CN109627326B - 一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于胶原蛋白技术领域，尤其涉及一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法。本发明提供了一种非变性胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：a)将胶原蛋白加入孵育液进行孵育，离心，得到不溶物；b)将所述不溶物依次进行酶解、中和、盐析，得到非变性胶原蛋白；其中，所述孵育液选自Tris‑HCl溶液、Bis‑Tris溶液、咪唑缓冲液或胰蛋白酶培养液。实验结果表明，本发明采用孵育液对胶原蛋白进行孵育，可除去变性胶原蛋白，对非变性胶原蛋白进行提取，可提高胶原蛋白产品的活性。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白技术领域，尤其涉及一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命，蛋白质是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与，人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。如载体蛋白对维持人体的正常生命活动至关重要，可以在体内运载各种物质；人体细胞里每分钟要进行一百多次生化反应，酶对生化反应具有催化和调节功能，并且酶有促进食物的消化、吸收、利用的作用；球蛋白是一种存在于人体中的血清蛋白，被称为免疫球蛋白，具有免疫作用。
胶原蛋白是一种生物高分子纤维蛋白，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。胶原蛋白主要从动物皮肤或骨骼(如鱼皮/鳞、猪皮/骨、牛皮/骨等)中进行提取得到，再进行水解得到胶原蛋白肽，胶原蛋白肽可溶于冷水，且易被人体吸收利用，具有伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等功效。胶原蛋白有不同的类型，目前为止已经发现了几十种。其中Ⅰ型胶原蛋白主要存在于皮肤血管等结缔组织中；Ⅱ型胶原蛋白主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织，对消化酶有一定抵抗作用，口服后有可能在小肠经胰蛋白酶作用产生活性片段，刺激胃肠道黏膜免疫系统，从而起到口服诱导免疫耐受的作用，可预防或缓解类风湿性关节炎病症；Ⅲ胶原蛋白型在皮肤、血管壁、子宫壁中含量丰富；Ⅳ型主要在晶状体中含量丰富；Ⅴ型主要在皮肤和血管壁中含量丰富。
胶原蛋白会在高温和酸水解中变性，形成变性胶原蛋白，变性胶原蛋白的三、四级结构会遭到破坏，使得胶原蛋白的活性降低。但是，现有技术还不能对胶原蛋白进行纯化，进行非变性胶原蛋白的提取。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法，用于解决现有技术不能对胶原蛋白进行纯化，进行非变性胶原蛋白的提取的问题。
本发明的具体技术方案如下：
一种非变性胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：
a)将胶原蛋白加入孵育液进行孵育，离心，得到不溶物；
b)将所述不溶物依次进行酶解、中和、盐析，得到非变性胶原蛋白；
其中，所述孵育液选自Tris-HCl溶液、Bis-Tris溶液、咪唑缓冲液或胰蛋白酶培养液。
实验结果表明，本发明采用孵育液对胶原蛋白进行孵育，可除去变性胶原蛋白，对非变性胶原蛋白进行提取，可提高胶原蛋白产品的活性。
本发明中，孵育液优选为胰蛋白酶培养液，胰蛋白酶培养液的制备方法包括：将胰蛋白酶溶于提取缓冲液中，搅拌均匀，并用水稀释得到。
提取缓冲液通过将10～50mg蛋白酶抑制剂、0～2g碘乙酰胺、0～30g EDTA和Tris混合，加入10～20mL 0.5M HCl，用水稀释得到。
胰蛋白酶在胰蛋白酶培养液中的质量浓度为0.5～3.0mg/mL，优选为2.0mg/mL。
Tris-HCl溶液的浓度为0～0.05M，优选为0.01M。Bis-Tris溶液的浓度为0.02～0.2M，优选为0.05M。咪唑缓冲液的浓度为0.02～0.1M，优选为0.05M。
优选的，所述孵育的温度为20℃～40℃；
所述孵育的时间为24h～48h。
优选的，步骤a)之前，还包括：
将胶原蛋白置于盐酸胍溶液中搅拌，离心去除上清液，得到纯化胶原蛋白。
实验结果表明，将胶原蛋白置于盐酸胍溶液中搅拌，离心去除上清液，可对胶原蛋白进行纯化，除去胶原蛋白中的杂蛋白和透明质酸等杂质，得到纯化胶原蛋白。
优选的，所述胶原蛋白的质量与所述盐酸胍溶液的浓度比为(1～5)g：(4～8)mol/L。
本发明中，得到纯化胶原蛋白之后，步骤a)之前，还包括：在纯化胶原蛋白中加入提取缓冲液，离心去除上清液。
本发明中，步骤a)之前，步骤b)之前，还包括：将不溶物进行冷冻干燥，研磨成粉末不溶物。
酶解的具体步骤包括：将粉末不溶物用醋酸水溶液进行溶解，再向粉末不溶物与醋酸水溶液的混合溶液中添加蛋白酶，进行酶解，得到酶解液。
中和和盐析的具体步骤包括：在酶解液中滴加NaOH调节pH值至中性再加入NaCl进行盐析，得到盐析物。
本发明还提供了一种胶原蛋白的鉴定方法，包括以下步骤：
A)采用上述技术方案所述非变性胶原蛋白提取方法对胶原蛋白进行提取，得到非变性胶原蛋白；
B)将所述非变性胶原蛋白进行电泳，根据电泳结果确定所述胶原蛋白的类型。
本发明中，电泳为SDS-PAGE电泳，电泳结果包括出现电泳条带和不出现电泳条带。
优选的，步骤B)所述根据电泳结果确定所述胶原蛋白的类型具体包括：
若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白。
本发明中，步骤B)电泳的上样浓度为1mg/mL～5mg/mL。
不同构型的胶原蛋白都具有特定的活性功能，目前市场上存在不同构型胶原蛋白鱼龙混杂现象，但是，尚未开发出一套可以清楚鉴别不同构型胶原蛋白的方法。因此，迫切需要建立便捷灵敏快速的检测方法，来有效鉴别不同胶原蛋白空间构象和纯度，进而堵住市场监管上的漏洞，使伪劣产品无所遁形。
变性胶原蛋白和非变性胶原蛋白在分子量、空间构型存在显著差异，非变性胶原蛋白空间结构为典型的三股螺旋结构，通过上述技术方案对胶原蛋白进行非变性胶原蛋白提取后，仅保留非变性胶原蛋白，若可以通过SDS-PAGE电泳检测到条带，表明胶原蛋白中含有非变性胶原蛋白，若检测不到条带，表明胶原蛋白已变性，蛋白质结构遭到破坏，无法检测，不含非变性胶原蛋白，本发明实现了对胶原蛋白进行变性胶原蛋白和非变性胶原蛋白的检测。
非变性胶原蛋白可以通过不同构型来判断纯度，常见胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白。
优选的，所述若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白具体包括：
若所述电泳条带位于110kd、130kd和280kd，所述胶原蛋白含非变性I型胶原蛋白。
优选的，所述若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白具体包括：
若所述电泳条带仅位于130kd和280kd，所述胶原蛋白含非变性II型胶原蛋白。
本发明中，Ⅰ型胶原蛋白电泳结果中存在一条110KDa左右、一条130KDa左右α螺旋条带和一条280KDa左右的β(α螺旋二聚体)条带；Ⅱ型胶原蛋白电泳结果中存在一条130KDa左右α螺旋条带和一条280KDa左右β(α螺旋二聚体)条带。以110KDa和130KDa左右两条带为Ⅰ型胶原蛋白空间构型特征标记物；以单一的130KDa左右蛋白条带为Ⅱ型胶原蛋白空间构型的特征标记物，将非变性胶原蛋白进行电泳可实现对非变性Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白的鉴定。
不同物种来源、不同部位来源的胶原蛋白的类型一般不同，本发明根据电泳条带的位置和数量可以对不同物种来源、不同部位的胶原蛋白进行定性的结构鉴定。
优选的，步骤B)之后，还包括：
步骤C)将所述非变性胶原蛋白采用圆二色谱法进行检测，确定所述胶原蛋白的二级结构。
优选的，步骤C)所述确定所述胶原蛋白的二级结构具体包括：
若所述非变性胶原蛋白的吸收峰值均为负值，所述胶原蛋白无三螺旋结构。
胶原蛋白的二级结构没有受到破坏，即具有三螺旋结构时，在圆二色谱法检测下，会出现明显的正、负吸收谱带。蛋白质的CD信号反映了二级结构元件的总和，能估算未知结构蛋白质的螺旋、链和转角的比例。胶原蛋白出现的正吸收峰与反式肽键的聚脯氨酸构型肽链有关，而其负吸收峰的出现与无规卷曲有直接的关系。由圆二色谱结果可以得到不同胶原蛋白空间二级结构形态，实现对非变性胶原蛋白定性的结构鉴别分析。
本发明中，采用圆二色谱法进行检测的具体步骤包括：用0.01～0.1mol/L的乙酸配制加样浓度为0.2～0.5mg/mL的非变性胶原蛋白溶液，5000～10000rpm于4℃冷冻离心，取上清，采用圆二色谱仪进行光谱扫描，比色皿光程为1mm，扫描波长范围为190-260nm。
相同物种来源和相同部位的胶原蛋白的类型基本一致，本发明胶原蛋白的鉴定方法可对胶原蛋白的空间构象和纯度进行检测，可根据胶原蛋白中的非变性胶原蛋白的类型定性鉴别不同物种来源、不同部位的胶原蛋白空间构型。
本发明胶原蛋白的鉴定方法通先将胶原蛋白进行纯化，去除变性胶原蛋白及透明质酸等杂质，仅保留非变性胶原蛋白，再利用SDS-PAGE电泳方法、圆二色谱法对不同构型胶原蛋白结构进行定性的鉴定，试剂、设备和技术要求简单，操作简便，结果直观；鉴定结果可以清楚的得到检测的胶原蛋白是变性胶原蛋白还是非变性胶原蛋白，明确其空间构象，辨别市场上相关产品的功能宣称的真伪，结果呈现速度快、效率高，可对大量样品进行批量鉴定；鉴定结果准确可靠，根据电泳条带的位置和数量可以对不同物种来源、不同部位的胶原蛋白进行定性的结构鉴定，方法准确、快速、可靠。
综上所述，本发明提供了一种非变性胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：a)将胶原蛋白加入孵育液进行孵育，离心，得到不溶物；b)将所述不溶物依次进行酶解、中和、盐析，得到非变性胶原蛋白；其中，所述孵育液选自Tris-HCl溶液、Bis-Tris溶液、咪唑缓冲液或胰蛋白酶培养液。实验结果表明，本发明采用孵育液对胶原蛋白进行孵育，可除去变性胶原蛋白，对非变性胶原蛋白进行提取，可提高胶原蛋白产品的活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中变性胶原蛋白的电泳结果图；
图2为本发明实施例1中1号胶原蛋白的电泳结果图；
图3为本发明实施例1中2号胶原蛋白和3号胶原蛋白的电泳结果图；
图4为本发明实施例1中4号胶原蛋白的电泳结果图；
图5为本发明实施例1中1号胶原蛋白进行圆二色谱法检测的结果图；
图6为本发明实施例1中2号胶原蛋白进行圆二色谱法检测的结果图；
图7为本发明实施例1中3号胶原蛋白进行圆二色谱法检测的结果图；
图8为本发明实施例1中4号胶原蛋白进行圆二色谱法检测的结果图；
图9本发明实施例3中纯化前后的胶原蛋白的电泳结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法，用于解决现有技术不能对胶原蛋白进行纯化，进行非变性胶原蛋白的提取的问题。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，使用的试剂均为分析纯，实验用水均为实验室一级用水。蛋白酶购自上海瑞永生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂购自上海瑞永生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷购自上海麦克林生化科技有限公司；蛋白酶的酶活性为1000U/mg，购自上海麦克林生化科技有限公司；盐酸胍购自源叶生物；乙二胺四乙酸购自美国SIGMA；电泳胶为SDS-PAGE电泳的12％预制电泳胶；蛋白Marker的分子量为50KD～240KD。
本发明实施例中，使用的仪器有集热式恒温加热磁力搅拌器、万分之一电子天平、冷冻离心机、pH计、2～20μL移液器、电泳仪、凝胶成像系统、圆二色谱仪、超声波清洗机、脱色摇床、冰箱、水浴锅。
本发明实施例中，0～0.5M Tris-HCl缓冲液通过称取Tris，加0～10mL HCl，用水稀释得到。提取缓冲液通过称取10～50mg蛋白酶抑制剂、0～2g碘乙酰胺、0～30g EDTA，再称取Tris，加10～20mL HCl，用水稀释得到。考马斯亮蓝染色液通过称取考马斯亮蓝R-250，加100～250mL异丙醇、50～100mL冰醋酸和去离子水搅拌均匀，用滤纸除去颗粒物质后得到，并室温保存备用。脱色液通过将冰醋酸和50～100mL无水乙醇混合，加去离子水定容，搅拌均匀得到，并室温保存备用。胰蛋白酶培养液通过称取1～5g胰蛋白酶，溶于300～800mL提取缓冲液中，搅拌均匀，并用水稀释得到。
实施例1
本实施例对五份胶原蛋白进行鉴定，五份胶原蛋白分别为变性胶原蛋白、1号胶原蛋白、2号胶原蛋白、3号胶原蛋白和4号胶原蛋白，每份胶原蛋白的鉴定均包括以下步骤：
1)在250mL耐热玻璃瓶中称量2g胶原蛋白样品，将胶原蛋白样品中加入100～200mL 1M盐酸胍溶液并在4℃冰箱搅拌过夜，3000rpm离心2min，除去上清液，得到第一沉淀物，重复上述步骤(加入盐酸胍溶液至除去上清液)一次，在第一沉淀物中加入10～50mL提取缓冲液在4℃冰箱搅拌2h，3000rpm离心2min，除去上清液，得到第二沉淀物。
2)在第二沉淀物中加入50～200mL胰蛋白酶培养液后，在37℃水浴中孵育过夜，同时连续搅拌；从水浴中取出并3000rpm离心2min，除去上清液，得到不溶物，将不溶物取出冷冻干燥，并研磨成粉末状，得到粉末不溶物。
3)将粉末不溶物用pH为2的醋酸水溶液进行溶解，其中，粉末不溶物的质量与醋酸水溶液的体积比为1g：15mL；再向粉末不溶物与醋酸水溶液的混合溶液中添加蛋白酶，在4℃下进行24h酶解，每隔1h搅拌均匀，得到酶解液，其中，蛋白酶与粉末不溶物的质量比为1：100；再将酶解液过滤，向滤液中缓慢滴加浓NaOH(10mol/L)，调节pH值至中性，再边搅拌边缓慢加入NaCl(NaCl最终浓度为4～5mol/L)，盐析过夜，得到盐析物；将盐析物离心，取第三沉淀物，再次水洗离心3次(每次离心3000rpm，20min)，将第三沉淀物冷冻干燥，得到非变性胶原蛋白。
4)将预制电泳胶放入电泳槽，加样槽朝向内侧，将电泳液导入中间槽内，倒满电泳液，加样槽的外侧也加上2/3电泳液，拔掉梳子，检查中间槽不漏液；将5～10μL蛋白marker加入一侧(marker无需进行预处理，直接上样)，再依次加入不同浓度的非变性胶原蛋白样品30μL于加样孔内(非变性胶原蛋白样品中的蛋白量为50μg)；在100V电压下进行10～15min电泳，蛋白marker和非变性胶原蛋白样品跑至浓缩胶和分离胶的分界处，再在50V电压下进行40～80min电泳，蛋白Marker明显跑开并且可分辨出非变性胶原蛋白样品中的溴酚蓝跑出胶外，结束电泳；将电泳胶置于加有考马斯亮蓝R250染色液的染色皿中进行染色，染色液漫过电泳胶，再置于摇床上摇荡1h，完成后将染色液倒掉并用水对电泳胶进行清洗；取出染色过的电泳胶放于加有脱色液的染缸里进行脱色，脱色液漫过电泳胶，再置于摇床上摇荡1h，电泳胶本底色脱净，电泳胶上的条带清晰可见，完成后倒掉脱色液；采用凝胶成像系统对脱色后的电泳胶进行成像拍照，选择考马斯亮蓝选项，板子换成白色成像版，绿色标记朝上，图像用Image Lab软件进行分析处理。
5)将步骤3)非变性胶原蛋白配制成加样浓度为0.25mg/mL的非变性胶原蛋白溶液，10000rpm于4℃冷冻离心20min，取上清，采用圆二色谱仪于10℃进行光谱扫描，比色皿光程为1mm，扫描波长范围为190～260nm。
实施例2
本实施例对实施例1结果进行分析，请参阅图1至图8，图1和图2分别为本发明实施例1中变性胶原蛋白和1号胶原蛋白的电泳结果图，图3为本发明实施例1中2号胶原蛋白和3号胶原蛋白的电泳结果图，图4为本发明实施例1中4号胶原蛋白的电泳结果图。图5至图8依次为本发明实施例1中1号胶原蛋白、2号胶原蛋白、3号胶原蛋白和4号胶原蛋白进行圆二色谱法检测的结果图。
图1表明，变性胶原蛋白经实施例1处理后进行电泳未见电泳条带，说明本发明采用胰蛋白酶培养液对胶原蛋白进行孵育再离心，能够去除变性胶原蛋白，进行非变性胶原蛋白的提取；图2表明1号胶原蛋白为变性胶原蛋白，在制备工艺中，因高温或者强酸强碱使其结构破坏，蛋白质变性，变成分子量更小的一类多肽物质；图3中，2号胶原蛋白和3号胶原蛋白在130KD左右处存在明显条带，3号胶原蛋白在280KDa左右处存在一条电泳条带，2号胶原蛋白在115KD～140KD分布中存在一条电泳条带，表明2号样品含有非纯的非变性Ⅱ型胶原蛋白，可能是含有不同物种来源的非变性Ⅱ型胶原蛋白的混合物，3号胶原蛋白含有非变性Ⅱ型胶原蛋白；图4中，4号胶原蛋白在130KD和280KD左右各存在一条电泳条带，表明4号胶原蛋白含有非变性Ⅱ型胶原蛋白。
图6和图7表明，2号胶原蛋白和3号胶原蛋白在198nm左右有强的负吸收峰，为Ⅱ型胶原蛋白构象中无规则卷曲结构的典型特征；在波长221nm左右有弱的正吸收峰，为左旋聚脯氨酸(P-Ⅱ)构型肽链圆二色谱的典型特征，213nm处为0，为胶原蛋白三螺旋结构的典型特征，说明2号胶原蛋白和3号胶原蛋白的三螺旋结构没有被破坏。结合电泳图，确定3号胶原蛋白含有非变性Ⅱ型胶原蛋白，2号胶原蛋白同时含有非变性I型胶原蛋白和非变性Ⅱ型胶原蛋白。
图5和图8表明，1号胶原蛋白和4号胶原蛋白没有正吸收谱带，4号胶原蛋白的负吸收峰明显上移，由圆二色谱法检测的结构图可知1号胶原蛋白和4号胶原蛋白未见胶原蛋白的特征螺旋结构，4号样品的吸收峰值均为负值且绝对值减小，4号胶原蛋白的三螺旋结构遭到破坏。
实施例3
本实施例对采用盐酸胍进行纯化前后的胶原蛋白进行电泳分析，结果如图9所示，结果表明，纯化前的胶原蛋白条带较多，大多为小分子量的肽段，纯化前的胶原蛋白中存在完整结构遭到破坏的蛋白质组分，检测出杂蛋白质，同时也存在140KD左右的条带，表明纯化前的胶原蛋白中存在胶原蛋白和杂蛋白；纯化后的胶原蛋白条带单一，符合典型的Ⅱ型胶原蛋白分子量分布特点，蛋白结构完整，未被破坏，只检测出胶原蛋白，结果表明样品经过纯化后可去除杂蛋白。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种非变性胶原蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在250mL耐热玻璃瓶中称量2g胶原蛋白样品，将胶原蛋白样品中加入100～200mL 1M盐酸胍溶液并在4℃冰箱搅拌过夜，3000rpm离心2min，除去上清液，得到第一沉淀物，重复上述步骤一次，在第一沉淀物中加入10～50mL提取缓冲液在4℃冰箱搅拌2h，3000rpm离心2min，除去上清液，得到第二沉淀物；
2)在第二沉淀物中加入50～200mL胰蛋白酶培养液后，在37℃水浴中孵育过夜，同时连续搅拌；从水浴中取出并3000rpm离心2min，除去上清液，得到不溶物，将不溶物取出冷冻干燥，并研磨成粉末状，得到粉末不溶物；
3)将粉末不溶物用pH为2的醋酸水溶液进行溶解，其中，粉末不溶物的质量与醋酸水溶液的体积比为1g：15mL；再向粉末不溶物与醋酸水溶液的混合溶液中添加蛋白酶，在4℃下进行24h酶解，每隔1h搅拌均匀，得到酶解液，其中，蛋白酶与粉末不溶物的质量比为1：100；再将酶解液过滤，向滤液中缓慢滴加10mol/L的NaOH，调节pH值至中性，再边搅拌边缓慢加入NaCl至NaCl的浓度为4～5mol/L，盐析过夜，得到盐析物；将盐析物离心，取第三沉淀物，再次水洗离心3次，每次离心3000rpm，20min，将第三沉淀物冷冻干燥，得到非变性胶原蛋白；
所述胰蛋白酶培养液的制备方法包括：将胰蛋白酶溶于提取缓冲液中，搅拌均匀，并用水稀释得到；提取缓冲液通过将10～50mg蛋白酶抑制剂、0～2g碘乙酰胺、0～30g EDTA和Tris混合，加入10～20mL 0.5M HCl，用水稀释得到。
2.一种胶原蛋白的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)采用权利要求1所述非变性胶原蛋白提取方法对胶原蛋白进行提取，得到非变性胶原蛋白；
B)将所述非变性胶原蛋白进行电泳，根据电泳结果确定所述胶原蛋白的类型。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤B)所述根据电泳结果确定所述胶原蛋白的类型具体包括：
若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白具体包括：
若所述电泳条带位于110kd、130kd和280kd，所述胶原蛋白含非变性I型胶原蛋白。
5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述若出现电泳条带，所述胶原蛋白含非变性胶原蛋白具体包括：
若所述电泳条带仅位于130kd和280kd，所述胶原蛋白含非变性II型胶原蛋白。
6.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤B)之后，还包括：
步骤C)将所述非变性胶原蛋白采用圆二色谱法进行检测，确定所述胶原蛋白的二级结构。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，步骤C)所述确定所述胶原蛋白的二级结构具体包括：
若所述非变性胶原蛋白的吸收峰值均为负值，所述胶原蛋白无三螺旋结构。
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| GR01 | Patent grant | ||
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