CN102965414A - 一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法 - Google Patents
一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102965414A CN102965414A CN2012104878016A CN201210487801A CN102965414A CN 102965414 A CN102965414 A CN 102965414A CN 2012104878016 A CN2012104878016 A CN 2012104878016A CN 201210487801 A CN201210487801 A CN 201210487801A CN 102965414 A CN102965414 A CN 102965414A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chondroitin sulfate
- centrifugal
- volume
- supernatant
- fermentation broth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
本发明阐述了一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法,即以研究室保藏产硫酸软骨素菌株为生产菌株,在7L罐中发酵后收集发酵液,将发酵液进行预处理,然后用乙醇沉淀和氯仿萃取去除发酵液中的蛋白质等杂质,再利用超滤离心管反复三次离心除去发酵液中的小分子物质,最后将浓缩液真空冷冻干燥48h得到硫酸软骨素纯品。本发明经过浓缩后大大节约了使用乙醇的量,氯仿可以回收利用,同时使用超滤离心管对于小量制备硫酸软骨素纯品更加快捷、方便。
Description
技术领域
一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法,属于生物工程领域,特别是从发酵液中而非动物中提取硫酸软骨素。
背景技术
硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种酸性的黏多糖,其二糖单体由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1,3键相连,糖链生成后由磺基转移酶在GalNAc的碳4位或碳6位进行硫酸化,如图1。根据其化学组成和结构差异可分为A、B、C、D、E、F、H等多种,通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以CS-A、CS-C为主。
CS是一类重要的生物高分子,具有广泛的生物活性,其作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。硫酸软骨素具有以下生物活性:镇痛抗炎作用;促进成骨细胞增生,诱导新骨形成;抗肿瘤作用;抗粘连作用;免疫调节作用;调血脂、抗动脉粥样硬化作用;抗氧化、清除自由基和廷缓衰老的作用。CS还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用,如抗HIV活性。在欧、美、日等发达国家,硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病,无明显的毒副作用,能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。
现今硫酸软骨素工业生产方法是从猪、牛、鸡、鲨鱼等动物软骨中提取,主要使用酶法和碱法相结合的方法,但是该方法存在收集原料的成本高、质量不稳定、纯度不好控制、提取复杂、生产造成污染等诸多问题。发酵法生产CS不受原材料限制,成本低、环境友好,但是尚处于初级阶段,国内使用发酵法生产硫酸软骨素尚属空白,国外有发酵液中小量制备硫酸软骨素类似物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵液中提取硫酸软骨的方法,该提取方法具有回收率高、提取简单、环境友好等优点。
本发明的技术方案:
1、发酵液的制备
取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中,培养温度为37℃,装液量50mL/500mL,摇床转速200rpm,培养12h后按照10%接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵,培养温度为37℃,装液量为3L/7L,转速为400rpm,通气量为1.7L/min,发酵周期为24h。
菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)是由本研究室选育,主要用来生产硫酸软骨素,该菌株已申请中国专利,并且进入实质性审查,申请号为201110127831.1。
种子培养基:葡萄糖1.5%,大豆蛋白胨0.8%,酵母粉0.8%,K2HPO4·3H2O 0.04%,KH2PO40.04%。
发酵培养基:葡萄糖2%,酵母粉5%,(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.15%,KH2PO4·3H2O0.15%,MgSO4·7H2O 0.04%,MnCl2·4H2O 0.02%。
2、发酵液中样品分离纯化
1)取发酵液在旋转蒸发仪中45℃进行浓缩,将发酵液体积浓缩至原来的三分之。用三氯乙酸调pH至4.5,常温下静置1h,用5mol/L的NaOH调pH至6.0,8000rpm离心15min除去菌体;
2)取上清液,加入上清体积2-3倍的乙醇,机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清,残余液在4000rpm下离心20min,收集沉淀,加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解,加入0.7-1倍体积的氯仿,搅拌1h后静置3h,分液除去氯仿相,得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,静置24h虹吸部分上清液,残余液离心20min,收集沉淀,重复上述过程2次;
3)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L,低速搅拌12h,6000rpm离心20min,收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,静置24h,将提纯样品溶于适量去离子水中;
4)得到的提纯样品在超滤离心管中离心浓缩,超滤离心管的过滤膜截留分子量为10kDa,5000rpm离心浓缩至原体积的十分之一,再将浓缩液加入去离子水至原体积,再次进行超滤离心,反复三次除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液至于平板中,放置于-70℃超低温冰箱中冷冻,然后进行冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。
3、硫酸软骨素含量的测定
将提纯样品稀释合适倍数与标准溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后,用高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量。
色谱条件:
色谱柱:NUCLEODUR C18Pyramid;
流动相:乙腈+戊烷磺酸钠(10+90);
柱温:35℃;
检测波长:192nm;
进样量:10μL
流速:0.8ml/min。
液相色谱标准样品通过高效液相色谱的检测结果如图2,提纯样品检测结果如图3。
附图说明
图1硫酸软骨素的结构式,R和R1相同或不同,代表H或SO3Na,但不能同时为H,n=5-50
图2鲨鱼软骨素标准品的高相液相色谱结果
图3硫酸软骨素提纯样品高效液相色谱结果
具体实施方式
实施例1:按照常规动物软骨中提取硫酸软骨素的方法,硫酸软骨素含量为3.5g/L的发酵液1L离心除去菌体,置于含碱性蛋白酶(5%)的50mmol/L碳酸钠缓冲液中,60℃保温12h,加热煮沸10min灭活蛋白酶后冷却至4℃。处理液中加6.1mol/L三氯醋酸溶液使浓度为5%(v/v)沉淀蛋白质,4℃离心除去。溶液加乙醇至80%(v/v)沉淀24h,4℃离心分离。沉淀溶于水,与氯化十六烷基吡啶混合终达1%(w/v),室温1h,4℃离心收集沉淀。沉淀溶于2.5mol/L氯化钠,乙醇再沉淀(80%,v/v),4℃离心。最后的沉淀再溶于水,4℃透析48h,冻干得产品。该方法操作相对简单,但是回收率低,回收硫酸软骨素冻干质量为2.60g,回收率为74%。
实施例2:收集发酵液,用三氯乙酸调pH至4.5,常温下静置1h,用5mol/L的NaOH调pH至6.0,8000rpm离心15min除去菌体。取上清液,加入上清体积2-3倍的乙醇,机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清,残余液在4000rpm下离心20min,收集沉淀,加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解,加入0.7-1倍体积的氯仿,搅拌1h后静置3h,分液除去氯仿相,得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,收集沉淀,重复上述过程2次。加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解,加入胰蛋白酶50mg/L,低速搅拌12h,6000rpm离心20min,收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,静置24h收集沉淀并溶于适量去离子水中。利用超滤离心管反复超滤三次除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液置于平板中,放置于-70℃超低温冰箱中冷冻,然后进行真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。发酵液不经浓缩,使用了大量的乙醇,且使得乙醇沉淀的损失量加大,并且硫酸软骨素损失也大,最终冷冻干燥得到硫酸软骨素质量为2.56g,回收率为73%。
实施例3:取发酵液在旋转蒸发仪进行浓缩,浓缩温度为45℃,用三氯乙酸调pH至4.5,常温下静置1h,用5mol/L的NaOH调pH至6.0,8000rpm离心15min除去菌体。取上清液,加入上清体积2-3倍的乙醇,机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清,残余液在4000rpm下离心20min,收集沉淀,加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解,加入0.7-1倍体积的氯仿,搅拌1h后静置3h,分液除去氯仿相,得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,收集沉淀,重复上述过程2次。加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L,低速搅拌12h,6000rpm离心20min,收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,静置24h,将提纯样品溶于去离子水中。使用10kDa透析膜透析48h,放置于-70℃超低温冰箱中冷冻,然后进行真空冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。使用透析膜透析,廉价但是费时长且最终得到样品体积大,冷冻干燥量也增大。最终冷冻干燥的得到硫酸软骨素纯品量为2.85g/L,回收率为81%。
实施例4:取发酵液在旋转蒸发仪进行浓缩,浓缩温度为45℃。用三氯乙酸调pH至4.5,常温下静置1h,用5mol/L的NaOH调pH至6.0,8000rpm离心15min除去菌体。取上清液,加入上清体积2-3倍的乙醇,机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清,离心收集沉淀,加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解,加入0.7-1倍体积的氯仿,搅拌1h后静置3h,分液除去氯仿相,得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,静置24h收集沉淀,重复上述过程2次。加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L,低速搅拌12h,6000rpm离心20min,收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,静置24h,收集沉淀溶于适量去离子水中。然后使用超滤离心管中离心浓缩,反复三次超滤离心除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液至于平板中,放置于-70℃超低温冰箱中冷冻,然后进行真空冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。最终冷冻干燥的得到硫酸软骨素纯品量为3.03g/L,回收率为87%。
Claims (2)
1.一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法,其特征在于提取方法包括如下步骤:
1)取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中,培养12h后按照10%接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵,发酵周期为24h。
种子培养基:
葡萄糖1.5%,大豆蛋白胨0.8%,酵母粉0.8%,K2HPO4·3H2O 0.04%,KH2PO40.04%。
发酵培养基:
葡萄糖2%,酵母粉5%,(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.15%,KH2PO4·3H2O 0.15%,MgSO4·7H2O 0.04%,MnCl2·4H2O 0.02%。
2)取发酵液在旋转蒸发仪中进行浓缩,用三氯乙酸调pH至4.5,常温下静置1h,再用5mol/L的NaOH调pH至6.0,8000rpm离心15min除去菌体;
3)取上清液,加入上清体积2-3倍的乙醇,机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清,残余液在4000rpm下离心20min,收集沉淀,加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解,加入0.7-1倍体积的氯仿,搅拌1h后静置3h,分液除去氯仿相,得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,静置24h虹吸部分上清液,残余液离心20min,收集沉淀,重复上述过程2次;
4)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L,低速搅拌12h,6000rpm离心20min,收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇,搅拌30min,静置24h,将提纯样品溶于适量去离子水中;
5)去提纯样品适量于超滤离心管中,超滤离心同时去除小分子物质和有机溶剂,浓缩液加入去离子水至原体积,再次进行超滤离心,反复三次除去发酵液中小分子物质,浓缩液真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。
2.根据权利要求1所述一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法,其特征是:步骤2)中旋转蒸发温度为45℃,蒸发至原体积的三分之一;步骤5)中超滤离心管的截留分子量为10kDa,转速为5000rpm,浓缩至原体积的十分之一;步骤5)中浓缩液冷冻条件为-70℃中5-6h,然后再真空度2.5Pa下冷冻干燥48h得硫酸软骨素纯品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210487801.6A CN102965414B (zh) | 2012-11-27 | 2012-11-27 | 一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210487801.6A CN102965414B (zh) | 2012-11-27 | 2012-11-27 | 一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102965414A true CN102965414A (zh) | 2013-03-13 |
CN102965414B CN102965414B (zh) | 2014-10-22 |
Family
ID=47795850
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210487801.6A Expired - Fee Related CN102965414B (zh) | 2012-11-27 | 2012-11-27 | 一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102965414B (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105925511A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-09-07 | 上海应用技术学院 | 一种芽孢杆菌及其应用 |
CN106011200A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-10-12 | 上海应用技术学院 | 一种生产硫酸软骨素的方法 |
CN109280095A (zh) * | 2018-05-18 | 2019-01-29 | 山阳县恒桓生物科技有限公司 | 一种硫酸软骨素的提取方法 |
CN110760016A (zh) * | 2019-05-10 | 2020-02-07 | 赤峰蒙广生物科技有限公司 | 从硫酸软骨素发酵液中提纯硫酸软骨素的方法 |
CN112708576A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-27 | 华东师范大学 | 一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392035A (zh) * | 2007-09-21 | 2009-03-25 | 哈尔滨奥霖药业有限公司 | 高含量硫酸软骨素的生产方法 |
WO2009149155A1 (en) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Amano Enzyme Usa., Ltd. | Microbial-derived chondroitin sulfate |
CN101679955A (zh) * | 2007-04-24 | 2010-03-24 | 生化学工业株式会社 | 生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法 |
CN102153672A (zh) * | 2010-12-28 | 2011-08-17 | 湖北远成药业有限公司 | 一种硫酸软骨素的提取方法 |
CN102220270A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-10-19 | 江南大学 | 一种产硫酸软骨素菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产硫酸软骨素 |
CN102337312A (zh) * | 2011-10-19 | 2012-02-01 | 江南大学 | 一种提高发酵法生产硫酸软骨素产量的方法 |
CN102459625A (zh) * | 2009-05-25 | 2012-05-16 | 阿尔特刚股份有限公司 | 生物技术生产软骨素 |
-
2012
- 2012-11-27 CN CN201210487801.6A patent/CN102965414B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101679955A (zh) * | 2007-04-24 | 2010-03-24 | 生化学工业株式会社 | 生产软骨素的细菌及生产软骨素的方法 |
CN101392035A (zh) * | 2007-09-21 | 2009-03-25 | 哈尔滨奥霖药业有限公司 | 高含量硫酸软骨素的生产方法 |
WO2009149155A1 (en) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Amano Enzyme Usa., Ltd. | Microbial-derived chondroitin sulfate |
CN102459625A (zh) * | 2009-05-25 | 2012-05-16 | 阿尔特刚股份有限公司 | 生物技术生产软骨素 |
CN102153672A (zh) * | 2010-12-28 | 2011-08-17 | 湖北远成药业有限公司 | 一种硫酸软骨素的提取方法 |
CN102220270A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-10-19 | 江南大学 | 一种产硫酸软骨素菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产硫酸软骨素 |
CN102337312A (zh) * | 2011-10-19 | 2012-02-01 | 江南大学 | 一种提高发酵法生产硫酸软骨素产量的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
《Angewandte Chemie International Edition》 20111230 Emiliano Bedini et al. A Microbiological-Chemical Strategy to Produce Chondroitin Sulfate A,C 6160-6163 1-2 第50卷, * |
CHIARA SCHIRALDI ET AL.: "Production of chondroitin sulfate and chondroitin", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 * |
EMILIANO BEDINI ET AL.: "A Microbiological–Chemical Strategy to Produce Chondroitin Sulfate A,C", 《ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION》 * |
吴秋林 等: "发酵法生产硫酸软骨素的研究进展", 《生物工程学报》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105925511A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-09-07 | 上海应用技术学院 | 一种芽孢杆菌及其应用 |
CN106011200A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-10-12 | 上海应用技术学院 | 一种生产硫酸软骨素的方法 |
CN109280095A (zh) * | 2018-05-18 | 2019-01-29 | 山阳县恒桓生物科技有限公司 | 一种硫酸软骨素的提取方法 |
CN110760016A (zh) * | 2019-05-10 | 2020-02-07 | 赤峰蒙广生物科技有限公司 | 从硫酸软骨素发酵液中提纯硫酸软骨素的方法 |
CN112708576A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-27 | 华东师范大学 | 一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102965414B (zh) | 2014-10-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102965414B (zh) | 一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法 | |
CN109897876B (zh) | 一种制备小分子透明质酸或其盐的方法 | |
CN102242165A (zh) | 一种发酵生产高分子量透明质酸钠的方法及其所用的培养基 | |
Naghdi et al. | A sulfuric–lactic acid process for efficient purification of fungal chitosan with intact molecular weight | |
CN103352062B (zh) | 一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法 | |
CN107151685B (zh) | 一种发酵法生产硫酸软骨素的方法 | |
CN111978421B (zh) | 一种桑树桑黄多糖及其制备和用途 | |
CN107868805B (zh) | 一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖及其制备方法 | |
CN102924624A (zh) | 一种利用鲟鱼软骨制备硫酸软骨素的方法 | |
CN111875688B (zh) | 一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法 | |
WO2020134688A1 (zh) | 一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法和发酵培养基 | |
CN112010993A (zh) | 一种银耳多糖的提取方法 | |
CN101168570B (zh) | 海带硫酸多糖的降解方法 | |
CN102174613A (zh) | 一种乳杆菌多糖分离纯化的方法 | |
CN102617748B (zh) | 一种普鲁兰多糖的纯化方法 | |
CN102417509A (zh) | 海星中提取的三种化合物在促进骨折愈合方面用途和制备方法 | |
CN104450831A (zh) | 一种提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法 | |
Morris et al. | Possible biological roles for Rhizobium leguminosarum extracellular polysaccharide and cyclic glucans in bacteria-plant interactions for nitrogen-fixing bacteria | |
CN103290079B (zh) | 一种λ-卡拉胶寡糖的制备方法 | |
CN103694367A (zh) | 一种具有抗氧化活性文蛤多糖的提取及应用方法 | |
CN102585027A (zh) | 一种毛头鬼伞大分子多糖及其制备方法 | |
CN102181505A (zh) | 一种双歧杆菌多糖分离纯化的方法 | |
CN104478978A (zh) | 一种蛹虫草腺苷的提取方法 | |
CN104480056A (zh) | 一种高产胞外多糖的基因工程菌及其制备方法和应用 | |
CN107384986A (zh) | 一种利用生物技术提取茶多糖的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170526 Address after: 341599 new century Industrial Park, Nanan Town, Dayu County, Jiangxi, Ganzhou Patentee after: Jiangxi Runze Pharmaceutical Co., Ltd. Address before: 214122 Jiangsu Province, Wuxi City Lake Road No. 1800 State Key Laboratory of Jiangnan University Patentee before: Jiangnan University |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141022 Termination date: 20181127 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |