CN112708576A - 一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用 - Google Patents

一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GX10‑35，其保藏编号为CGMCC No.21277，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月2日；所述菌株通过从纳豆食品中筛选、分离、纯化、培养获得，能合成和分泌硫酸化多糖。本发明还公开了上述枯草芽孢杆菌GX10‑35通过发酵生产硫酸化多糖的方法。本发明不受化学法制备的硫酸化多糖易降解的缺点及动物软骨资源匮乏的约束，有利于大量生产；生产工艺简单，条件温和，因而成本较低；此外环境污染小。用本发明的菌株生产的硫酸化多糖可作为医药、营养食品、药用化妆品和功能性食物等的原料。

Description

一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用。
背景技术
硫酸多糖也称多糖硫酸酯或硫酸酯多糖，是一类富含有带负电荷硫酸根的化合物，包括从动、植物中提取的各种天然硫酸多糖(如肝素)，天然中性多糖的硫酸化修饰物及人工合成、半合成的各种硫酸多糖。近年来，硫酸多糖因具有抗氧化，抗感染、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、促进免疫等多方面功能和生物活性而受到人们的关注。硫酸化多糖，最先发现于软骨素以及从猪肠粘膜中提取的肝素，后来发现它还广泛存在于海藻类植物，如红藻、褐藻、绿藻。近年来，硫酸化多糖在医药、营养食品、药用化妆品和功能性食品等领域得到广泛应用，市场需求趋愈来愈大。而且，我国生产和出口量逐年大幅增长，硫酸化多糖发展前景广阔。
目前，我国主要采用化学法(浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法等)，将硫酸基团引入多糖，制备得到硫酸化多糖。其中浓硫酸法需要先加浓硫酸、正丁醇；氯磺酸-吡啶法需要在冷凝管和搅拌装置的烧瓶中盐水-冰浴下先加吡啶后加氯磺酸，待烧瓶中出现大量淡黄色固体，再加多糖粉末沸水浴反应；三氧化硫-吡啶法需要先加三氧化硫-吡啶进行热水浴,再加多糖粉末反应后，经NaOH溶液中和乙醇沉淀得到硫酸化多糖。极少有通过筛选得到微生物发酵生产硫酸化多糖的报道。而化学法修饰得制备硫酸化多糖存在反应速率低，多糖降解率高、具毒副作用等缺点，因此，急待开发新的生物资源及新的技术工艺来生产硫酸化多糖。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种发酵法生产硫酸化多糖(GX10-35-P1)的菌株及其应用，通过发酵枯草芽孢杆菌制备硫酸化多糖的方法，解决现有技术化学法制备硫酸化多糖的降解和毒副作用问题。
本发明提供了一种硫酸化多糖生产菌株枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2020年12月2日，保藏编号为CGMCC No.21277。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)菌株菌落特征为乳白色、具褶皱、中间凸起、表面干燥且粗糙；显微镜观察菌体呈杆状，末端圆，单个或呈短链状排列。菌体中间有芽孢形成，革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性杆状菌(见图1，图2)。本菌株是硫酸化多糖生产菌，其生理生化特征见下表1：
表1 生理生化试验结果
Figure BDA0002864584040000021
注：+表示阳性，-表示阴性；
通过测序分析得到芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)的16S rDNA序列，全长为1453bp，使用BLAST对该菌株的16S rDNA基因和GenBank中己录入的细菌进行同源性比对，分析表明该菌与Bacillus subtilis strain JCM 1465序列同源性99.72％。结合16SrDNA全序列分析的系统发育研究结果(见图3)，将该菌株命名为Bacillus subtilis GX10-35。
本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)的16S rDNA基因序列(1453bp)如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌的筛选方法，所述菌株通过从纳豆食品中筛选、分离、纯化、培养获得。
所述枯草芽孢杆菌的筛选标准为选择能耐受30min沸水浴，且显微镜镜检具有芽孢的菌株；
所述分离方法为将耐受沸水浴菌悬液稀释涂布；
所述纯化方法为挑取稀释涂布单菌落四区划线；
所述培养方法为取四区划线单菌落至LB平板，37℃培养16h。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌GX10-35生产硫酸化多糖的方法，包括以下步骤：
第一步：从纳豆食品中分离、纯化、培养得到生产硫酸化多糖的枯草芽孢杆菌；
第二步：将分离纯化得到的枯草芽孢杆菌在恒温摇床中进行种子培养和发酵；
第三步：将第二步得到的发酵液经离心、乙醇沉淀提取得到硫酸化多糖GX10-35-P1。
进一步地，本发明所述方法还包括：
第四步：将第三步得到的多糖经透析、冷冻干燥后，利用AKTAPurifier纯化仪先进行阴离子层析柱分离纯化，再进行凝胶过滤层析柱纯化，收集多糖峰即为纯化硫酸化多糖；
第五步：将第四步得到纯化硫酸化多糖进行抗氧化活性应用实验。
具体步骤如下：
第一步：通过常规的方法从纳豆食品中进行菌株筛选、分离、纯化、培养，获得该枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GX10-35；
所述菌株的筛选标准为选择能耐受30min沸水浴，且显微镜镜检具有芽孢的菌株，分离方法为将耐受沸水浴菌悬液稀释涂布，纯化方法为挑取稀释涂布单菌落四区划线，培养方法为取四区划线单菌落至LB平板，37℃培养16h。
第二步：接种环刮取一环上述分离纯化得到的菌株，接种于种子培养基(葡萄糖1-5g，胰蛋白胨15-20g，大豆蛋白胨2-6g，KH2PO4 0.1-1g，NaCl 1-10g，蒸馏水800-1000ml，调节pH7.2-7.5；优选地，为葡萄糖2.5g，胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，KH2PO4 0.5g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，调节pH7.3，在转速200r/min，温度为37℃下，恒温摇床振荡培养12h。
然后，将得到的菌种培养液按8-10％接种量转接到发酵培养基(葡萄糖10-30g，酵母粉0.4-0.8g，大豆蛋白胨0.4-0.8g，K2HPO4·7H2O 3H2O 0.4-0.8g，KH2PO4 0.4-0.8g，MgSO4·7H2O 0.2-0.4g，蒸馏水800-1000ml，调节pH7.2-7.5；优选地，为葡萄糖15g，酵母粉8g，大豆蛋白胨8g，K2HPO4·3H2O 0.4g，KH2PO4 0.4g，MgSO4·0.25g，蒸馏水1000ml，调节pH7.5，在转速200r/min，温度为37℃下，恒温摇床振荡培养48h。
第三步：将第二步得到的发酵液离心弃去沉淀，收集上清液；所述离心操作的速度为10000rpm；离心操作的时间为20min。再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理即可得到硫酸化多糖，多糖的产量约0.72mg/mL。
第四步：将上述分离得到的菌株发酵产生的硫酸化多糖，经3.5kDa透析袋过夜透析后，通过IexCap DEAE 6FF阴离子交换层析柱和凝胶过滤层析柱HiprepTM 26/60SephacrylTM S-100HR纯化可得到较纯的硫酸化多糖；
所述阴离子交换层析时洗脱方式为0-1M NaCl线性-梯度洗脱，洗脱缓冲液为BufferA(10mM Tris-HCl，pH8.0)和Buffer B(1M NaCl溶于10mM Tris-HCl，pH8.0)，流速为1-5ml/min；优选地，为1ml/min；所述凝胶过滤层析时，洗脱缓冲液为超纯水，流速为0.5-0.8ml/min；优选地，为0.8ml/min。
第五步：将第四步得到纯化硫酸化多糖进行抗氧化活性应用实验。
其中，对分离纯化的硫酸化多糖GX10-35-P1进行抗氧化活性测定的浓度为0.01-4mg/ml。
本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌发酵生产的硫酸化多糖的鉴定方法。
本发明对生产的硫酸化多糖进行了抗氧化活性应用实验，所述抗氧化活性测定的浓度为0.01-4mg/ml。
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌GX10-35在发酵生产硫酸化多糖中的应用。
本发明的有益效果包括：本发明不受化学法制备的硫酸化多糖易降解的缺点及动物软骨资源匮乏的约束，有利于大量生产；生产工艺简单，条件温和，因而成本较低；此外环境污染小。用本发明的菌株生产的硫酸化多糖可作为医药、营养食品、药用化妆品和功能性食物等的原料，发挥其在抗氧化，抗感染、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫等多方面的生物功能作用。
附图说明
图1是本发明GX10-35菌株革兰氏染色的图片。
图2是本发明GX10-35菌株的芽孢染色的照片。
图3是本发明GX10-35菌株的系统发育进化树结果。
图4是本发明GX10-35菌株产生得硫酸化多糖的分离纯化结果。
图5是本发明GX10-35菌株产生得硫酸化多糖的紫外光谱扫描结果。
图6是本发明GX10-35菌株产生得硫酸化多糖的红外光谱扫描结果。
图7是本发明GX10-35菌株产生的硫酸化多糖的羟自由基清除活性的抗氧化活性结果。
图8是本发明GX10-35菌株产生的硫酸化多糖的ABTS自由基清除活性抗氧化活性结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GX10-35菌株的鉴定
从不同来源地采集纳豆食品，分离筛选能够产生硫酸化多糖的芽孢杆菌。根据产量，选出硫酸化多糖较高的菌株。将筛选得到的产硫酸化多糖的芽孢杆菌经形态学、生理生化和分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌，并命名为Bacillus subtilis GX10-35。将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2020年12月2日，保藏编号为CGMCC No.21277。
(1)形态特征观察：将菌株接种于LB固体培养基中，在37℃恒温条件下培养48h，形成菌落，菌落特征为乳白色、具褶皱、中间凸起、表面干燥且粗糙；显微镜观察菌体呈杆状，末端圆，单个或呈短链状排列。菌体中间有芽孢形成，革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性杆菌(见图1，图2)。
(2)参考RE.希坎南.《伯杰氏细菌鉴定手册》(北京:科学出版社，1989)的方法，对GX10-35菌株进行生理生化特性鉴定。鉴定结果是VP试验阳性，MR试验阳性，接触酶实验阴性，明胶液化阴性，吲哚试验阴性，柠檬酸盐实验阴性，淀粉水解实验阳性，耐盐实验阳性，脲酶实验阴性、氧化酶实验阴性、产气、耐高温(55℃)等，是革兰氏阳性好氧菌。
(3)通过测序分析得到芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)的16S rDNA序列，全长为1453bp，使用BLAST对该菌株的16S rDNA基因和GenBank中己录入的细菌进行同源性比对(见图3)，分析表明该菌与Bacillus subtilis strain JCM 1465序列同源性99.72％。
(4)根据菌落的形态，生理生化特性，根据形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定GX10-35菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，将其命名为：枯草芽孢杆菌GX10-35(Bacillus subtilis GX10-35)。
实施例2：枯草芽孢杆菌生产硫酸化多糖的应用实验
(1)种子培养：接种环刮取一环上述分离纯化得到的菌株枯草芽孢杆菌GX10-35，接种于50mL胰蛋白胨大豆肉汤TSB培养基(葡萄糖2.5g，胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，KH2PO40.5g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，调节pH7.3)，在转速200r/min，温度为37℃下，培养12h。
(2)发酵培养：再将该菌种培养液按10％接种量转接到发酵培养基(葡萄糖15g，酵母粉8g，大豆蛋白胨8g，K2HPO4·3H2O 0.4g，KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.25g，蒸馏水1000ml，调节pH7.5)在转速200r/min，温度为37℃下，培养48h。
(3)产量测定：将发酵液离心弃去沉淀，收集上清液。再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行提取即可得到硫酸化多糖，多糖的产量约0.72mg/mL。
实施例3：枯草芽孢杆菌生产获得的硫酸化多糖的分离纯化
(1)阴离子交换层析：将上述乙醇沉淀法得到GX10-35-P1硫酸化多糖经过3.5kDa透析袋过夜透析后，经真空冷冻干燥机冻干获得GX10-35-P1硫酸化多糖冻干粉。利用AKTAPurifier纯化仪进行分离纯化。其中纯化缓冲液为BufferA(10mM Tris-HCl，pH8.0)，Buffer A(1M NaCl溶于10mM Tris-HCl，pH8.0)，纯化条件为采用IexCap DEAE 6FF层析柱进行0-1M NaCl线性-梯度洗脱，洗脱流速为1ml/min。
(2)凝胶过滤层析：阴离子交换层析得到的样品，经透析及冷冻干燥处理后，利用HiprepTM 26/60 SephacrylTM S-100HR凝胶柱洗脱，洗脱缓冲液为超纯水，流速为0.8ml/min。。最终分离纯化得到的GX10-35-P1硫酸化多糖(见图4)。
实施例4：枯草芽孢杆菌生产获得的硫酸化多糖的鉴定
将得到的GX10-35-P1硫酸化多糖进行紫外光谱，结果见图5所示，进行傅立叶红外变换光谱扫描，结果见图6。可见，GX10-35-P1多糖在200nm有最大吸收峰，260nm和280nm几乎没有吸收峰，表明几乎不含蛋白及核酸杂质(图5)；进行4000cm-1和500cm-1的傅立叶红外变换光谱扫描，其中约1240cm-1和841cm-1处分别是S＝O的伸缩振动和C＝O＝S轴向位置的弯曲振动，对应于硫酸酯，表明GX10-35-P1多糖是一种硫酸化多糖。
实施例5：枯草芽孢杆菌生产获得的硫酸化多糖的抗氧化活性
将GX10-35硫酸化多糖分离纯化得到的GX10-35-P1硫酸化多糖(0.01-4mg/ml)进行抗氧化实验，以抗坏血酸作为阳性对照，结果表明其同时具有羟自由基(见图7)和ABTS自由基清除活性的抗氧化活性(见图8)。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis GX10-35
<400> 1
ggggaaaatg ggggggtgct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc 60
tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa 120
ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc aaacataaaa 180
ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa 240
cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa 360
gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt 420
agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt 540
attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa 600
ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac 660
gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg 720
tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 780
gtccacgccg taacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc 840
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaggaattga 900
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcacgcga gaaccttacc 960
agtcttgaca tcctctgaca tcctagagat aggacgtcct cttcgggggc agagtgacag 1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200
acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260
atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320
aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttaggagc cagccgccga 1440
agtgacagaa gtg 1453

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株的分类名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis GX10-35，保藏编号为CGMCC No.21277，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月2日。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株为革兰氏阳性杆状菌，是硫酸化多糖生产菌；和/或，所述菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示，菌株菌落特征为乳白色、具褶皱、中间凸起、表面干燥且粗糙；显微镜观察菌体呈杆状，末端圆，单个或呈短链状排列，菌体中间有芽孢形成。
3.一种利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌GX10-35通过发酵生产硫酸化多糖GX10-35-P1的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
第一步：从纳豆食品中筛选、分离、纯化、培养得到生产硫酸化多糖的枯草芽孢杆菌；
第二步：将分离纯化得到的枯草芽孢杆菌在恒温摇床中进行种子培养和发酵；
第三步：将第二步得到的发酵液经常规离心和乙醇沉淀提取得到硫酸化多糖GX10-35-P1。
第四步：将第三步得到的硫酸化多糖经透析、冷冻干燥后，利用AKTAPurifier纯化仪先进行阴离子层析柱分离纯化，再进行凝胶过滤层析柱纯化，收集多糖峰即为纯化硫酸化多糖GX10-35-P1；
第五步：将第四步得到的纯化硫酸化多糖GX10-35-P1进行抗氧化活性应用实验。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第二步中，所述种子培养基成分为：葡萄糖1-5g，胰蛋白胨15-20g，大豆蛋白胨2-6g，KH2PO40.1-1g，NaCl 1-10g，蒸馏水800-1000ml，调节pH7.2-7.5；所述发酵培养基成分为：葡萄糖10-30g，酵母粉0.4-0.8g，大豆蛋白胨0.4-0.8g，K2HPO4·3H2O 0.4-0.8g，KH2PO40.4-0.8g，MgSO4·7H2O 0.2-0.4g，蒸馏水800-1000ml，调节pH7.2-7.5。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第二步中，所述培养方法具体包括以下步骤：将保藏的枯草芽孢杆菌GX10-35按2％-4％v/v的接种量转接入种子培养基中，于37℃，200rpm恒温摇床振荡培养10-12h得到GX10-35菌株新鲜种子液，再将GX10-35菌株新鲜种子液按照8-10％v/v的接种量转接入装有50mL发酵培养基的250mL普通三角瓶中，于37℃，200rpm恒温摇床振荡培养2d。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第三步中，所述离心操作的速度为10000rpm；离心操作的时间为20min。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第四步中，所述阴离子交换层析柱分离纯化方法为：柱子为IexCap DEAE 6FF阴离子交换层析柱，洗脱方式为0-1M NaCl线性-梯度洗脱，洗脱缓冲液为BufferA(10mM Tris-HCl，pH8.0)和Buffer B(1M NaCl溶于10mM Tris-HCl，pH8.0)，流速为1-5ml/min。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第四步中，所述凝胶过滤层析柱分离纯化方法为：
柱子为HiprepTM 26/60SephacrylTM S-100HR，洗脱缓冲液为超纯水，流速为0.5-0.8ml/min，收集多糖峰即为硫酸化多糖。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第五步中，对分离纯化的硫酸化多糖GX10-35-P1进行抗氧化活性测定的浓度为0.01-4mg/ml。
10.如权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌GX10-35在发酵生产硫酸化多糖中的应用。
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