CN104892783A - 一种铁皮石斛多糖的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物成分提取领域，涉及铁皮石斛多糖的纯化方法，其工艺步骤是：原料，粉碎，过筛，脱脂，水提，抽滤，真空浓缩，醇沉，离心分离，粗品，复溶，除淀粉，反复超低温速冻、融化、离心，透析，醇沉，离心分离，冷冻干燥，得石斛多糖。本发明的技术效果是：除去了淀粉，极大地提高了石斛多糖纯化效率和成本，且步骤简便有效保存石斛多糖生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖的纯化方法。
背景技术
石斛属，于1799被Olaf Swartz发现，为兰科最大属之一，共有1100余种，广泛分布于亚洲、欧洲及大洋洲等热带及亚热带地区。我国约有74余种石斛，主要分布于西南、华东及华南地区。在中国的所有石斛药材中，铁皮石斛被传统的中医认为有最好的药用价值，自古以来便是我国的名贵药材。现代中医理论认为，铁皮石斛(Dendrobium officinale)具有健脾养胃、滋阴补肾、润肺生津等功效，用于治疗慢性萎缩性胃炎、高血压、糖尿病等，具备增强免疫力、抗肿瘤、抗衰老等功效。
石斛的化学成分多种多样，其主要有效成分为石斛类多糖、生物碱等。从草本植物中分离得到的天然多糖被证明有着积极的生物活性，并且应用于免疫相关疾病的治疗。20世纪80年代后期，中国研究人员致力于石斛多糖的提取，目的是开发以多糖为基础的有着增强机体健康功能的产品。然而，传统的多糖纯化方法步骤繁琐、耗时长、损失大、且一次操作可以纯化的样品量少，无法实现纯多糖的工业化制备，这也是困扰多糖发展的一大难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铁皮石斛多糖的高效纯化方法，该方法操作简便、耗能低、无淀粉污染、得率高，极大地提高了石斛多糖的纯化效率。
经过大量研究，本发明人发现由于淀粉在热水中可以明胶化化并溶解，因此用热水法提取的粗多糖会含有淀粉。组织化学研究和冷场扫描电镜证明石斛植物的薄壁细胞中存在淀粉颗粒，并且这些淀粉即为混杂于石斛多糖中的主要杂质成分。因此，高效率、低成本地去除淀粉，是制备铁皮石斛多糖纯品的关键步骤。发明人通过甲基化分析发现铁皮石斛多糖中不存在首尾相连的α-1,4-葡萄糖苷键，所以工艺过程中采用α-淀粉酶处理非常有效地除去了石斛多糖中的淀粉。
本发明具体技术方案如下：
一种铁皮石斛多糖的纯化方法，步骤如下：
1、原料：以铁皮石斛干品为原料；
2、粉碎：用粉碎机将铁皮石斛干品进行粉碎；
3、过筛：粉碎后的原料进行分级过筛60-80目；
4、脱脂：将石斛粗粉用10-20倍有机溶剂回流2-4次进行脱脂，之后离心分离，去除有机溶剂，收集药渣；
5、水提：向药渣中加入20-40倍蒸馏水，在70℃温度下进行水提，将上述水提液进行抽滤，获得滤液，并重复水提3-4次，合并滤液；
6、真空浓缩：将所得滤液进行真空浓缩(真空度-0.1MPa)，浓缩至原有体积的1/6；
7、醇沉：向浓缩液中缓缓加入无水乙醇，边搅拌，边加入，当乙醇浓度达到80％时停止加入，20℃静置12-24h；
8、离心分离：醇沉过夜后，将溶液进行离心，弃去上层有机试剂，收集沉淀；
9、多糖粗品：将沉淀置于通风处，使其中的乙醇挥发殆尽，冷冻干燥得到多糖粗品；
10、复溶：将粗多糖按质量比1:100复溶于水，边溶解边搅拌，直至完全溶解；
11、向溶液中加入耐热型α-淀粉酶，水浴温度为70℃，反应1-3h，期间不断进行搅拌；
12、冻融离心：反应结束后，待溶液冷却即放入-80℃冰箱中速冻，然后取出在25℃环境中融化，融化后离心，收集上清液，重复这一步骤3-4次；
13、透析：将所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500D，透析48h；
14、醇沉：透析结束后，向溶液中加入3倍溶液体积的无水乙醇，边加入边搅拌，20℃静置沉淀12-24h；
15、离心分离：醇沉过夜后进行离心分离，去除乙醇，收集沉淀；
19、冷冻干燥：将沉淀进行真空冷冻干燥，即制得铁皮石斛多糖纯品。
为了达到更好的技术效果，步骤(4)加入了耐热型α-淀粉酶，并设定酶的活力浓度至6000U/L，70℃反应1-3h。
步骤(4)所述有机溶剂为95％乙醇溶液。
为了更好地进行产品质量控制，制备方法步骤19后面还包括质控步骤，包括铁皮石斛多糖纯品的得率测定(以粗多糖质量计)，纯多糖成分分析，以及纯多糖均一性分析：
(1)铁皮石斛多糖纯品的得率测定：将冻干后的纯多糖称重，以粗多糖质量计算纯品得率，纯品得率＝(纯多糖质量/粗多糖质量)×100％；
(2)铁皮石斛多糖纯品成分分析：采用苯酚硫酸法测定纯品中中性糖含量，硫酸咔唑法测定纯品中糖醛酸含量，考马斯亮蓝法测定纯品中蛋白含量，国标法测定纯品中淀粉、灰分和水分含量；
(3)铁皮石斛多糖纯品分子量分布和均一性检测：采用高效分子排阻色谱(HPSEC)系统对多糖纯品进行分子量分布和均一性检测。本方法的特色在于在铁皮石斛多糖的特有性质，制定了一种新型、快速的多糖纯化方式，解决了以往多糖纯化过程中不可避免的“步骤多、高损失、低效率、杂质多”的问题，解决了纯多糖难以产业化的难题。所获得的多糖得率高、操作简便、耗能低、无淀粉污染。
具体实施方式
实施例1：
用粉碎机将干燥的石斛样品进行粉碎，过筛，取80目石斛粉100g。用15倍的95％乙醇回流2次脱脂，之后除去有机试剂并收集药渣。药渣用30倍的蒸馏水水提4次，每次2h，之后抽滤，合并滤液。将滤液真空(真空度-0.1MPa)浓缩至原有体积的1/6，加入无水乙醇，至乙醇浓度达到80％。低温过夜醇沉24h，将乙醇沉淀液离心分离，冷冻干燥得粗品。取上述粗品，按质量比1:100复溶于蒸馏水中。向溶液中加入耐热型α-淀粉酶(购自丹麦诺维信公司，型号BAN480L)至6000U/L，70℃水浴2h，期间不停搅拌。反应结束后放入-80℃冰箱中速冻，然后取出于室温融化，再离心，取上清液，重复这一步骤4次。将所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液体积的无水乙醇，20℃静置沉淀24h。离心，收集沉淀，冷冻干燥，即制得铁皮石斛多糖纯品。得率≥58.8％，纯多糖中中性糖含量≥88.4％，无淀粉。
实施例2：
用粉碎机将干燥的石斛样品进行粉碎，过筛，取80目石斛粉100g。用15倍的95％乙醇回流2次脱脂，之后除去有机试剂并收集药渣。药渣用30倍的蒸馏水水提3次，每次2h，之后抽滤，合并滤液。将滤液真空(真空度-0.1MPa)浓缩至原有体积的1/6，加入无水乙醇，至乙醇浓度达到80％。低温过夜醇沉12h，将乙醇沉淀液离心分离，冷冻干燥得粗品。取上述粗品，按质量比1:100复溶于蒸馏水中。向溶液中加入耐热型α-淀粉酶购自丹麦诺维信公司，型号BAN480L)至6000U/L，70℃水浴3h，期间不停搅拌。反应结束后放入-80℃冰箱中速冻，然后取出于室温融化，再离心，取上清液，重复这一步骤3次。将所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液体积的无水乙醇，20℃静置沉淀24h。离心，收集沉淀，冷冻干燥，即制得铁皮石斛多糖纯品。得率≥58％，纯多糖中中性糖含量≥85％，无淀粉。
实施例3：
用粉碎机将干燥的石斛样品进行粉碎，过筛，取80目石斛粉100g。用10倍的95％乙醇回流3次脱脂，之后除去有机试剂并收集药渣。药渣用20倍的蒸馏水水提4次，每次2h，之后抽滤，合并滤液。将滤液真空(真空度-0.1MPa)浓缩至原有体积的1/6，加入无水乙醇，至乙醇浓度达到80％。低温过夜醇沉12h，将乙醇沉淀液离心分离，冷冻干燥得粗品。取上述粗品，按质量比1:100复溶于蒸馏水中。向溶液中加入耐热型α-淀粉酶(购自丹麦诺维信公司，型号BAN480L)至6000U/L，70℃水浴1h，期间不停搅拌。反应结束后放入-80℃冰箱中速冻，然后取出于室温融化，再离心，取上清液，重复这一步骤3次。将所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液体积的无水乙醇，20℃静置沉淀24h。离心，收集沉淀，冷冻干燥，即制得铁皮石斛多糖纯品。得率≥55％，纯多糖中中性糖含量≥82％，淀粉含量≤0.01％。
Claims (3)
1.一种铁皮石斛多糖的纯化方法，其特征在于步骤如下：
(1)原料：以铁皮石斛干品为原料；
(2)粉碎：用粉碎机将铁皮石斛干品进行粉碎；
(3)过筛：粉碎后的原料进行分级过筛60-80目；
(4)脱脂：将石斛粗粉用10-20倍有机溶剂回流2-4次进行脱脂，之后离心分离，去除有机溶剂，收集药渣；
(5)水提：向药渣中加入20-40倍蒸馏水，在70℃温度下进行水提，将上述水提液进行抽滤，获得滤液，并重复水提3-4次，合并滤液；
(6)真空浓缩：将所得滤液进行真空浓缩，浓缩至原有体积的1/6；
(7)醇沉：向浓缩液中缓缓加入无水乙醇，边搅拌，边加入，当乙醇浓度达到80％时停止加入，20℃静置12-24h；
(8)离心分离：醇沉过夜后，将溶液进行离心，弃去上层有机试剂，收集沉淀；
(9)多糖粗品：将沉淀置于通风处，使其中的乙醇挥发殆尽，冷冻干燥得到多糖粗品；
(10)复溶：将粗多糖按质量比1:100复溶于水，边溶解边搅拌，直至完全溶解；
(11)向溶液中加入耐热型α-淀粉酶反应；
(12)冻融离心：反应结束后，待溶液冷却即放入-80℃冰箱中速冻，然后取出在25℃环境中融化，融化后离心，收集上清液，重复这一步骤3-4次；
(13)透析：将所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500D，透析48h；
(14)醇沉：透析结束后，向溶液中加入3倍溶液体积的无水乙醇，边加入边搅拌，20℃静置沉淀12-24h；
(15)离心分离：醇沉过夜后进行离心分离，去除乙醇，收集沉淀；
(19)冷冻干燥：将沉淀进行真空冷冻干燥，即制得铁皮石斛多糖纯品。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征是：步骤(11)加入了耐热型α-淀粉酶，并设定酶的活力浓度至6000U/L，70℃反应1-3h。
3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征是：步骤(4)所述有机溶剂为95％乙醇溶液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150909 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |