其中所述终止核苷酸包括可检测标记物。

B31.B29的所述实施方式，其中所述可检测标记物是荧光标记物。

B32.B31的所述实施方式，其中终止核苷酸包括荧光标记物。

B32.1.B31或B32的所述实施方式，其中通过电泳或实时PCR检测所述荧光标记物。

B33.B29的所述实施方式，其中所述可检测标记物是质量标记物。

B34.B33的所述实施方式，其中所述质量标记物是质量可区分标签，其位于所述寡核苷酸与扩增子杂交的区域的5'处，或终止核苷酸含有所述质量可区分标签。

B35.如实施方式B33或B34所述的方法，其包括在捕获所述延伸的寡核苷酸之后洗涤所述固相。

B36.B35的所述实施方式，其中所述洗涤去除在质谱分析中产生干扰性加合物的盐。

B37.如实施方式B33至B36中任一项所述的方法，其中延伸的寡核苷酸不与离子交换树脂接触。

B38.如实施方式B1至B30和B33至B37中任一项所述的方法，其中检测是通过质谱分析。

B39.如实施方式B1至B38中任一项所述的方法，其中确定各种靶核酸相对于高丰度变体量的低丰度变体量，其包括基于所述低丰度变体特异性终止核苷酸浓度和所述高丰度变体特异性终止核苷酸浓度之比的标准化。

***

本文中引用的各专利、专利申请、出版物和文献的全部内容均通过引用纳入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的现有技术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。

可以对上述内容进行改变而不背离本技术的基本方面。尽管参考一个或多个具体实施方式充分详细描述了本技术，但是本领域普通技术人员应认识到可对本申请中具体公开的实施方式进行改变，而这些改良和改进在本技术的范围和精神内。

本文中适当地说明性描述的技术可在没有任何本文未具体公开的元素的情况下实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包括”、“基本由……组成”和“由……组成中的任何一个都可用其它两个中的任意一个代替。”已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，此类术语和表达的使用并不排除对所显示和所描述的特征或其部分的任何等价物，以及在要求权利的本技术范围内可进行各种改良。术语“一个”或“一种”表示一种或多种其修饰的元素(例如，“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文清楚表示所描述的是元素之一或是一种以上的元素。本文所使用的术语“约”表示在基础参数的10％范围内的数值(即±10％)，在一列数值的开头处使用的术语“约”表示修饰该列数值中的每个数值(即“约1、2和3”指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量能包含90克至110克的重量。此外，当本文描述数值列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该列表包含其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。因此，应理解，尽管通过代表性实施方式和任选的特征具体公开了本技术，但是本领域技术人员能对本文所公开内容进行改良和变化，应认为此类改良和变化落在本技术的范围内。

本技术的某些实施方式在所附的权利要求中列出。

Claims (84)

1.一种检测多种核酸的变体存在与否的并行式方法，其包括：

(a)制备衍生自多种靶核酸或其部分的多个扩增子，其中各种靶核酸包括低丰度变体和高丰度变体；

(b)所述扩增子与多种寡核苷酸在单一反应中杂交从而生成杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自与靶核酸的扩增子特异性对应，其中(i)寡核苷酸与衍生自靶核酸所述低丰度变体和所述高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5’位置处杂交，所述靶核酸低丰度变体的所述单碱基位置与所述高丰度变体的所述单碱基位置不同，(ii)所述多种靶核酸各高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸相同或不同，(iii)所述多种靶核酸各低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸相同，并且(iv)所述多种靶核酸的高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸与所述多种靶核酸中的低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸无一相同；并且

(c)将杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包括针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸和针对一种或多种所述高丰度变体特异性的1、2或3种终止核苷酸；其中：(i)所述终止核苷酸包括捕获剂，(ii)所述针对一种或多种高丰度变体特异性的1、2或3种终止核苷酸各自的浓度是相对于针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.1％至30％，(iii)所述延伸条件包括多重热循环，从而生成含有针对所述多种靶核酸的低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸，和含有针对所述多种靶核酸的高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸；

(d)将所述延伸的寡核苷酸与固相在所述捕获剂与所述固相相互作用的条件下接触，从而在所述固相上捕获所述延伸的寡核苷酸，其中所述固相包括(c)中所述捕获剂的结合伴侣；

(e)通过在升高的温度条件下将所述固相与竞争物接触，释放(d)中所述延伸的寡核苷酸，其中所述竞争物含有(d)中与所述固相相互作用的所述捕获剂的游离形式；并且

(f)检测在(e)中释放的所述延伸的寡核苷酸；从而检测多种核酸的变体的存在与否。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述变体是单核甘酸多态性(SNP)变体，所述低丰度变体是低丰度等位基因并且所述高丰度变体是高丰度等位基因。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述低丰度变体是突变等位基因并且所述高丰度变体是等位基因的野生型。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述低丰度变体具有一个或多个插入或缺失并且所述高丰度变体不具有一个或多个插入和缺失。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述低丰度变体以所述高丰度变体拷贝数的2％或更小的拷贝数存在。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由一种终止核苷酸组成。

7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由两种不同的终止核苷酸组成。

8.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由三种不同的终止核苷酸组成。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述终止核苷酸独立选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。

10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述终止核苷酸包括一种或多种无环终止剂。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种、两种或三种终止核苷酸各自的浓度是相对于所述针对低丰度变体的特异性终止核苷酸浓度的0.5％至10％。

12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种、两种或三种终止核苷酸各自的浓度是相对于所述针对低丰度变体的特异性终止核苷酸浓度的1％至2％。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中各种核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的0.1％。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述试剂去除所有未掺入扩增子的核苷酸的末端磷酸。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述末端磷酸通过将所述溶液与磷酸酶接触去除。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。

17.实施方式A13的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸是10种或更多种靶核酸。

19.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸是20种或更多种靶核酸。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，(a)中所述延伸条件包括循环30至45次。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，(c)中所述延伸条件包括循环20至300次。

22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，(c)中所述延伸条件包括循环至少50次。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述捕获剂包括亲和素、亲和素的类似物、链霉亲和素、链霉亲和素的类似物、生物素或生物素的类似物。

24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，所述结合伴侣选自下组：亲和素、亲和素的类似物、链霉亲和素、链霉亲和素的类似物、生物素或生物素的类似物。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述捕获剂包括生物素，所述固相包括链霉亲和素并且所述竞争物包括游离生物素。

26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述升高的温度条件是约80℃至约100℃。

27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述升高的温度条件包括处理约1分钟至约10分钟。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中，所述升高的温度条件包括以约90℃处理约5分钟。

29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中，所述竞争物的浓度是约10ug/ml至约100ug/ml。

30.如权利要求29所述的方法，其中，所述竞争物是约25ug/ml浓度的游离生物素或游离生物素类似物。

31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中，在没有检测到包含低丰度变体特异性终止核苷酸的延伸寡核苷酸的情况下，对包含高丰度变体特异性终止核苷酸的延伸的寡核苷酸的检测提供针对假阴性结果的阳性对照。

32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述终止核苷酸包括可检测标记物。

34.如权利要求32所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物。

35.如权利要求34所述的方法，其中，所述终止核苷酸包括荧光标记物。

36.如权利要求32所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述质量标记物是质量可区分标签，其位于所述寡核苷酸与扩增子杂交的区域的5'处，或所述终止核苷酸含有所述质量可区分标签。

38.如权利要求36或37所述的方法，其包括在捕获所述延伸的寡核苷酸之后洗涤所述固相。

39.如权利要求38所述的方法，其中，所述洗涤去除在质谱分析中产生干扰性加合物的盐。

40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其中，延伸的寡核苷酸不与离子交换树脂接触。

41.如权利要求1至33和36至40中任一项所述的方法，其中，检测采用质谱分析。

42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其还包括确定各种靶核酸相对于高丰度变体量的低丰度变体量，其包括基于所述低丰度变体特异性终止核苷酸浓度和所述高丰度变体特异性终止核苷酸浓度之比的标准化。

43.一种检测多种核酸的变体存在与否以及量的并行式方法，其包括：

(a)制备衍生自多种靶核酸或其部分的多个扩增子，其中各种靶核酸包括低丰度变体和高丰度变体；

(b)所述扩增子与多种寡核苷酸在单一反应中杂交从而生成杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸与靶核酸的扩增子各自特异性对应，其中(i)寡核苷酸与衍生自靶核酸的所述低丰度变体和所述高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5’位置处杂交，所述靶核酸低丰度变体的所述单碱基位置与所述高丰度变体的所述单碱基位置不同，(ii)所述多种靶核酸的各高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸相同或不同，(iii)所述多种靶核酸低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸都相同，并且(iv)所述多种靶核酸的高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸与所述多种靶核酸的低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸无一相同；并且

(c)将杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包括针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸和针对一种或多种所述高丰度变体特异性的1、2或3种终止核苷酸；其中：(i)所述终止核苷酸包括捕获剂，(ii)针对一种或多种高丰度变体特异性的所述1、2或3种终止核苷酸各自的浓度是相对于针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.1％至30％，(iii)所述延伸条件包括多重热循环，从而生成含有针对所述多种靶核酸的低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸，和含有针对所述多种靶核酸的高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸；

(d)将所述延伸的寡核苷酸与固相在所述捕获剂与所述固相相互作用的条件下接触，从而在所述固相上捕获所述延伸的寡核苷酸，其中所述固相包括(c)中所述捕获剂的结合伴侣；

(e)通过在升高的温度条件下将固相与竞争物接触，释放(d)中所述延伸的寡核苷酸，其中所述竞争物含有(d)中与所述固相相互作用的所述捕获剂的游离形式；

(f)检测在(e)中释放的所述延伸的寡核苷酸；从而检测多种核酸的变体的存在与否，并且

(g)对于在(f)中检测到存在的多种核酸的变体，确定各种靶核酸相对于高丰度变体的量的低丰度变体的量。

44.如权利要求43所述的方法，其中，所述变体是单核甘酸多态性(SNP)变体，所述低丰度变体是低丰度等位基因并且所述高丰度变体是高丰度等位基因。

45.如权利要求43所述的方法，其中，所述低丰度变体是突变等位基因并且所述高丰度变体是等位基因的野生型。

46.如权利要求43所述的方法，其中，所述低丰度变体具有一个或多个插入或缺失并且所述高丰度变体不具有一个或多个插入和缺失。

47.如权利要求43至47中任一项所述的方法，其中，所述低丰度变体以所述高丰度变体拷贝数的2％或更小的拷贝数存在。

48.如权利要求43至47中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由一种终止核苷酸组成。

49.如权利要求43至47中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由两种不同的终止核苷酸组成。

50.如权利要求43至47中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种或多种终止核苷酸由三种不同的终止核苷酸组成。

51.如权利要求43至50中任一项所述的方法，其中，所述终止核苷酸独立选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。

52.如权利要求43至50中任一项所述的方法，其中所述终止核苷酸包括一种或多种无环终止剂。

53.如权利要求43至52中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种、两种或三种终止核苷酸各自的浓度是相对于所述针对低丰度变体的特异性终止核苷酸浓度的0.5％至10％。

54.如权利要求43至52中任一项所述的方法，其中，所述针对高丰度变体特异性的一种、两种或三种终止核苷酸各自的浓度是相对于所述针对低丰度变体的特异性终止核苷酸浓度的1％至2％。

55.如权利要求43至54中任一项所述的方法，其中各种核酸的低丰度变体和高丰度变体的总拷贝数是至少约1000个拷贝，并且所述低丰度变体占所述总拷贝数的0.1％。

56.如权利要求43至55中任一项所述的方法，其中，(a)中产生的所述扩增子与去除末端磷酸的试剂接触，所述试剂去除所有未掺入扩增子的核苷酸的末端磷酸。

57.如权利要求56所述的方法，其中，所述末端磷酸通过将所述溶液与磷酸酶接触去除。

58.如权利要求57所述的方法，其中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶。

59.如权利要求58所述的方法，其中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。

60.如权利要求43至59中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸是10种或更多种靶核酸。

61.如权利要求43至59中任一项所述的方法，其中，所述多种靶核酸是20种或更多种靶核酸。

62.如权利要求43至61中任一项所述的方法，其中，(a)中所述延伸条件包括循环30至45次。

63.如权利要求43至62中任一项所述的方法，其中，(c)中所述延伸条件包括循环20至300次。

64.如权利要求43至62中任一项所述的方法，其中，(c)中所述延伸条件包括循环至少50次。

65.如权利要求43至64中任一项所述的方法，其中，所述捕获剂包括亲和素、亲和素的类似物、链霉亲和素、链霉亲和素的类似物、生物素或生物素的类似物。

66.如权利要求43至65中任一项所述的方法，其中，所述结合伴侣选自下组：亲和素、亲和素的类似物、链霉亲和素、链霉亲和素的类似物、生物素或生物素的类似物。

67.如权利要求43至66中任一项所述的方法，其中，所述捕获剂包括生物素，所述固相包括链霉亲和素并且所述竞争物包括游离生物素。

68.如权利要求43至67中任一项所述的方法，其中，所述升高的温度条件是约80℃至约100℃。

69.如权利要求43至68中任一项所述的方法，其中，所述升高的温度条件包括处理约1分钟至约10分钟。

70.如权利要求43至69中任一项所述的方法，其中，所述升高的温度条件包括以约90℃处理约5分钟。

71.如权利要求43至70中任一项所述的方法，其中，所述竞争物的浓度是约10ug/ml至约100ug/ml。

72.如权利要求71所述的方法，其中，所述竞争物是约25ug/ml浓度的游离生物素或游离生物素类似物。

73.如权利要求43至72中任一项所述的方法，其中，在没有检测到包含低丰度变体特异性终止核苷酸的延伸的寡核苷酸的情况下，对包含高丰度变体特异性终止核苷酸的延伸的寡核苷酸的检测提供针对假阴性结果的阳性对照。

74.如权利要求43至73中任一项所述的方法，其中，各延伸的寡核苷酸包括可检测标记物。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述终止核苷酸包括可检测标记物。

76.如权利要求74所述的方法，其中，所述可检测标记物是荧光标记物。

77.如权利要求76所述的方法，其中，所述终止核苷酸包括荧光标记物。

78.如权利要求74所述的方法，其中，所述可检测标记物是质量标记物。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述质量标记物是质量可区分标签，其位于所述寡核苷酸与扩增子杂交的区域的5'处，或所述终止核苷酸含有所述质量可区分标签。

80.如权利要求78或79所述的方法，其包括在捕获所述延伸的寡核苷酸之后洗涤所述固相。

81.如权利要求80所述的方法，其中，所述洗涤去除在质谱分析中产生干扰性加合物的盐。

82.如权利要求78至81中任一项所述的方法，其中，延伸的寡核苷酸不与离子交换树脂接触。

83.如权利要求43至75和78至82中任一项所述的方法，其中，检测采用质谱分析。

84.如权利要求43至83中任一项所述的方法，其中确定各种靶核酸相对于高丰度变体量的低丰度变体量，其包括基于所述低丰度变体特异性终止核苷酸浓度和所述高丰度变体特异性终止核苷酸浓度之比的标准化。