CN111138558B - 一种天然免疫增强多糖pcp及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天然免疫增强多糖PCP及其制备方法和用途，其中免疫增强多糖是从榆黄菇中分离获得的多糖组分PCP，分子量为1.67x10³kDa左右，其单糖组成主要有鼠李糖和葡萄糖。本发明获得的榆黄菇多糖组分PCP无明显毒副作用，具有良好的免疫增强能力，实验证实多糖PCP可以很好地促进一氧化氮的分泌，增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力，并能促进相关细胞因子的释放。PCP可作为天然高效免疫增强剂，在医药保健等领域具有巨大的应用前景。

Description

一种天然免疫增强多糖PCP及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种天然免疫增强多糖PCP及其制备方法和用途，属于食用菌加工领域。

背景技术

免疫系统是机体普遍存在的一种防御机制，由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成，它是防卫病原体入侵最有效的武器，能够发现并清除异物、外来病原微生物。免疫低下将会对机体造成不同程度的损害，最直接的表现就是容易被病毒、细菌感染，经常患病，造成体质虚弱，严重的甚至会诱发重大疾病，危害机体的生命安全。增强机体免疫能力能够减少病毒、细菌的感染，维护机体的安全，因此如何更好的增强机体的免疫能力一直是人们关心的焦点。

多糖是生物机体内由10个及以上单糖分子通过糖苷键连接缩合而成的一类结构复杂且分子量庞大的天然高分子聚合物，近年来，随着研究的深入，真菌多糖诸多生物活性已逐渐被人们认知，如抗氧化、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、调节肠道菌群、抗疲劳、降血糖、降血脂等。由于天然多糖具有良好的生物活性和极低的毒副作用，真菌多糖受到了越来越多的关注，比如香菇多糖、裂褶菌多糖、灵芝多糖、茯苓多糖等真菌多糖作为免疫调节和抗肿瘤(辅助)药物在临床上得到广泛的应用，效果显著。

榆黄菇(Pleurotuscitrinopileatus)又名金顶侧耳、玉皇蘑、金顶蘑，为伞菌目侧耳科金顶侧耳属木腐性食用菌。榆黄菇含有蛋白质，氨基酸，维生素C，烟酸，泛酸，钾，钠，钙，铁，锌等营养物质，可以补充人体所需的营养，增强人体的体质。目前关于榆黄菇的研究多集中在粗提物的抗氧化、抗菌、抗肿瘤和营养方面，榆黄菇多糖免疫增强方面的研究有待加强。

发明内容

本发明旨在提供一种天然免疫增强多糖PCP及其制备方法和用途。本发明提供的榆黄菇多糖PCP具有良好的免疫增强作用，可用于治疗或预防与免疫低下相关的疾病，可广泛应用于医药、保健等领域，以解决新型天然免疫增强剂的发现及加强榆黄菇多糖免疫方面研究的问题。

本发明天然免疫增强多糖PCP，是由榆黄菇子实体提取分离后获得，经过HPLC测定分析，分子量为1.67x10³kDa；通过单糖组成分析，其主要包括鼠李糖和葡萄糖，摩尔比为1:36.34。

本发明天然免疫增强多糖PCP的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将榆黄菇子实体超微粉碎后过80目网筛，获得榆黄菇粉末；

步骤2：将步骤1获得的榆黄菇粉末先用石油醚脱脂，再用95vt％乙醇热回流三次除杂，过滤后沉淀物干燥备用；

步骤3：将步骤2获得的沉淀物按照1g:20mL的料液比加入去离子水，80-90℃水浴2h，分离上清液并浓缩，加入4倍体积的乙醇，4℃静置12h，离心收集沉淀物；

步骤4：将步骤3获得的沉淀物用去离子水溶解，采用Sevag法除蛋白，除尽蛋白后，流水透析24h，去离子水透析48h，透析袋截流量3500Da，冷冻干燥后获得榆黄菇粗多糖；

步骤5：将步骤4获得的榆黄菇粗多糖用30-40vt％乙醇进行醇沉，获得榆黄菇多糖初步纯化品，去离子水复溶后用DEAE-Sephorase F.F凝胶柱分离，进行梯度洗脱(0-0.1-0.3-0.5M的NaCl溶液梯度洗脱)，水洗部分经高效液相检测收集合并相同组分的多糖，真空冷冻干燥得到榆黄菇多糖PCP。

本发明天然免疫增强多糖PCP的用途，是在制备天然免疫增强剂中的应用，可用于医药保健等领域。具体的免疫活性检测，包括如下内容：

1、将多糖PCP成2mg/mL的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，然后进行高效液相色谱分析其分子量，PMP柱前衍生化法检测其单糖组成。

2、通过对巨噬细胞的存活率、NO释放、吞噬能力、细胞因子分泌水平进行研究检测，发现多糖PCP能够很好的促进巨噬细胞的增殖，增强巨噬细胞的免疫活性，且随着浓度的提高，增强的效果越好，在40μg/mL时，增强效果已经接近阳性药物。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明以榆黄菇子实体为原料，获得了一种新型均一多糖组分PCP，步骤简单高效，为榆黄菇资源利用奠定了基础。

2、发现榆黄菇多糖PCP是一种天然的免疫增强剂，能够显著增强巨噬细胞的一氧化氮释放能力、吞噬能力和促进免疫炎症介质的释放，且在浓度极低时就出现较为明显的效果，与现有技术相比，一方面解决了新型高效免疫增强剂的研发问题，另一方面也促进了榆黄菇多糖新功能的拓展。

附图说明

图1是PCP的高效液相色谱图，可以看出榆黄菇多糖PCP是均一组分。

图2是PCP单糖组成，(A)单糖标准品，(B)PCP。

图3是巨噬细胞RAW的MTT细胞增殖的测定；从图3我们可以看到，榆黄菇多糖PCP能够促进巨噬细胞的增殖，在浓度为2.5μg/mL时效果最为明显，说明PCP对细胞没有毒性作用。

图4是巨噬细胞RAW的NO释放量的测定；从图4中我们可以看到，随着榆黄菇多糖PCP浓度的增加，巨噬细胞RAW的NO释放量明显存在着一个浓度依赖性，随着PCP浓度的升高，NO也有着明显的升高，说明PCP能够促进巨噬细胞免疫炎症介质的释放。

图5是巨噬细胞RAW的吞噬能力的测定；从图5的实验结果中我们可以看出，与空白组相比，榆黄菇多糖PCP组尤其在40μg/mL吞噬能力有着明显的增加，且随着PCP浓度的增加，接近阳性LPS组，说明PCP能够增加巨噬细胞的吞噬能力。

图6是细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β释放的测定；从图6的实验结果中可以看到随着多糖PCP浓度的增加，细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的释放量也有着明显的增加，说明多糖PCP能促进巨噬细胞细胞因子的释放。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些具体实施方式对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定。

实施例1：天然免疫增强多糖PCP的制备方

1、榆黄菇粗多糖的提取：

(1)预处理：将榆黄菇子实体通过粉碎机粉碎过80目网筛，得到的粉末加入先用石油醚，再用95％乙醇中热回流三次，干燥沉淀物备用

(2)提粗糖：预处理后的榆黄菇粉末按照料液比1:20的比例加入去离子水于85℃的水浴锅中，水浴2h，反复提取三次。将提取液浓缩，与乙醇按照1:4的比例加入乙醇，然后置于4℃12h。离心弃去上清收集沉淀。

(3)Sevag法除蛋白：将收集的沉淀用去离子水溶解，与正丁醇、氯仿按照5:1:4的比例混合，搅拌1.5h，离心吸取上清，重复多次直至无蛋白出现。

(4)冷冻干燥：将除完蛋白的多糖于流水中透析48h，在去离子水中透析48h。透析过后的多糖溶液冷冻干燥，得到榆黄菇多糖。

2、PCP多糖的分离纯化：

(1)取200mg的榆黄菇多糖用35％的乙醇4℃醇沉12h，收集沉淀并溶解，-80℃冷冻2h，放入冻干机中于-56℃，气压0.10mbar下冻干2天，收集多糖样品。

(2)称取50mg干燥的多糖样品，用1.5mL的DI水溶解离心取上清，上样于DEAE-FF(2cm×20cm)凝胶柱中，用DI水和不同浓度的NaCl溶液(0.1,0.3,0.5M)进行梯度洗脱，恒流泵进行收集，5min一管，每管收集5mL，通过硫酸-苯酚法测糖含量制作洗脱曲线，经高效液相检测收集合并相同组分的多糖，于-54℃、气压0.10mbar的冻干机冻干2天，得到多糖PCP。

本实施例制得的多糖组分PCP分子量为1.67x10³kDa，主要由鼠李糖和葡萄糖组成，摩尔比为1:36.34，见附图1，2。

实施例2：PCP多糖对巨噬细胞增殖的测定

细胞增殖试验采用MTT试验进行测定，首先RAW264.7细胞种入96孔板种保证每个孔细胞数在8×10³左右放入培养箱过夜，然后每孔加入100μL不同浓度的PCP溶液，空白对照为等体积的培养基继续培养24h，24h后每孔加入5％的MTT再培育4h，4h后移除培养基加入100μL DMSO，锡箔纸避光振摇10min后，酶标仪570nm处测其吸光值，每个实验组3个平行，求其平均值。结果见图3。由图3结果可以看出榆黄菇多糖PCP能够促进巨噬细胞的增殖，在所取的各浓度均促进巨噬细胞的增殖，浓度为2.5μg/mL时效果最为明显，说明PCP对细胞没有毒性作用。

实施例3：PCP多糖对巨噬细胞NO释放量的测定

将RAW264.7细胞种于96孔板，使每个孔的细胞在1×10⁵左右，用不同浓度的PCP溶液处理，阳性对照为LPS(1μg/mL)，空白对照为等体积的培养基，放在培养箱培养24h。24h后取细胞上清液50μL与等体积的Griess试剂A液50μL、B液50μL混合，用锡箔纸避光37℃振摇10min。通过绘制的亚硝酸钠标准曲线来测定亚硝酸钠的浓度，用酶标仪在540nm处测量其吸光值，对照NO释放的标准曲线反映NO浓度，每个实验组3个平行，求其平均值。结果见图4。由图4结果可以看出随着PCP浓度的增加，巨噬细胞NO释放量存在着浓度依赖性，说明PCP能够促进巨噬细胞免疫炎症介质的释放。

NO释放的标准曲线：

实施例4：PCP多糖对巨噬细胞吞噬能力的影响

通过中性红法测定巨噬细胞的吞噬能力，将RAW246.7细胞种于48孔板中保持每孔细胞数在8×10⁴过夜，然后加入不同浓度的PCP在培养箱中继续培养24h，空白对照为等体积的培养基，阳性对照为LPS(1μg/mL)。24h后每孔加入0.075％的中性红100μL，孵育0.5h,用PBS轻轻洗涤3次，通过倒置荧光显微镜观察其形态。每孔加入100μL细胞裂解液(1％乙酸：50％乙醇＝1:1)，4℃孵育2h，然后室温下孵育12h，酶标仪540nm处测其吸光值。每个实验组3个平行，求其平均值，结果见图5。由图5吞噬能力实验的结果中我们可以看出，相对于空白组，榆黄菇多糖PCP组尤其在40μg/mL吞噬能力有着明显的增加，且随着PCP浓度的增加，接近阳性LPS组，说明PCP能够增加巨噬细胞的吞噬能力。

实施例5：PCP多糖对巨噬细胞细胞因子释放能力的影响

收集PCP多糖或LPS干预后的巨噬细胞培养上清，通过ELISA试剂盒分别对TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度进行检测。根据标准曲线算出相应浓度。实验3组平行，求其平均值。结果见图6

由图6细胞因子检测的结果中我们可以看出，相对于空白组，榆黄菇多糖PCP组尤其在40μg/mL三种细胞因子有着明显的增加，且随着PCP浓度的增加，接近阳性LPS组，说明PCP能够促使巨噬细胞释放免疫细胞因子。

Claims (3)

1.一种天然免疫增强多糖PCP，其特征在于：

是由榆黄菇子实体提取分离后获得，经HPLC测定分子量为1.67x10³kDa；

所述天然免疫增强多糖PCP包括鼠李糖和葡萄糖，摩尔比为1:36.34；

所述多糖PCP是通过包括如下步骤的方法制备获得：

步骤1：将榆黄菇子实体超微粉碎后过80目网筛，获得榆黄菇粉末；

步骤2：将步骤1获得的榆黄菇粉末先用石油醚脱脂，再用95vt%乙醇热回流三次除杂，过滤后沉淀物干燥备用；

步骤3：将步骤2获得的沉淀物按照1g:20mL的料液比加入去离子水，水浴2 h，分离上清液并浓缩，加入4倍体积的乙醇，4℃静置12 h，离心收集沉淀物；

步骤4：将步骤3获得的沉淀物用去离子水溶解，采用Sevag法除蛋白，除尽蛋白后，流水透析24h，去离子水透析48h，冷冻干燥后获得榆黄菇粗多糖；

步骤5：将步骤4获得的榆黄菇粗多糖进行醇沉，醇沉所用乙醇的浓度为30-40vt%，获得榆黄菇多糖初步纯化品，去离子水复溶后用DEAE-Sephorase F.F凝胶柱分离，进行梯度洗脱，水洗部分经高效液相检测收集合并相同组分的多糖，真空冷冻干燥得到榆黄菇多糖PCP。

2.根据权利要求1所述的天然免疫增强多糖PCP，其特征在于：

步骤3中，水浴的温度为80-90℃。

3.一种权利要求1或2所述的天然免疫增强多糖PCP的用途，其特征在于：

所述多糖PCP在制备天然免疫增强剂中的应用，可用于医药保健领域。

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