CN103088096A - 一种以蕲蛇为原料提取ⅱ型胶原蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法。所述方法包括：将蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液除去蛋白多糖；除去多糖后收集沉淀，用乙酸溶液溶解沉淀；溶液采用胃蛋白酶酶解释放Ⅱ型胶原蛋白；酶解液离心后取上清进行盐析充分沉淀Ⅱ型胶原蛋白；离心收集沉淀Ⅱ型胶原蛋白离心并用乙酸再次溶解，溶解液透析除胃蛋白酶和其他杂蛋白；透析袋中Ⅱ型胶原蛋白再次使用乙酸溶解并透析除去盐离子；将透析后的袋内液体低温冷冻真空干燥，得到蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白。本发明的有益效果主要体现在：本发明方法操作简单，制得Ⅱ型胶原蛋白纯度高。

Description

一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法。 

（二）背景技术

Ⅱ型胶原（collagen typeⅡ，CⅡ）是软骨基质的主要有机成分，是关节软骨中主要细胞外间质之一。近年来研究表明，类风湿性关节炎的发病与CⅡ自身免疫反应有关[Deyl Z, Miksik I, Eckhardt A. Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins [J].Chromatography B, 2003,79(12): 245-275. Smolen JS, Hayer S, Schett G, et al. Immunosenescence autoimmunity and Rheumatoid Arthritis [J]. Autoimmunity and rheumatoid arthritis, 2004, 31(1): 23-25.]，用CⅡ免疫某些动物可诱导出实验性关节炎[Sweeney SE, Firestein GS. Rheumatoid arthritis: regulation of synovial inflammation [J]. Intern J Biochemical Cell Bio, 2004, 36(3): 372-378.]，口服CⅡ诱导免疫耐受对类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)有显著的疗效[卢延旭,陈敏珠.可溶性鸡Ⅱ型胶原对关节炎大鼠的免疫治疗作用[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9 (2): 180-183.]。因此，CⅡ的提取纯化与鉴定的研究具有较大的价值，获得纯化的CⅡ是进行相关研究的关键。虽然CⅡ在人体含量较多，但临床取材可获得的数量有限；CⅡ与蛋白多糖形成紧密的结合，难以用单纯的化学方法提取。目前所报道的方法，操作复杂，条件不一，结果存在差别。 

（三）发明内容

本发明目的是提供一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法。 

本发明采用的技术方案是： 

一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法，所述方法包括： 

（1）蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4~6℃搅拌24~30h，离心，去上清，沉淀用40~60 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4~5M，Tris-HCl浓度为40~60 mM； 

（2）步骤（1）所得沉淀用0.5~1 M乙酸水溶液重悬，以60~80%甲酸水溶液调节pH值为2~3，加入足量胃蛋白酶，4~6℃搅拌48~60h，离心，弃去沉淀； 

（3）步骤（2）得到上清液滴加5~6M NaCl溶液至NaCl浓度为0.8~0.9 M，4~6℃静置12~24h，离心，去除上清液； 

（4）步骤（3）得到沉淀用足量0.05~0.2 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20~30 mM Na₂HPO₄充分透析，所得沉淀再用足量0.05~0.2M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.05~0.2M乙酸溶液充分透析，所得液体真空干燥，得到所述Ⅱ型胶原蛋白的粉末。 

蕲蛇为蝰科动物五步蛇 Agkistrodon acutus（Güenther）的干燥体。【性味】甘、咸，温；有毒。【归经】归肝经。【功能主治】祛风，通络，止痉。用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼歪斜，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风疥癣。临床发现，蕲蛇是临床治疗风湿痹证的要药，对RA有明显的治疗作用[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社，2010:349.]，实验研究表明蕲蛇及Ⅱ型胶原蛋白对RA都具有一定的治疗作用[Kyung-Su Park, Min-Jung  Park, Mi-La Cho, et al. Type Ⅱ collagen oral tolerance; mechanism and role in collagen-induced arthritis and rheumatoid arthritis[J]. Modern Rheumatology, 2009,6(19):581-589.]。本发明选择蕲蛇为原料，用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析和透析处理等步骤，制备出高纯度（纯度96.93%）的Ⅱ型胶原蛋白，采用SDS-PAGE、紫外全波长扫描、HPLC和质谱对其进行了纯度分析和鉴定。 

所述蕲蛇粉末粒径不大于2mm。 

步骤（2）中胃蛋白酶加入量为300~800 U/g 蕲蛇粉末。 

步骤（1）中所述蕲蛇粉末与盐酸胍-Tris-HCl混合溶液用量之比为100g：1000~5000mL。 

步骤（2）中步骤（1）所得沉淀与乙酸水溶液用量之比为100g：1000~3000mL。 

具体的，所述方法如下： 

（1）蕲蛇粉碎至粒径为2mm，粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4℃搅拌24h，4℃、14000×g离心1h，去上清，沉淀用50 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4M，Tris-HCl浓度为50 mM，pH7.5； 

（2）步骤（1）所得沉淀用0.5 M乙酸水溶液重悬，以70%甲酸水溶液调节pH值为2.8，加入胃蛋白酶，4℃搅拌48h，4℃、14000×g离心1h，弃去沉淀；所述胃蛋白酶加入量为300~800 U/g 蕲蛇粉末； 

（3）步骤（2）得到上清液滴加5M NaCl溶液至NaCl浓度为0.8~0.9 M，46℃静置12h，4℃、14000×g离心1h，去除上清液； 

（4）步骤（3）得到沉淀用0.1 M乙酸溶解，转入截留分子量50000 道尔顿的透析袋中、用20 mM Na₂HPO₄于4℃下充分透析，所得沉淀再用0.1M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.1M乙酸溶液于4℃下充分透析，所得液体真空干燥，得到所述Ⅱ型胶原蛋白的粉末。 

本发明的有益效果主要体现在：本发明方法操作简单，制得Ⅱ型胶原蛋白纯度高。 

（四）附图说明

图1为本发明方法流程图； 

图2为蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白成品照片； 

图3为Ⅱ型胶原蛋白质SDS-PAGE电泳图； 

图4为蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白HPLC分析图； 

图5为蕲蛇与牛Ⅱ型胶原蛋白质紫外全波长扫波图谱； 

图6为蕲蛇与牛Ⅱ型胶原蛋白质谱图；上图为蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白，下图为牛Ⅱ型胶原蛋白。 

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： 

实施例1： 

方法如下： 

1、将蕲蛇（购自黄山市蛇类科学研究所）粉碎成粒径2 mm的粉末； 

2、将150克蕲蛇粉末置于2000 mL的4 M盐酸胍-50 mM的Tris-HCl混合溶液（pH7.5）中混悬，温度控制在4℃，搅拌24 h；4℃，14000×g 离心1 h，去上清液，沉淀用50 mM的Tris-HCl溶液洗去盐酸胍，4℃，14000×g离心1 h，去上清液； 

3、上步得到的沉淀用20倍沉淀体积的0.5 M乙酸重悬，并用70%的甲酸调节pH至2.8，向混悬液中加入5g胃蛋白酶（购自无锡中天食品添加剂有限公司，单位酶活15000U/g），4℃轻轻搅拌48 h； 

4、离心去除沉淀：4℃，14000×g，离心1 h，弃去沉淀（如果离心后由于粘稠度过高，分离不完全，可以用适量0.5 M乙酸稀释后重新离心）； 

5、沉淀CⅡ：向上一步得到的上清液中缓慢滴加5 M的NaCl，致使其终浓度为0.89 M，然后4℃静置12 h，以充分沉淀CⅡ；然后4℃，14000×g，离心1 h，去除上清，得到沉淀的CⅡ； 

6、将上一步得到的沉淀用100 mL的0.1 M乙酸4℃搅拌12 h，使其充分溶解；然后转入透析袋中（MWCO=50,000），20 mM Na₂HPO₄溶液（pH 9.4）4℃反复透析多次，透析袋中Ⅱ型胶原蛋白形成沉淀。 

7、将上步获得的Ⅱ型胶原蛋白沉淀用100 mL 0.1 M乙酸溶解，然后转入透析袋中（MWCO=10,000），用0.1 M乙酸，4℃充分透析以除去盐离子； 

8、冷冻干燥：将透析后的液体低温冷冻真空干燥，得到蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白冻干粉（图2）。 

所得蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白与牛Ⅱ型胶原蛋白作对照进行SDS-PAGE电泳观察分子量与纯度，结果见图3。显示本发明所提取蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白纯度较高（经HPLC方法测得纯度96.93%），分子量大约为130KD。 

所得蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白采用HPLC方法经峰归一化法检测纯度，按以下色谱条件进行：BioSep-SEC-S2000（7.8 mm×300 mm，5 μm）色谱柱，流动相为0.15 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH=4.7），流速1.0 ml/min，UV检测波长210 nm，柱温为室温。结果见图4，经本方法检测蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白纯度较高（为96.93%）。 

所得蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白与牛Ⅱ型胶原蛋白作对照进行全波长扫描，结果见图5。显示蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白与牛Ⅱ型胶原蛋白紫外吸收图谱相近，最大吸收波长均为223 nm。 

所得蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白与牛Ⅱ型胶原蛋白作对照进行蛋白质质谱分析，结果见图6。肽段质谱图显示蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白与牛Ⅱ型胶原蛋白相比具有相似肽段，具有Ⅱ型胶原蛋白结构特征。 

Claims (6)

1.一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法，所述方法包括：

（1）蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4~6℃搅拌24~30h，离心，去上清，沉淀用40~60 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4~5M，Tris-HCl浓度为40~60 mM；

（2）步骤（1）所得沉淀用0.5~1 M乙酸水溶液重悬，以60~80%甲酸水溶液调节pH值为2~3，加入足量胃蛋白酶，4~6℃搅拌48~60h，离心，弃去沉淀；

（3）步骤（2）得到上清液滴加5~6M NaCl溶液至NaCl浓度为0.8~0.9 M，4~6℃静置12~24h，离心，去除上清液；

（4）步骤（3）得到沉淀用足量0.05~0.2 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20~30 mM Na₂HPO₄充分透析，所得沉淀再用足量0.05~0.2M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.05~0.2M乙酸溶液充分透析，所得液体真空干燥，得到所述Ⅱ型胶原蛋白的粉末。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蕲蛇粉末粒径不大于2mm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中胃蛋白酶加入量为300~800 U/g 蕲蛇粉末。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述蕲蛇粉末与盐酸胍-Tris-HCl混合溶液用量之比为100g：1000~5000mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中步骤（1）所得沉淀与乙酸水溶液用量之比为100g：1000~3000mL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

（1）蕲蛇粉碎至粒径为2mm，粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4℃搅拌24h，4℃、14000×g离心1h，去上清，沉淀用50 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4M，Tris-HCl浓度为50 mM，pH7.5；

（2）步骤（1）所得沉淀用0.5 M乙酸水溶液重悬，以70%甲酸水溶液调节pH值为2.8，加入胃蛋白酶，4℃搅拌48h，4℃、14000×g离心1h，弃去沉淀；所述胃蛋白酶加入量为300~800 U/g蕲蛇粉末；

（3）步骤（2）得到上清液滴加5M NaCl溶液至NaCl浓度为0.8~0.9M，46℃静置12h，4℃、14000×g离心1h，去除上清液；

（4）步骤（3）得到沉淀用0.1 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20 mM Na₂HPO₄于4℃下充分透析，所得沉淀再用0.1M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.1M乙酸溶液于4℃下充分透析，所得液体真空干燥，得到所述Ⅱ型胶原蛋白的粉末。

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