CN102965414A

CN102965414A - 一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法

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Publication number: CN102965414A
Application number: CN2012104878016A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 刘佳; 吴秋林; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangxi Runze Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2032-11-27
Also published as: CN102965414B

Abstract

本发明阐述了一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，即以研究室保藏产硫酸软骨素菌株为生产菌株，在7L罐中发酵后收集发酵液，将发酵液进行预处理，然后用乙醇沉淀和氯仿萃取去除发酵液中的蛋白质等杂质，再利用超滤离心管反复三次离心除去发酵液中的小分子物质，最后将浓缩液真空冷冻干燥48h得到硫酸软骨素纯品。本发明经过浓缩后大大节约了使用乙醇的量，氯仿可以回收利用，同时使用超滤离心管对于小量制备硫酸软骨素纯品更加快捷、方便。

Description

一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法

技术领域

一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，属于生物工程领域，特别是从发酵液中而非动物中提取硫酸软骨素。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一种酸性的黏多糖，其二糖单体由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3键相连，糖链生成后由磺基转移酶在GalNAc的碳4位或碳6位进行硫酸化，如图1。根据其化学组成和结构差异可分为A、B、C、D、E、F、H等多种，通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以CS-A、CS-C为主。

CS是一类重要的生物高分子，具有广泛的生物活性，其作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。硫酸软骨素具有以下生物活性：镇痛抗炎作用；促进成骨细胞增生，诱导新骨形成；抗肿瘤作用；抗粘连作用；免疫调节作用；调血脂、抗动脉粥样硬化作用；抗氧化、清除自由基和廷缓衰老的作用。CS还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用，如抗HIV活性。在欧、美、日等发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。

现今硫酸软骨素工业生产方法是从猪、牛、鸡、鲨鱼等动物软骨中提取，主要使用酶法和碱法相结合的方法，但是该方法存在收集原料的成本高、质量不稳定、纯度不好控制、提取复杂、生产造成污染等诸多问题。发酵法生产CS不受原材料限制，成本低、环境友好，但是尚处于初级阶段，国内使用发酵法生产硫酸软骨素尚属空白，国外有发酵液中小量制备硫酸软骨素类似物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵液中提取硫酸软骨的方法，该提取方法具有回收率高、提取简单、环境友好等优点。

本发明的技术方案：

1、发酵液的制备

取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养温度为37℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养12h后按照10％接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，培养温度为37℃，装液量为3L/7L，转速为400rpm，通气量为1.7L/min，发酵周期为24h。

菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)是由本研究室选育，主要用来生产硫酸软骨素，该菌株已申请中国专利，并且进入实质性审查，申请号为201110127831.1。

种子培养基：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K₂HPO₄·3H₂O 0.04％，KH₂PO₄0.04％。

发酵培养基：葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH₄)₂SO₄0.2％，K₂HPO₄0.15％，KH₂PO₄·3H₂O0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，MnCl₂·4H₂O 0.02％。

2、发酵液中样品分离纯化

1)取发酵液在旋转蒸发仪中45℃进行浓缩，将发酵液体积浓缩至原来的三分之。用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体；

2)取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次；

3)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中；

4)得到的提纯样品在超滤离心管中离心浓缩，超滤离心管的过滤膜截留分子量为10kDa，5000rpm离心浓缩至原体积的十分之一，再将浓缩液加入去离子水至原体积，再次进行超滤离心，反复三次除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液至于平板中，放置于-70℃超低温冰箱中冷冻，然后进行冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。

3、硫酸软骨素含量的测定

将提纯样品稀释合适倍数与标准溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量。

色谱条件：

色谱柱：NUCLEODUR C₁₈Pyramid；

流动相：乙腈+戊烷磺酸钠(10+90)；

柱温：35℃；

检测波长：192nm；

进样量：10μL

流速：0.8ml/min。

液相色谱标准样品通过高效液相色谱的检测结果如图2，提纯样品检测结果如图3。

附图说明

图1硫酸软骨素的结构式，R和R₁相同或不同，代表H或SO₃Na，但不能同时为H，n＝5-50

图2鲨鱼软骨素标准品的高相液相色谱结果

图3硫酸软骨素提纯样品高效液相色谱结果

具体实施方式

实施例1：按照常规动物软骨中提取硫酸软骨素的方法，硫酸软骨素含量为3.5g/L的发酵液1L离心除去菌体，置于含碱性蛋白酶(5％)的50mmol/L碳酸钠缓冲液中，60℃保温12h，加热煮沸10min灭活蛋白酶后冷却至4℃。处理液中加6.1mol/L三氯醋酸溶液使浓度为5％(v/v)沉淀蛋白质，4℃离心除去。溶液加乙醇至80％(v/v)沉淀24h，4℃离心分离。沉淀溶于水，与氯化十六烷基吡啶混合终达1％(w/v)，室温1h，4℃离心收集沉淀。沉淀溶于2.5mol/L氯化钠，乙醇再沉淀(80％，v/v)，4℃离心。最后的沉淀再溶于水，4℃透析48h，冻干得产品。该方法操作相对简单，但是回收率低，回收硫酸软骨素冻干质量为2.60g，回收率为74％。

实施例2：收集发酵液，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体。取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，收集沉淀，重复上述过程2次。加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h收集沉淀并溶于适量去离子水中。利用超滤离心管反复超滤三次除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液置于平板中，放置于-70℃超低温冰箱中冷冻，然后进行真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。发酵液不经浓缩，使用了大量的乙醇，且使得乙醇沉淀的损失量加大，并且硫酸软骨素损失也大，最终冷冻干燥得到硫酸软骨素质量为2.56g，回收率为73％。

实施例3：取发酵液在旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度为45℃，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体。取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，收集沉淀，重复上述过程2次。加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于去离子水中。使用10kDa透析膜透析48h，放置于-70℃超低温冰箱中冷冻，然后进行真空冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。使用透析膜透析，廉价但是费时长且最终得到样品体积大，冷冻干燥量也增大。最终冷冻干燥的得到硫酸软骨素纯品量为2.85g/L，回收率为81％。

实施例4：取发酵液在旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度为45℃。用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体。取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，离心收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h收集沉淀，重复上述过程2次。加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，收集沉淀溶于适量去离子水中。然后使用超滤离心管中离心浓缩，反复三次超滤离心除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液至于平板中，放置于-70℃超低温冰箱中冷冻，然后进行真空冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。最终冷冻干燥的得到硫酸软骨素纯品量为3.03g/L，回收率为87％。

Claims

1.一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于提取方法包括如下步骤：

1)取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养12h后按照10％接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，发酵周期为24h。

种子培养基：

葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K₂HPO₄·3H₂O 0.04％，KH₂PO₄0.04％。

发酵培养基：

葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH₄)₂SO₄0.2％，K₂HPO₄0.15％，KH₂PO₄·3H₂O 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，MnCl₂·4H₂O 0.02％。

2)取发酵液在旋转蒸发仪中进行浓缩，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，再用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体；

3)取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次；

4)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中；

5)去提纯样品适量于超滤离心管中，超滤离心同时去除小分子物质和有机溶剂，浓缩液加入去离子水至原体积，再次进行超滤离心，反复三次除去发酵液中小分子物质，浓缩液真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。

2.根据权利要求1所述一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征是：步骤2)中旋转蒸发温度为45℃，蒸发至原体积的三分之一；步骤5)中超滤离心管的截留分子量为10kDa，转速为5000rpm，浓缩至原体积的十分之一；步骤5)中浓缩液冷冻条件为-70℃中5-6h，然后再真空度2.5Pa下冷冻干燥48h得硫酸软骨素纯品。