CN104211754B

CN104211754B - 一种从紫花苜蓿茎中制备多糖及糖蛋白的方法

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Publication number: CN104211754B
Application number: CN201410476283.7A
Authority: CN
Inventors: 陈磊; 牛宇戈; 龚璐; 阿拉西·斯尔克米德克; 冯子倩
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2034-09-17
Also published as: CN104211754A

Abstract

本发明涉及一种从紫花苜蓿茎中制备纯多糖及糖蛋白的方法，依次采用热水、冷碱、热碱为提取液，从紫花苜蓿茎中获得不同性质的苜蓿多糖粗组分，再经醇沉、酸沉等步骤进一步将所得多糖组分进行细分，最后经超滤和柱层析得到苜蓿多糖和糖蛋白的纯组分。本发明的方法工艺简单，易于实现，不仅大幅度提高了苜蓿多糖的提取效率，也大大提高了苜蓿原料的生物利用率，同时所用于多糖和糖蛋白提取、分离、纯化的试剂均廉价易得，无毒且不对环境造成污染，易于回收。本发明采用一个工艺流程即可实现流水线式提取得到不同性质的苜蓿多糖和糖蛋白组分，并经进一步纯化得到纯品，适合规模化生产，有利于开发以苜蓿多糖为主要活性成分的保健食品与药品。

Description

一种从紫花苜蓿茎中制备多糖及糖蛋白的方法

技术领域

本发明涉及从紫花苜蓿茎中制备纯多糖及糖蛋白的方法。

背景技术

苜蓿多糖(Alfalfa Polysaccharides，AP)是从多年生豆科牧草紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中提取的一种天然无毒的植物多糖，其生物活性目前已被大量研究并证实。已有研究表明苜蓿多糖具有增强免疫力、抗衰老以及抑制癌细胞增殖等保健作用，并具有很好的抗HIV功效，还具有抗氧化、治疗高胆固醇的作用。此外，苜蓿多糖也具有降血糖、降血脂等功能。近年来苜蓿多糖因其保健作用和在禽畜饲料添加剂方面的应用而逐渐受到人们的重视。

紫花苜蓿不仅是我国也是全世界人工种植面积最大的草种，每年可收获3-4茬，年平均产量为16-20吨/公顷(因产地和品种而不同)，来源广泛，廉价易得。近年来，随着农业产业结构的调整和畜牧业的发展，以及对生态系统的重视，苜蓿种植面积逐年扩大，并逐步向规模化、集约化方向发展，成为推动农村经济可持续发展与增加农民收入的新增长点。然而，目前我国的苜蓿产品仍以草捆、草块、草颗粒、草粉等初级产品为主，技术含量较低，经济效益也较微薄。因此，为保证我国苜蓿产业的健康、高效、持续发展，苜蓿多糖等深加工产品的研究已经成为迫在眉睫的问题。

苜蓿叶蛋白的研究已经很多，而苜蓿茎中则含有大量的多糖类物质。目前苜蓿多糖的提取和纯化方法多样，没有统一的标准，传统方法所得苜蓿多糖主要是水提多糖，经加热或超声所得，不仅耗时耗能，而且产率低，所得多糖种类单一。而根据其他植物多糖及真菌多糖的研究表明，植物中除水溶性多糖外，还含有大量的碱溶性多糖及糖蛋白类成分。因此，为了合理开发苜蓿资源，使苜蓿多糖的制备和纯化能达到规模化、工业化的需求，其提取工艺有待改善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从紫花苜蓿茎中制备纯多糖及糖蛋白的方法。

本发明的第一方面，提供一种从紫花苜蓿茎中制备纯多糖及糖蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)采用85vol％-100vol％乙醇水溶液加热处理紫花苜蓿茎粉，脱酯并除去小分子组分，过滤收集第一残渣；

(b)采用水加热处理步骤(a)得到的第一残渣，过滤分别收集第一滤液和第二残渣；

(c1)将步骤(b)收集得到的第一滤液浓缩后，加入85vol％-100vol％乙醇水溶液，沉淀得到水溶性粗多糖；

(c2)将浓度为0.5M-2.5M的NaOH溶液加入到步骤(b)收集得到的第二残渣搅拌提取，过滤分别收集第二滤液和第三残渣；

(d1)加入85vol％-100vol％乙醇水溶液到步骤(c2)获得的第二滤液中，过滤分别收集第一上清液和沉淀物冷碱可溶性粗多糖，将第一上清液浓缩后调节至酸性，分离得到第二上清液和沉淀物第一糖蛋白粗组分，将第二上清液调节至中性，超滤脱盐得到第二糖蛋白粗组分；

(d2)采用浓度为0.5M-2.5M的NaOH溶液加热处理步骤(c2)获得的第三残渣，过滤收集第三滤液和第四残渣，加入85vol％-100vol％乙醇水溶液到第三滤液，过滤收集沉淀物热碱可溶性粗多糖。

在另一优选例中，步骤(c1)和步骤(c2)可以同时进行、完成步骤(c1)后进行步骤(c2)、或完成步骤(c2)后进行步骤(c1)。

在另一优选例中，步骤(d1)和步骤(d2)可以同时进行、完成步骤(d1)后进行步骤(d2)、或完成步骤(d2)后进行步骤(d1)。

在另一优选例中，所述方法在步骤(a)前还包括对紫花苜蓿茎进行干燥、粉碎、过筛获得所述紫花苜蓿茎粉的步骤。

在另一优选例中，所述紫花苜蓿茎粉的含水量至多为10wt％，较佳地，在5wt％以内，更佳地，在1wt％以内，甚至≤0.1wt％。

在另一优选例中，所述过筛是指过20-100目筛，较佳地过30-50目筛。

在另一优选例中，步骤(a)中，所述紫花苜蓿茎粉与所述乙醇水溶液的料液比为1g：5-25mL，较佳地为1g：5-20mL，更佳为1g：10-20mL。

在另一优选例中，步骤(a)中，加热温度为50-85℃，较佳地为60-75℃，加热时间为0.5-5h，较佳地为45min-2h。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述紫花苜蓿茎粉与所述乙醇水溶液的料液比为1g：8-20mL，较佳地为1g：8-15mL。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，加热温度为60-80℃，较佳地为65-75℃。在另一优选例中，所述步骤(a)中，加热时间为40min-3h，较佳地为40-90min。

在另一优选例中，所述方法还包括采用步骤(a)的方法对收集得到的第一残渣处理1-3次的步骤，合并第一残渣进行步骤(b)。

在另一优选例中，步骤(b)中，所述第一残渣与水的料液比为1g：10-50mL，较佳地为1g：10-30mL。

在另一优选例中，步骤(b)中，加热温度为50-85℃，较佳地为65-75℃，加热时间为0.5-5h，较佳地为45min-2h。

在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述第一残渣与水的料液比为1g：8-20mL，较佳地为1g：8-15mL。

在另一优选例中，所述步骤(b)中，加热温度为60-80℃，较佳地为65-75℃。

另一优选例中，所述步骤(b)中，加热时间为40min-3h，较佳地为40-90min。

在另一优选例中，所述方法还包括采用步骤(b)的水加热处理方法对收集得到的第二残渣处理1-3次的步骤，收集合并第一滤液和第二残渣，分别进行步骤(c1)和步骤(c2)。

在另一优选例中，步骤(c1)中，采用减压浓缩第一滤液，浓缩后的第一滤液的体积与加入的乙醇水溶液的体积比为1：2-8，较佳地为1：3-5。

在另一优选例中，步骤(c2)中，所述第二残渣与NaOH溶液的料液比为1g：10-50mL；较佳地为1g：15-30mL。

在另一优选例中，步骤(c2)在15-30℃将NaOH溶液加入第二残渣中，搅拌8-24h后过滤。

在另一优选例中，所述方法还包括采用步骤(c2)的NaOH溶液处理方法对收集得到的第三残渣处理1-3次的步骤，收集合并第二滤液和第三残渣，分别进行步骤(d1)和步骤(d2)。

在另一优选例中，所述步骤(d1)中，所述第二滤液与所述乙醇水溶液的体积比为1：1-8，较佳地为1：2-5。

在另一优选例中，所述步骤(d2)中，所述第三残渣与NaOH溶液的料液比为1g：10-50mL；较佳地为1g：15-30mL。

在另一优选例中，步骤(d2)中加热温度为60-90℃，较佳地为70-80℃，加热时间为1-5h，较佳地为1.5-3h。

在另一优选例中，所述方法还包括采用步骤(d2)的NaOH溶液加热处理方法对收集得到的第四残渣处理1-3次的步骤，收集合并第三滤液后进行步骤乙醇沉淀处理。

在另一优选例中，所述方法还包括冻干、纯化步骤，所述冻干、纯化步骤是将选自下组的组分冻干后采用超滤和/或柱层析进行纯化：

步骤(c1)得到的水溶性粗多糖、步骤(d1)得到的冷碱可溶性粗多糖、步骤(d1)得到的第一糖蛋白粗组分、步骤(d1)得到的第二糖蛋白粗组分、步骤(d2)得到的热碱可溶性粗多糖。

在另一优选例中，采用水洗涤上述组分后进行冻干。

在另一优选例中，采用超滤纯化以下组分：步骤(c1)得到的水溶性粗多糖、步骤(d1)得到的冷碱可溶性粗多糖、步骤(d2)得到的热碱可溶性粗多糖。

在另一优选例中，采用柱层析纯化以下组分：步骤(d1)得到的第一糖蛋白粗组分、步骤(d1)得到的第二糖蛋白粗组分。

在另一优选例中，所述超滤是采用截留分子量为8-15KDa的超滤膜进行超滤。

在另一优选例中，所述柱层析是指采用选自下组的一种或两种以上的填料进行柱层析：Sephacryl S200、Sephacryl S400、Sephacryl S1000、Sephadex G-200。

本发明中采用的NaOH溶液的浓度为0.5-2.5M，较佳地为0.8-1.5M，更佳地为0.8-1.2M。

本发明的方法工艺简单，易于实现，不仅大幅度提高了苜蓿多糖的提取效率，也大大提高了苜蓿原料的生物利用率，同时所用于多糖和糖蛋白提取、分离、纯化的试剂均廉价易得，无毒且不会对环境造成污染，易于回收。本发明采用一个工艺流程即可实现流水线式提取得到不同性质的苜蓿多糖和糖蛋白组分，并经进一步纯化得到纯品，适合规模化生产，有利于开发以苜蓿多糖为主要活性成分的保健食品与药品。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

图1为第一糖蛋白纯化物HPLC-DAD-RID图谱，其中，a为DAD检测器于280nm波长下检测图谱；b为RID检测器检测图谱。

图2为第二糖蛋白纯化物HPLC-DAD-RID图谱，其中，a为DAD检测器于280nm波长下检测图谱；b为RID检测器检测图谱。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种新型的从紫花苜蓿茎中制备多糖及糖蛋白的方法，将紫花苜蓿茎粉脱酯后，依次采用热水、冷碱、热碱提取分别获得不同性质的苜蓿粗多糖粗组分，再经醇沉、酸沉等步骤将所得多糖组分进行细分，并进一步通过超滤和柱层析的方法得到苜蓿多糖和糖蛋白的纯组分。本发明工艺简单，易于实现，采用一个工艺流程即可实现流水线式提取得到不同性质的苜蓿多糖和糖蛋白组分，并经进一步纯化得到纯品，适合规模化生产，有利于开发以苜蓿多糖为主要活性成分的保健食品与药品。在此基础上，完成了本发明。

本方法依次采用热水、冷碱、热碱提取的方法，获得不同性质的苜蓿多糖粗组分，再经醇沉、酸沉等不同分离方法进一步将所得多糖组分细分，最后经超滤和柱层析的方法得到苜蓿多糖和糖蛋白的纯组分。

本方法所采用的工艺简单，易于实现，不仅大幅度提高了苜蓿多糖的提取效率，也大大提高了苜蓿原料的生物利用率，同时所用于多糖和糖蛋白提取、分离、纯化的试剂均廉价易得，无毒且不对环境造成污染，易于回收。

本方法采用一个工艺流程即可实现流水线式提取得到不同性质的苜蓿多糖和糖蛋白组分，并经进一步纯化得到纯品，操作简便易行，适合规模化生产。有利于开发以苜蓿多糖为主要活性成分的保健食品与药品。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用方法

以下实施例中得到的粗多糖、糖蛋白粗组分采用以下方法进行纯化。

本发明中，采用10kDa超滤膜进行超滤，超滤前先以500mL水将膜充分润洗，在物料杯中加入500mL浓度为1-1.5mg/mL的多糖水溶液，以恒流蠕动泵将溶液泵过超滤膜，控制膜后压力小于30psi，将回流液导回样品杯重复超滤，弃去透过液。当多糖溶液体积低于250mL时，补水至500mL继续超滤。洗脱6-7倍体积的水之后，将溶液浓缩至200mL即可停止，将截留溶液冻干得苜蓿多糖纯品。

可以采用的柱层析填料有：Sephacryl S400(分离范围2×10⁴-8×10⁶)、SephacrylS200(分离范围5×10³-2.5×10⁵)，Sephacryl S1000(分离范围5×10⁵-1×10⁸)，SephadexG-100(分离范围4000-150000)，Sephadex G-200(分离范围5000-600000)。优选采用Sephacryl S400填料，层析柱为湿法装填，玻璃柱内径为16mm，装填高度70-80cm，装填过程以恒流蠕动泵依次采取自然沉降、3倍柱体积水以1mL/min流速平衡、3倍柱体积水以2mL/min流速压实填料、3倍柱体积水以2mL/min流速反向压实填料的方式装填，以获得高稳定性和重复性的柱效。洗脱过程使用水作为洗脱剂，样品上样量为200-300mg，以恒流蠕动泵控制流速为1mL/min，采用自动部分收集器收集洗脱液(5mL/管)。首次上样可采用BCA法检测洗脱液中目标组分出峰时间及管数，同一样品重复进样，可直接合并相同管数的样品，浓缩、冻干得苜蓿糖蛋白纯品。

实施例1

将烘干或风干的紫花苜蓿茎粉碎过40目筛后，按料液比1g：10mL的比例加入95％乙醇，于70℃加热1h，过滤，弃去滤液，重复三次，以达到除去小分子成分和脱脂的目的。

脱脂后的残渣按料液比1：20加水，于70℃加热1h，过滤，收集滤液，重复三次，合并滤液，减压浓缩至1/4体积，加入4倍体积的95％乙醇，沉淀得水溶性粗多糖(干重得率9.2％)。将水溶性粗多糖进行水洗、冻干后采用超滤进行纯化得到水提多糖。

经水提后的残渣按料液比1g：20mL加入1M的NaOH溶液，室温下搅拌12h，过滤，收集滤液，重复三次，合并滤液。将所得滤液以3倍体积的95％乙醇沉淀，得冷碱可溶性多糖粗组分(干重得率17.6％)；上清液经减压浓缩除去酒精，调pH至酸性，沉淀得第一糖蛋白粗组分(干重得率6.8％)；离心后将上清液pH调至中性，超滤脱盐，冻干得第二糖蛋白粗组分(干重得率6.6％)。

冷碱可溶性多糖粗组分进行水洗、冻干后采用超滤进行纯化得到冷碱提多糖。将第一和第二糖蛋白粗组分进行水洗、冻干后采用柱层析进行纯化得到冷碱提糖蛋白。

如图1和图2所示，采用HPLC串联DAD及RID检测器，分别检测蛋白与糖，两个检测信号都在同一检测时间出峰的即为糖蛋白，同时可以检测物质的纯度。经分析，所得纯化物中所含总糖与总蛋白的含量接近(表1)。

表1 两个糖蛋白纯化组分的成分构成

冷碱提取后的残渣(第三残渣，依次经热水、冷碱提取后的残渣)，再以料液比1g：20mL加入1M的NaOH溶液，75℃加热提取2h，过滤，收集滤液，重复三次，合并滤液。将热碱提取所得滤液以3倍体积的95％乙醇沉淀，得热碱可溶性多糖粗组分(干重得率8.9％)，将热碱可溶性多糖粗组分进行水洗、冻干后采用超滤进行纯化得到热碱提多糖。

经检测，水提多糖，冷碱提多糖和热碱提多糖的纯度和主要单糖构成，如表2所示。

表2 提取得到的多糖纯度和单糖组成

实施例2

本实施例的步骤与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于，脱脂后的残渣按料液比1g：10mL加水，于80℃加热1h，过滤，收集滤液，重复5次，合并滤液，减压浓缩至1/4体积，加入5倍体积的85％乙醇，沉淀得水溶性粗多糖。

实施例3

本实施例的步骤与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于，经脱脂和水提后的残渣按料液比1g：30mL加0.8M的NaOH溶液，搅拌提取8小时，过滤，收集滤液，重复5次，合并滤液。

实施例4

本实施例的步骤与实施例1的步骤基本相同，不同之处在于，依次经热水、冷碱提取后的残渣，再以料液比1g：10mL加入1M的NaOH溶液，80℃加热提取4h，过滤，收集滤液，重复5次，合并滤液。将热碱提取所得滤液以3倍体积的98％乙醇沉淀，得热碱可溶性多糖粗组分。

对比例

将烘干或风干的紫花苜蓿茎粉碎过40目筛后，按料液比1g：10mL的比例依次分别采用正己烷、乙酸乙酯、95％乙醇，于70℃加热1h，过滤，弃去滤液，重复三次，以达到除去小分子成分和脱脂的目的。

脱脂后的残渣按料液比1g：20mL加水，于70℃加热1h，过滤，收集滤液，重复三次，合并滤液，减压浓缩至1/4体积，加入3倍体积的95％乙醇，沉淀得水溶性粗多糖。将水溶性粗多糖进行水洗、冻干(干重得率7.8％)。

经水提后的残渣按料液比1：10加入1M的NaOH溶液，室温下搅拌6h，过滤，收集滤液，重复三次，合并滤液。将所得滤液以3倍体积的95％乙醇沉淀，得冷碱可溶性多糖粗组分，将冷碱可溶性多糖粗组分进行水洗、冻干(干重得率13.4％)。

冷碱提取后的残渣(第三残渣，依次经热水、冷碱提取后的残渣)，再以料液比1：15加入NaOH溶液，75℃加热提取2h，过滤，收集滤液，重复三次，合并滤液。将热碱提取所得滤液以3倍体积的95％乙醇沉淀，得热碱可溶性多糖粗组分，将热碱可溶性多糖粗组分进行水洗、冻干(干重得率6.7％)。

因所提多糖水溶性较差，将多糖以50mg/mL的浓度溶于NaOH溶液(0.05mol/L)，过Sephacryl S400层析柱，上样量300mL，以0.05mol/L的NaOH溶液洗脱，合并主要成分，透析48小时，除去纯化样品溶液中的碱，减压旋转蒸发浓缩，并冷冻干燥得多糖纯品。

对比例方法所得提取物产量低，提取物未能完全分离出来。沉淀所得提取物的量与最后残渣的量之和远小于原料，造成严重浪费。所用纯化方法上样量少，且样品损失严重；需要除碱步骤，耗时长。

与上述对比例相比，本发明的方法因纯化前已将粗提物进行初步纯度鉴定，所含杂质分子量较低，只需除去小分子即可，因此选取超滤的方法，选用10kDa分子量膜，即可同时达到除碱、除小分子，以得到多糖纯品，同时具有上样量大，耗时短的优势。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种从紫花苜蓿茎中制备纯多糖及糖蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)采用85vol％-100vol％乙醇水溶液加热处理紫花苜蓿茎粉，脱脂并除去小分子组分，过滤收集第一残渣；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(a)前还包括对紫花苜蓿茎进行干燥、粉碎、过筛获得所述紫花苜蓿茎粉的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述紫花苜蓿茎粉与所述乙醇水溶液的料液比为1g：5-25mL；和/或

步骤(a)中，加热温度为50-85℃，加热时间为0.5-5h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述第一残渣与水的料液比为1g：10-50mL；和/或

步骤(b)中，加热温度为50-85℃，加热时间为0.5-5h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c1)中，采用减压浓缩第一滤液，浓缩后的第一滤液的体积与加入的乙醇水溶液的体积比为1：2-8。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c2)中，所述第二残渣与NaOH溶液的料液比为1g：10-50mL；和/或

步骤(c2)在15-30℃将NaOH溶液加入第二残渣中，搅拌8-24h后过滤。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(d1)中，所述第二滤液与乙醇水溶液的体积比为1：1-8。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d2)中，所述第三残渣与NaOH溶液的料液比为1g：10-50mL；和/或

步骤(d2)中加热温度为60-90℃，加热时间为1-5h。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括冻干、纯化步骤，所述冻干、纯化步骤是将选自下组的组分冻干后采用超滤和/或柱层析进行纯化：

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述超滤是采用截留分子量为8-15KDa的超滤膜进行超滤；和/或

所述柱层析是指采用选自下组的一种或两种以上的填料进行柱层析：SephacrylS200、Sephacryl S400、Sephacryl S1000、Sephadex G-200。