CN107418922B - 一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法 - Google Patents

一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法，属于生物技术领域。具体地说，该根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）是从醇化中期烟叶上通过寡营养培养基分离得到的，已于2017年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14440。该菌株能够以烟草工业废弃物为原料合成乙酸己酯，该乙酸己酯具有浓郁果香味，其不仅广泛应用于合成香料、化妆品及饲料添加等领域，而且是制药工业的重要原料和中间体；在本发明合成过程中使用的发酵培养基成本低廉，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用，具有良好的应用前景。

Description

一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种根际芽孢杆菌及其应用，特别涉及一株筛选获得的根际芽孢杆菌及利用该菌株发酵生产乙酸己酯的方法。
背景技术
乙酸己酯又称正己基乙酸酯，是无色油状液体，熔点是-80℃，沸点是168-171.5℃，能与乙醇、乙醚、苯等溶剂互溶，但不溶于水。
乙酸己酯具有令人愉快的水果香气和梨似的酸甜味道，国标中已将乙酸己酯规定为允许使用的食用香料物质，其主要用在食用果实香精，用于配制苹果、梨等水果型香精。除此之外还可以也用于有机合成，也可作为纤维素酯类、树脂等溶剂。
目前工业上生产乙酸己酯的方法仅限于化学合成法，其主要用的是以浓硫酸为催化剂，以乙酸和己醇为原料，通过酯化反应制得，此方法不但对设备有腐蚀，而且对环境会产生一定的污染。也有研究者以固体酸、强酸性交换树脂及固体路易斯酸作为酯化反应的催化剂，以期替代传统的液体强酸，减少化学催化法生产乙酸己酯对设备腐蚀，虽在一定程度上取得了一定的成效，但由于固体酸等催化剂的制备繁琐、酸性调节性差和易失活等缺点，使其在工业应用上受到了限制。除此之外，许多研究者将改善乙酸己酯的工业生产的重点放在了催化剂的选择上，在这方面也取得了不少成就，如胺型离子液体催化剂，新型固体酸催化剂等等。这些催化剂的使用虽然可以减少设备腐蚀及环境污染，但其生产过程相对较复杂。乙酸己酯的生物合成鲜有报道，其可能原因在于微生物合成乙酸己酯的效率不高，这就制约了乙酸己酯的生物合成在工业上的应用。因此如何克服现有技术的不足是目前生物技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法，该菌株不仅不需要改造，而且易于分离和培养，除此之外，使用的发酵培养基还成本低廉，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用，
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae），已于2017年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14440。
本发明还提供根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用。
利用根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）生产乙酸己酯的方法，包括如下步骤：
步骤（1），利用寡营养培养基从醇化中期的烟叶上分离得根际芽孢杆菌；
步骤（2），将步骤（1）中得到的根际芽孢杆菌接种至发酵培养基中，发酵后，将所得发酵液纯化，即得到乙酸己酯。
进一步，优选的是，步骤（1）中所述的寡营养培养基是稀释2-5倍的LB液体培养基。
进一步，优选的是，步骤（2）中根际芽孢杆菌接种至发酵培养基中是指直接接种一接种环的纯培养菌体至发酵培养基中。
进一步，优选的是，所述的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖10~25g/L，烟草工业废弃物3~7g/L，pH值7.0~7.4。
烟叶工业废弃物是烟叶加工过程中剔除的烟梗或者废弃的烟叶。
进一步，优选的是，所述的发酵温度为30-37℃。
本发明涉及的以烟草工业废弃物为原料生产乙酸己酯的根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）是从醇化中期的烟叶上通过选择性培养基分离得到的。
本发明涉及根际芽孢杆菌为革兰阳性杆菌，有芽孢，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊不膨大，在显微镜下观察菌体的大小为0.8μmx（3.5～5.5）μm。菌体细胞呈短杆状。在LB固体培养基表面，菌体形成不透明的乳白色菌落，菌落表面湿润平滑，边缘不整齐。上述菌株的经通用引物PCR获得16SrDNA序列与根际芽孢杆菌W12的16SrDNA序列有99%的相似性，其系统进化树如图1所示。
其中，上述PCR上游引物为27F:5’-agagtttgatcctggctcag-3’（SEQ ID NO. 2）；
下游引物为1492R：5’-cggctaccttgttacgactt-3’（SEQ ID NO. 3）。
本发明方法提供了乙酸己酯的一种新来源，本发明菌株既不需要改造，而且易于分离和培养，除此之外，使用的发酵培养基不但成本低廉，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，这在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用，本发明提供的根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法有望解决生物法生产乙酸己酯的问题，也会促进乙酸己酯的工业化生产及应用。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1）本发明筛选获得根际芽孢杆菌能够利用烟草工业废弃物为主要营养源，这可处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用。
2）该根际芽孢杆菌能够发酵烟草工业废弃物生产乙酸己酯。该乙酸己酯为直链型脂肪酸酯，具有浓郁果香味，其不仅广泛应用于合成香料、化妆品及饲料添加等领域，而且是制药工业的重要原料和中间体。
3）本发明提供了乙酸己酯的一种新来源，菌株不但不需要改造，而且易于分离和培养，这也有望解决生物法生产乙酸己酯的问题，也会促进乙酸己酯的工业化生产及应用。
附图说明
图1该根际芽孢杆菌与相关菌种的16S rRNA基因序列系统进化树（邻接法）；
图2 该根际芽孢杆菌基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图3本发明发酵获得乙酸己酯的质谱图；
图4为对照组与实验组发酵液检测的对比气相色谱图。根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae），已于2017年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14440，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1 利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯微生物的分离
1.分离用培养基及培养条件：
LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；pH 自然，灭菌；
稀释2倍的LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨5g；酵母提取物2.5g；NaCl5g；pH 自然，灭菌；
稀释4倍的LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨2.5g；酵母提取物1.25g；NaCl 2.5g；pH 自然，灭菌；
稀释5倍的LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨2g；酵母提取物1g；NaCl 2g；pH 自然，灭菌；
上述培养基的灭菌条件为121℃灭菌20分钟。
上述培养基中添加20g/L的琼脂制备成固体培养基用于菌株筛选。
2.分离方法：
醇化中期的烟叶样品随机抽取2g，在无菌条件下剪碎，浸泡于150mL中无菌生理盐水中，在温度为37℃，转速为180转/分的条件下，振荡培养60分钟，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用5mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取200μL涂布于三种分离培养基（稀释2倍的LB液体培养基、稀释4倍的LB液体培养基、稀释5倍的LB液体培养基）上，于37℃倒置培养24小时，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落。
实施例2 分离微生物的菌种鉴定
（1）将所选培养基分离的细菌，培养于LB液体培养基中，12小时后，得到相应菌株的菌悬液。
（2）取菌悬液500μL，离心后弃上清，提取基因组DNA，以提取基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。
上述PCR上游引物为27F:5’-agagtttgatcctggctcag-3’（SEQ ID NO. 2）；
下游引物为1492R：5’-cggctaccttgttacgactt-3’（SEQ ID NO. 3）。
PCR反应体系以及程序如下：
PCR扩增体系（25μL）：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
PCR扩增程序：
Figure 768200DEST_PATH_IMAGE002
30个循环。
（3）分别取5μL PCR反应液和DNA maker 2000，应用凝胶电泳进行PCR产物验证。
（4）将在1600bp左右有荧光带出现的PCR产物（图2），送去测序公司测序，测序结果进行拼接后，输入NCBI的BLSAT（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行序列比对，该16SrDNA序列（SEQ ID NO.1）与根际芽孢杆菌W12的16SrDNA序列有99%的相似性。该菌为革兰阳性杆菌，有芽孢，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊不膨大，在显微镜下观察菌体的大小为0.8μmx（3.5～5.5）μm。菌体细胞呈短杆状。在LB固体培养基表面，菌体形成不透明的乳白色菌落，菌落表面湿润平滑，边缘不整齐。初步鉴定改菌种为根际芽孢杆菌B.rhizosphaerae，该菌株保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14440。测序结果如SEQ ID NO. 1所示。
实施例3 利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯
发酵培养基组分为：葡萄糖20g/L，烟草工业废弃物6g/L，pH值7.2；
在无菌条件下，将根际芽孢杆菌纯培养物直接接种一接种环至装有50mL灭菌的发酵培养基的250mL的摇瓶中，并设置不接菌株的对照组，于140转/分钟的摇床中，37℃培养。培养5天后利用GC-MS检测。
乙酸己酯的定性检测：取上述发酵液经12000转/分钟离心10分钟，弃除沉淀，将发酵液上清用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物，旋蒸去除部分溶剂，用无水硫酸钠除水后，用0.22μm膜过滤，利用GC-MS进行定性检测。采用DB-5毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm.），进样口温度250℃，离子源温度230℃，升温程序为40℃维持6分钟，然后3℃/分钟程序升温至100℃，之后5℃/分钟程序升温至230℃。获得结果质谱图如图3所示，经与标准库比对为乙酸己酯。图4为根际芽孢杆菌发酵液产乙酸乙酸己酯，而对照组中不产乙酸己酯，说明产物确实为此根际芽孢杆菌发酵烟叶工业废弃物所产生的。
实施例4 利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯
发酵培养基组分为：葡萄糖10g/L，烟草工业废弃物3g/L，pH值7.0；
在无菌条件下，将根际芽孢杆菌纯培养物直接接种一接种环至装有50mL灭菌的发酵培养基的250mL的摇瓶中，于100转/分钟的摇床中，30℃培养。培养6天后利用GC-MS检测，经与标准库比对为乙酸己酯。
实施例5 利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯
发酵培养基组分为：葡萄糖25g/L，烟草工业废弃物7g/L，pH值7.4；
在无菌条件下，将根际芽孢杆菌纯培养物直接接种一接种环至装有50mL灭菌的发酵培养基的250mL的摇瓶中，于180转/分钟的摇床中，33℃培养。培养7天后利用GC-MS检测，经与标准库比对为乙酸己酯。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagaagg gagcttgctc 60
ccggacgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa cctgcccctt agactgggat 120
aactccggga aaccggagct aataccggat aatccctttc tccacctgga gagagggtga 180
aagatggctt cggctatcac taggggatgg gcccgcggcg cattagctag ttggtaaggt 240
aacggcttac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga ggaaggcctt cgggtcgtaa agctctgttg 420
tgagggaaga agcggtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct caccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggct tcttaagtct gatgtgaaat ctcggggctc 600
aaccccgagc ggccattgga aactggggag cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctagg tgttaggggt ttcgatgccc gtagtgccga 840
agttaacaca ttaagcactc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacgggga cccgcacaag cagtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tttgaccacc caagagattg ggcttcccct tcgggggcaa 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattgagt tgggcactct aaggtgactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca aagggcagcg aaaccgcgag gtgaagccaa 1260
tcccataaag ccattctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat gaagccggaa 1320
ttgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggcaacct tttggagcca 1440
gccgcctaag gtgggacaaa tgattggggt g 1471
SEQ ID NO.2
agagtttgat cctggctcag 20
SEQ ID NO.3
cggctacctt gttacgactt 20
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1471
<212> DNA
<213> 根际芽孢杆菌(Bacillus rhizosphaerae)
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagaagg gagcttgctc 60
ccggacgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa cctgcccctt agactgggat 120
aactccggga aaccggagct aataccggat aatccctttc tccacctgga gagagggtga 180
aagatggctt cggctatcac taggggatgg gcccgcggcg cattagctag ttggtaaggt 240
aacggcttac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga ggaaggcctt cgggtcgtaa agctctgttg 420
tgagggaaga agcggtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct caccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggct tcttaagtct gatgtgaaat ctcggggctc 600
aaccccgagc ggccattgga aactggggag cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctagg tgttaggggt ttcgatgccc gtagtgccga 840
agttaacaca ttaagcactc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacgggga cccgcacaag cagtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tttgaccacc caagagattg ggcttcccct tcgggggcaa 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattgagt tgggcactct aaggtgactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca aagggcagcg aaaccgcgag gtgaagccaa 1260
tcccataaag ccattctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat gaagccggaa 1320
ttgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggcaacct tttggagcca 1440
gccgcctaag gtgggacaaa tgattggggt g 1471
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cggctacctt gttacgactt 20

Claims (6)

1.一种根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae），已于2017年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14440。
2.权利要求1所述的根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用。
3.根据权利要求2所述的根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的根际芽孢杆菌接种至发酵培养基中，发酵后，将所得发酵液纯化，即得到乙酸己酯。
4.根据权利要求3所述的根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用，其特征在于，将权利要求1所述的根际芽孢杆菌接种至发酵培养基中是指直接接种一接种环的纯培养菌体至发酵培养基中。
5.根据权利要求3所述的根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖10~25g/L，烟草工业废弃物3~7g/L，pH值7.0~7.4。
6.根据权利要求3所述的根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用，其特征在于，发酵温度为30-37℃。
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