CN107595937B - 一种具有拮抗炎性肠病的乌药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有拮抗炎性肠病的乌药组合物及其应用，该乌药组合物由乌药提取物和铁皮石斛多糖混合而成，乌药提取物占乌药组合物的质量百分比为1％～99％；所述乌药提取物的制备方法如下：将乌药饮片加入到体积浓度为50‑90％乙醇中，加热回流提取、浓缩而得；所述铁皮石斛多糖的制备方法如下：将铁皮石斛加入到乙醇中，经水提、醇沉而得。该组合物具有改善肠炎模型大鼠体重减轻，显著减轻结肠充血水肿、肠壁扩大及黏膜溃疡损伤，降低肠指数和单位长度肠重，调节肠道免疫紊乱，抑制肠道炎症介质表达，减轻肠道炎症反应，改善结肠组织病理改变、维持肠道形态等作用，可用于制备防治炎性肠病的药品。

Description

一种具有拮抗炎性肠病的乌药组合物及其应用

技术领域

本发明涉及中药药品技术领域，具体地说，涉及一种由乌药提取物及石斛多糖组成的、具有显著拮抗炎性肠病的中药组合及其在制备预防、改善和治疗炎性肠病的药物方面的应用。

背景技术

炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克劳恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC），是一种累及回肠、直肠和结肠粘膜的慢性非特异性肠道炎症性疾病，该病可导致患者生化质量严重恶化，患者通常需终身服药甚至手术。流行病学研究显示，IBD发病率在世界范围内呈现逐渐增高的趋势，其发病机制尚不明确，易反复发作而治愈难度大，且长期处于慢性炎症状态，易使IBD进展为结直肠癌。目前IBD尚无根治方法，当前的主要治疗目的是抑制肠黏膜炎症，常用药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、抗生素及一些免疫制剂。上述药物能不同程度地改善IBD，但治后易复发，且常需手术治疗，远不能满足临床需求。因此，寻找新的行之有效的治疗方法及治疗药物，仍是当前面临的重要社会问题。鉴于现有皮质类固醇、抗生素等治疗IBD药物所呈现的代谢失调、皮肤不良反应等，近年，补充和替代疗法越来越受到IBD患者的欢迎，中药是其中最具开发潜力的治疗IBD的方法或手段。现有研究表明，云南白药、蟛蜞菊、肠泰胶囊、猪苓、穿心莲、雷公藤等中药及其复方制剂，通过免疫抑制、抗炎、抗氧化等作用，能较好地改善或防治IBD。因此，成分和作用机理相对明确的、能够防治IBD 的中药或组方极具开发应用前景。

IBD具体的发病机制和病因尚不十分清楚，目前已知IBD的发病与环境因素、遗传因素、免疫因素密切相关，其中免疫因素，尤其是胃肠道黏膜的免疫失调（包括肠道屏障破坏、免疫系统紊乱等）被认为是IBD发病的关键因素。已有研究表明，Th1/Th2亚群的免疫调节失衡是IBD 的重要发病机制之一；Th17细胞的分化与IBD的发生发展关系密切，Th17分泌的IL-17A、IL-21、IL-22等细胞因子可促进肠固有层炎症因子的释放；Treg介导的免疫反应异常在IBD中起了重要作用，Treg细胞周期性缺失时，肠道炎性应答会加剧；Toll样受体信号传导途径（TLR/NF-κB）的过度激活是IBD发病的重要原因。另外，由于肠道菌群及其代谢产物能影响Treg细胞的分化发育，因此，通过调节肠道菌群也能从另一角度改善肠道免疫功能，从而防治IBD。由上可知，保持正常的肠道功能，维持肠黏膜屏障完整，调节免疫细胞分泌的炎性因子及其介导的信号传导通路，能有效缓解及治疗IBD。

乌药为樟科植物乌药Lindera aggregate ( Sims) Kosterm.的干燥块根，主产浙江天台，为临床常用理气中药，具有调气健脾，行气止痛，疏肝解郁等功效和良好的调节胃肠道功能作用。现代药理研究表明，乌药能促进胃液、肠液等消化液分泌，对小肠推进和胃排空具有双向调节作用；能缓解胃肠痉挛，显著抑制溃疡形成，对抗乙醇诱发的细胞损伤；对重症胰腺炎小肠黏膜组织损伤有修复作用；此外，乌药对变性杆菌、大肠埃希菌及空肠弯曲菌均具有良好的抑制作用。近年研究表明，乌药提取物能改善酒精介导肠源性内毒素血症，进而起保护酒精性肝损伤的作用。铁皮石斛是临床常用“胃肠药”，具有“厚肠胃”功效。现代研究表明，铁皮石斛具有双向调节肠推进作用，能调节番泻叶加饥饱失常诱导的脾虚便秘小鼠及高脂饮食小鼠肠道菌群失衡；铁皮石斛多糖能改善小鼠肠粘膜形态，调节Peyer’s结合肠系膜淋巴结（MLN）中免疫细胞γ干扰素（INF-γ）、白细胞介素-2（IL-2）的分泌。

发明内容

本发明的目的是针对现有市场缺乏和技术的不足，提供一种具有拮抗炎性肠炎的乌药组合物及其应用。本发明中，乌药组合物包括乌药提取物和铁皮石斛多糖，其中乌药提取物采用醇溶液提取，放冷静置后离心，去沉淀，去除了部分水溶性杂质；铁皮石斛采用水提醇沉，富集了多糖成分，两者组合具有明显的拮抗TNBS诱导的肠炎作用，能调节肠系膜淋巴结T细胞亚群比例，改善肠道免疫紊乱，抑制结肠组织炎症相关蛋白表达，减轻肠道炎症反应，改善炎性肠病结肠组织病理改变，恢复肠道功能；同时改善了中药提取物“粗、大、黑”状况，减少了药物的服用量，易于提高服用者的依从性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种具有防治炎性肠病的乌药组合物，该乌药组合物由乌药提取物和铁皮石斛多糖混合而成，乌药提取物占乌药组合物的质量百分比为1%~99%；

所述乌药提取物的制备方法如下：

将乌药饮片加入到8-12倍饮片体积的乙醇中，乙醇的体积浓度为50-90%，在90-100℃下回流提取2-3次，每次1-1.5h；滤取滤液，静置冷却后，在1500-3500rpm离心5-10min，取上清液，减压回收乙醇，再干燥，得乌药提取物；

所述铁皮石斛多糖的制备方法如下：

将铁皮石斛加入到8-12倍体积的乙醇中，乙醇的体积浓度为85-90%，在85-90℃回流提取2-3次，每次1-1.5h；滤过，取残渣，烘干后加8-12倍体积水回流提取2-3次，每次1-1.5h，合并滤液；减压浓缩至约1/3-1/2体积，加无水乙醇使溶液醇浓度为80-85%，在4℃冰箱放置24-36h，1500-3500rpm离心5-10min，弃上清，取沉淀，用60-80℃热水按1.0-2.0g/ml的比例使沉淀物溶解，重复1-3次上述醇沉过程，离心，取沉淀，再用体积浓度为80-90%的乙醇洗涤2-3次，即得铁皮石斛粗多糖。

进一步的，制备得到的铁皮石斛多糖的纯度为70-85%。

本发明的另一目的是一种上述乌药组合物在制备防治炎性肠病药物中的应用。

进一步的，所述乌药组合物在制备防治炎性肠病药物中的质量含量为1－100％。

本发明的有益效果如下：针对当前炎性肠病日趋增多的发病现状，现有改善或治疗炎性肠病产品的不足及中药特色和优势，本发明提供了一种具有调节肠道免疫，减轻肠道炎症反应，改善肠道组织病理改变的乌药组合物。所述的乌药部位，经醇提、浓缩，去除了部分杂质，富集了乌药醚内酯、乌药醚内酯、乌药醇等成分；铁皮石斛经水提醇沉，富集了多糖部位，两者在保持疗效的同时，减少了药物服用量，有助于提高使用者的依从性。此外，乌药为常用理气药，具有调节胃肠运动，改善肠源性内毒素症等作用；铁皮石斛多糖具有厚肠胃和良好的免疫调节功能，两者联用兼具了恢复胃肠运动、降低炎症反应、改善肠道免疫、减轻肠道组织病理改变等作用，对炎性肠病具有良好防治作用。

药理(动物)研究证实，本发明所提供的乌药组合物，具有明显的降低肠炎模型动物肠指数和单位长度肠重，改善结肠组织病理改变作用。给予该组合物，能有效改善肠炎模型大鼠体重减轻，降低粪便性状指数，降低血清白细胞、中性粒细胞和单核粒细胞数，显著减轻结肠充血水肿、肠壁扩大及黏膜溃疡损伤，降低病理组织评分。进一步作用机制研究发现，该组合物能调节肠系膜淋巴结T细胞亚群比例，增加肠系膜淋巴结T淋巴细胞数，降低Th比例，增加Tc比例，上调FoxP3/Th比值，改善模型大鼠肠道免疫亢进；抑制结肠组织COX2表达，减轻肠道炎症反应。

本发明明确了乌药-铁皮石斛组合物对炎性肠病的作用及可能机制，即该组合物具有明显的拮抗TNBS诱导的肠炎作用，该作用与抑制COX2表达，调节肠系膜淋巴结T细胞Th、Tc及FoxP3亚群比例，改善肠道免疫亢进，减轻肠道炎症反应；其主要成分及含量、作用机制相对明确，能更好的促进靶点明确、具有中药特色的防治炎性肠病中药新药等相关产品的研发，开发应用前景良好。

本发明具有调节肠道免疫、抑制肠道炎症反应的乌药-铁皮石斛组合物，可单用或配伍应用于防治炎性肠病药物等的研制，将会带来很好的社会和经济效益。

附图说明

图1是各组大鼠结肠组织形态图，其中A：正常对照；B：模型对照；C：乌药提取物；D：铁皮石斛粗多糖；E：乌药-铁皮石斛组合物；

图2是各组大鼠结肠组织COX2蛋白表达免疫组化结果图，其中A：正常对照；B：模型对照；C：乌药提取物；D：铁皮石斛粗多糖；E：乌药-铁皮石斛组合物。

具体实施方式

乌药为樟科植物乌药Lindera aggregate ( Sims) Kosterm.的干燥块根，主产浙江天台，为临床常用理气中药，具有调气健脾，行气止痛，疏肝解郁等功效和良好的调节胃肠道功能作用。近年研究发现，乌药能促进胃液、肠液等消化液分泌，对小肠推进和胃排空具有双向调节作用；能缓解胃肠痉挛，显著抑制溃疡形成，对抗乙醇诱发的细胞损伤；对重症胰腺炎小肠黏膜组织损伤有修复作用。铁皮石斛具有厚肠胃，双向调节肠道运动，改善肠粘膜形态，调节肠粘膜免疫活性等作用。

发明人前期研究结果表明，乌药醇提取物-铁皮石斛多糖组合物对2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的肠炎具有良好的拮抗作用，能改善肠炎模型大鼠体重减轻，明显降低粪便性状指数、肠指数和单位长度肠重，改善结肠组织病理改变。该作用与抑制肠道免疫活性亢进和肠道炎症相关蛋白表达，减轻肠道炎症反应有关。

实施例1：

本发明提供的具有防治炎性肠病的乌药组合物，该乌药组合物由乌药提取物和铁皮石斛多糖混合而成，乌药提取物占乌药组合物的质量百分比为1%~99%；

所述乌药提取物的制备方法如下：将乌药饮片加入到8倍饮片体积的乙醇中，乙醇的体积浓度为50%，在90℃下回流提取2次，每次1h；滤取滤液，静置冷却后，在1500rpm离心5min，取上清液，减压回收乙醇，再干燥，得乌药提取物；

所述铁皮石斛多糖的制备方法如下：将铁皮石斛加入到8倍体积的乙醇中，乙醇的体积浓度为85%，在85℃回流提取2次，每次1h；滤过，取残渣，烘干后加8倍体积水回流提取2次，每次1h，合并滤液；减压浓缩至约1/2体积，加无水乙醇使溶液醇浓度为80%，在4℃冰箱放置24h，1500rpm离心5min，弃上清，取沉淀，用60℃热水按1.0g/ml的比例使沉淀物溶解，重复1次上述醇沉过程，离心，取沉淀，再用体积浓度为80%的乙醇洗涤2次，即得铁皮石斛粗多糖。

实施例2：

本发明提供的具有防治炎性肠病的乌药组合物，该乌药组合物由乌药提取物和铁皮石斛多糖混合而成，乌药提取物占乌药组合物的质量百分比为1%~99%；

所述乌药提取物的制备方法如下：将乌药饮片加入到12倍饮片体积的乙醇中，乙醇的体积浓度为90%，在100℃下回流提取3次，每次1.5h；滤取滤液，静置冷却后，在3500rpm离心10min，取上清液，减压回收乙醇，再干燥，得乌药提取物；

所述铁皮石斛多糖的制备方法如下：将铁皮石斛加入到12倍体积的乙醇中，乙醇的体积浓度为90%，在90℃回流提取3次，每次1.5h；滤过，取残渣，烘干后加12倍体积水回流提取3次，每次1.5h，合并滤液；减压浓缩至约1/3体积，加无水乙醇使溶液醇浓度为85%，在4℃冰箱放置36h， 3500rpm离心10min，弃上清，取沉淀，用80℃热水按2.0g/ml的比例使沉淀物溶解，重复3次上述醇沉过程，离心，取沉淀，再用体积浓度为90%的乙醇洗涤3次，即得铁皮石斛粗多糖；

对实施例1和实施例2制备得到的乌药提取物进行HPLC分析，乌药提取物中含异乌药醚内酯（0.9-1.2%），乌药醚内酯（0.06-0.49 %），乌药醇（0.22-0.51 %）等成分；制备得到的铁皮石斛多糖的纯度为70-85%。

区别于传统水提取，上述组合物去除了乌药的部分水溶性杂质，富集了铁皮石斛多糖成分，提高了活性成分的含量，从而更好地起到拮抗炎性肠病的目的；且减少了服用量，可增加使用者的依从性。

本发明更进一步的明确了乌药-石斛组合物抗肠炎作用与调节肠系膜淋巴结T细胞亚群，改善肠道免疫，抑制肠道炎症相关COX2蛋白表达，减轻肠道炎症反应有关。区别于目前报道有治疗炎性肠病的单味中药或中药复方主要成分不清或作用机制不明的不足，该组合物主要成分及含量相对明确，能更好的促进靶点明确、具有中药特色的抗炎性肠病中药新药等相关产品的开发，前景良好。

本发明更进一步地提供一种将具有调节肠道免疫，拮抗炎性肠病的乌药-石斛组合物在各种防治结肠炎药品的剂型上的应用，如颗粒剂、片剂、胶囊剂，适用范围广，适用性强。

下面通过以下实施例对本发明作进一步说明，它将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例3： 不同浓度醇溶液对乌药提取物中乌药醚内酯等成分提取率的影响研究

1、实验材料

1.1、色谱条件：色谱仪：Agilent 1200 HPLC仪，色谱柱：Ultimate-XB-C₁₈（5μm4.6*250 nm），检测波长：235nm，柱温：30℃，流速：1 ml/min，流动相：超纯水（A）-乙腈（C），梯度洗脱：0min，56% C，44%A；50min，56%C，44%A；55min，95%C，5%A；60min，95%C，5%A。

1.2、对照品：异乌药内酯（Lot：160710）、乌药醚内酯（Lot：160421）、乌药醇（Lot：160510）购自北京北纳创联生物技术研究院；

1.3、不同乌药提取物制备：取乌药饮片适量，分别加10倍量水、体积浓度为30%、50%、70%、90%乙醇在90℃回流提取2次，每次1h；滤取滤液，静置冷却后，在3500rpm离心10min，取上清液，减压回收乙醇，再干燥，得乌药提取物。

2、方法与结果

2.1、线性关系：分别取上述三个对照品适量，置25ml棕色具塞容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得异乌药醚内酯浓度为0.030mg/ml，乌药醚内酯浓度为0.040mg/ml，乌药醇浓度为0.033mg/ml的混合对照品溶液。取混合对照品溶液，分别进样3、5、7、9、11、13、15 μl，测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标X，峰面积（Area）为纵坐标Y绘制标准曲线，得异乌药内酯标准曲线为Y=981.9X-3.0571，R²=1；乌药醚内酯标准曲线为Y=1053.5X-4.2125，R²=1；乌药醇标准曲线为Y=659.36X-5.8875，R²=1。

2.2、各乌药提取物中异乌药醚内酯等含量测定：取各乌药提取物约1 g，置100 ml棕色具塞容量瓶中，加甲醇溶解并定容，进样前过0.45μm滤膜，进样10μl，测定峰面积，计算各提取物中异乌药醚内酯等含量。结果表明，在乙醇体积浓度在0%~90%范围内，随着醇浓度的增加，提取物中异乌药醚内酯、乌药醚内酯及乌药醇的含量逐渐增加，以70%乙醇浓度提取物中三者的成分为最高（见表1-1）。

表1-1. 不同醇浓度乌药提取物中异乌药醚内酯等含量测定

实施例4： 铁皮石斛粗多糖提取物中多糖含量测定

1、实验材料

1.1、试剂：对照品：D-无水葡萄糖对照品，甘露糖；硫酸、苯酚、PMP、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，超纯水，乙腈为色谱纯。各试剂实验所需相应浓度溶液均为临用前配置。

1.2、主要仪器：Lambda 45紫外分光光度仪，恒温水浴锅。

1.3、取铁皮石斛，加10倍量体积的体积浓度为85%的乙醇，85℃回流提取2次，每次1小时；滤过，取残渣，烘干后加12倍体积的水回流提取3次，每次1小时，合并滤液；减压浓缩至约1/3体积，加无水乙醇使溶液醇浓度为80%，4℃冰箱放置24h，3500rpm离心10min，弃上清，取沉淀，用60℃热水按1.0g/ml的比例使沉淀物溶解，重复上述醇沉过程，离心，取沉淀，用体积浓度为80%乙醇洗涤2次，即得铁皮石斛粗多糖。

2、方法与结果

2.1、多糖含量测定

2.1.1、对照品溶液的制备 取D-葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含42μg的溶液，即得。

2.1.2、标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml，分别置10ml具塞试管中，各加水补至2.0ml，精密加入5％苯酚溶液1ml(临用配制)，摇匀，再精密加硫酸5ml，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，置冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在490nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线：Y=60.82X+0.059，R²=0.999。

2.1.3、样品中多糖含量测定 取铁皮石斛粗多糖约20mg，精密称定，加l纯水超声使溶解并定量至100ml，从中精密量取供试品溶液2ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入5％苯酚溶液1ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算，得多糖含量为81.1%、75.8%、73.4%。

实施例5：对2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的肠炎的作用研究

1、实验材料

1.1、动物 雄性SD大鼠，购自浙江省医学科学院实验动物中心。

1.2、药物与试剂 乌药由天台山乌药有限公司提供；将实施例3和实施例4制备得到的乌药提取物和铁皮石斛多糖按质量比1:1进行混合，用纯水配置成相应浓度药液，备用。

造模药：2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），批号：SLBK1620V，Sigma公司。造模溶液配制（现配现用）：取TNBS原液（50mg/ml）40ml与等体积无水乙醇混匀得TNBS50%乙醇溶液（TNBS浓度为25mg/ml）。

1.3、仪器 ITACHI 7100生化仪；BPH-9082酶标仪；BD Calibur流式细胞仪；病理全套设备（德国Leica）

2、实验方法

2.1、分组与给药 SD大鼠适应性喂养3天后，称重，按体重随机分为：正常对照组、模型对照组、乌药提取物组、铁皮石斛多糖组、乌药-铁皮石斛组合物组。SD大鼠禁食不禁水24h后，采用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg剂量）麻醉，TNBS造模组给予TNBS 50%乙醇溶液灌肠，将一直径2 mm的橡胶管充分润滑后由肛门轻缓插入深约8 cm，按90 mg/kg剂量推入TNBS配置溶液（25 mg/ml、0.36 ml/100g），完毕后缓慢拔出塑料胶管，用手捏住肛门，提起大鼠尾部，持续倒置1 min，使造模剂充分渗入大鼠肠腔内。正常对照组给予等体积生理盐水灌肠。TNBS造模后1天开始给药，连续给药21天，正常对照组及模型组给予相应剂量纯水。

2.2指标检测

2.2.1一般观察 观察并记录各组大鼠的一般情况、生存状况、体重、摄食量、粪便形状，并检测粪便隐血情况。粪便性状按正常（暗褐色，硬呈椭球形）记0分，松软记2分，稀溏或血记4分进行评分。

2.2.2组织大体观察及病理学检查 剖解时肉眼大体观察结肠外观形态变化（如色泽、水肿、肠壁扩大粘连、溃疡糜烂等），按未见明显异常（0分）、充血水肿（1分）、肠壁扩大（2分）、溃疡粘连（3分）进行评分；取病变部位组织置于10%甲醛中，石蜡包埋后切片，苏木素-伊红（HE）染色，显微镜下进行组织学观察；按未见明显损伤（0分）、炎性浸润血管增生（1分）、黏膜细胞坏死（2分）、溃疡（3分）进行评分；免疫组化DAB染色法观察结肠组织COX2蛋白表达。

2.2.3结肠长度、重量及结肠指数测定 处死前称大鼠体重，处死后取结肠，沿肠系膜剪开肠腔，用冰生理盐水冲洗干净，用滤纸将结肠吸干，测量总长度并称重量，计算单位长度重量及结肠指数。

2.2.4 流式细胞仪检测肠系膜淋巴结T细胞亚群 取大鼠，沿腹部中线解剖，暴露小肠，于肠系膜深部夹取淋巴结，放入预冷的PBS溶液中，研磨，200目滤网过滤后，1000 r /min离心后，重悬，计数，吸取100μL细胞悬液，大鼠血清封闭，加入相应抗体，流式细胞仪检测。

2.3、统计学方法 计量资料数据以

± s表示，两组间比较采用t-test，模型组及 各给药组间比较采用单因素方差分析多重比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1、一般观察 正常对照组大鼠活跃，毛发光泽，食欲良好，大小便正常，粪便质地较硬，暗褐色，呈椭球形。正常给药组在整个试验阶段均与正常对照组类似，未见不良反应。模型对照组大鼠于造模后第二天即出现自主活动少，喜贴边扎堆，倦怠懒动，反应迟缓，食欲减退，肛周污秽，粪便质地为黏液脓血便或稀便，与正常鼠粪便差别明显，造模第3天粪便性状指数显著增加（p＜0.01），2周后逐渐恢复。与模型组比，各受试物均能有效降低粪便性状指数，其中乌药-铁皮石斛多糖组合物组在给药第2周粪便性状指数显著降低（p＜0.05）。（见表3-1）

表3-1. 各组大鼠粪便性状指数（

± s）

注：与正常对照组比较，^△ p＜0.05，^△△ p＜0.01；与模型对照组比较，^* p＜0.05。

3.2、对体重的影响与正常对照组比较，正常给药组大鼠体重在整个实验期间未见异常，模型对照组体重在TNBS溶液灌肠6天后明显减轻（p＜0.05）；乌药提取物、铁皮石斛粗多糖及两者组合物能有效增加模型大鼠体重，改善TNBS诱导的肠炎模型大鼠体重减轻症状。（见表3-2）。

表3-2. 各组大鼠各时间点体重表（

± s）

注：与正常对照组比，^△ p＜0.05。下同。

3.3、对模型大鼠结肠长度、重量及肠指数的影响 与正常对照组比较，TNBS溶液灌肠造模后，模型对照组大鼠结肠长度明显缩短（p＜0.05），单位长度重量明显增加（p＜0.05），结肠重量及结肠指数均显著增加（p＜0.05）。与模型对照组比较，各受试药物能有效增加结肠长度，降低单位长度重量及结肠系数，作用以组合物组较为明显；提示该组合物能有效改善肠炎模型动物结肠组织病理改变（见表3-3）。

表3-3. 各组肠道长度、重量及指数（

± s）

3.4、肠道组织大体观及组织病理学检查 正常对照组大鼠结肠黏膜大体观呈淡红色，光滑、完整，模型对照组大鼠的结肠肠壁增厚，结肠标本表现为充血水肿、溃疡形成、结肠组织黏连，部分肠壁扩大，黏膜溃疡损伤明显（见附图1），组织病理评分显著升高。组织病理切片HE染色后光镜下观察可见：正常对照组大鼠结肠黏膜腺体结构清晰，排列有序，未见病变异常。模型对照组大鼠结肠黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，腺体破坏，黏膜糜烂、溃疡，溃疡面大，数量多；与模型对照组比较，给予乌药提取物、铁皮石斛多糖及两者组合物干预，能有效改善结肠充血水肿、肠壁扩大及黏膜溃疡损伤，降低结肠组织病理评分，提示该组合物具有拮抗TNBS诱导的肠道组织病变的作用（见表3-4）。免疫组化结果显示，模型大鼠结肠组织炎症相关蛋白COX2表达明显增加，各受试药物能有效抑制肠炎模型大鼠结肠COX2表达，抑制炎症反应（见附图2）。

表3-4. 各组大鼠肠道组织大体观及病理组织评分

注：与正常对照组比，^△△ p＜0.01。下同。

3.5、对模型大鼠血液学指标的影响 与正常组比，模型大鼠白细胞计数，中性粒细胞、单核粒细胞及网织红细胞总数和比例显著增加（p＜0.05，p＜0.01），红细胞计数、血红蛋白显著降低（p＜0.05），提示模型动物体内存在炎症反应；与模型组比较，各受试物能有效降低外周血白细胞、中性粒细胞、单核粒细胞和网织红细胞数，其中降白细胞、中性粒细胞和单核粒细胞数的作用以组合物组较为明显（表3-5、6、7），提示该组合物具有一定的抗炎作用。

表3-5. 各组大鼠血液学指标测定结果-1（

± s）

表3-6. 各组大鼠血液学指标测定结果-2（

± s）

表3-7. 各组大鼠血液学指标测定结果-5（

± s）

3.6、对模型大鼠肠系膜淋巴结T细胞亚型的影响 与正常组比较，模型大鼠肠系膜淋巴结T淋巴细胞（CD3⁺）明显减少（p＜0.05），辅助性T细胞亚群(Th，CD4⁺)比例增加，细胞毒性T细胞亚型(Tc，CD8⁺)比例减少，调节性T细胞（FoxP3）与辅助性T细胞亚群比值降低，提示模型大鼠存在过度免疫激活状态。与模型组比较，铁皮石斛多糖及组合物能增加肠系膜淋巴结T淋巴细胞数，降低Th比例，增加Tc比例，上调FoxP3/Th比值，改善模型大鼠肠道免疫亢进状态。（见表3-8）

表3-8.各组大鼠外周血T细胞亚型测定结果（

± s）

注：与正常对照组比，^△ p＜0.05；与模型对照组比，*p＜0.05。

上述结果表明，乌药提取物、铁皮石斛多糖及两者组合物具有明显的拮抗TNBS诱导的肠炎作用，其中以组合物组的作用较为显著；其抗肠炎作用与抑制COX2表达，调节肠系膜淋巴结T细胞亚群，改善肠道免疫亢进，减轻肠道炎症反应有关。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域中的普通技术人员来说，在不脱离本发明核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种乌药组合物在制备治疗炎性肠病的药物中的应用，其特征在于，该乌药组合物由乌药提取物和铁皮石斛多糖混合而成，乌药提取物和铁皮石斛多糖的质量比为1：1；

所述乌药提取物的制备方法如下：

将乌药饮片加入到8-12倍饮片体积的乙醇中，乙醇的体积浓度为50-90％，在90-100℃下回流提取2-3次，每次1-1.5h；滤取滤液，静置冷却后，在1500-3500rpm离心5-10min，取上清液，减压回收乙醇，再干燥，得乌药提取物；

所述铁皮石斛多糖的制备方法如下：

将铁皮石斛加入到8-12倍体积的乙醇中，乙醇的体积浓度为85-90％，在85-90℃回流提取2-3次，每次1-1.5h；滤过，取残渣，烘干后加8-12倍体积水回流提取2-3次，每次1-1.5h，合并滤液；减压浓缩至1/3-1/2体积，加无水乙醇使溶液醇浓度为80-85％，在4℃冰箱放置24-36h，1500-3500rpm离心5-10min，弃上清，取沉淀，用60-80℃热水按1.0-2.0g/ml的比例使沉淀物溶解，重复1-3次上述醇沉过程，离心，取沉淀，再用体积浓度为80-90％的乙醇洗涤2-3次，即得铁皮石斛粗多糖。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，制备得到的铁皮石斛多糖的纯度为70-85％。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乌药组合物在制备治疗炎性肠病的药物中的质量含量为1-100％。

Images