CN104352772A - 黄精菊冲剂在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由中药材黄精和菊花提取物组合制备而成的黄精菊冲剂治疗溃疡性结肠炎的药物用途。黄精菊冲剂是由中药材黄精经热水煎煮、多步醇沉，壳聚糖絮凝、冻干、粉碎等方法制备得黄精提取物，与菊花水煎提取物，按照重量比4∶1比例组合制备而成。本发明所得到的药物可用于治疗溃疡性结肠炎等医药用途，动物体内实验结果表明，黄精菊冲剂可增加血红蛋白含量，调节机体免疫功能平衡，降低体内过氧化水平，降低炎症因子IL-1及IL-6含量，从而有效地治疗溃疡性结肠炎。

Description

黄精菊冲剂在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种由中药材黄精和菊花的提取物组合而成复方药物作为治疗溃疡性结肠炎的药物用途。

背景技术

溃疡性结肠炎(UC)属于慢性非特异性炎症性疾病之一，该病的病变主要在结肠粘膜，病程较长，容易反复发作，临床上对该病的诊治较为困难，已经被WHO列入现代难治病的行列。腹泻、腹痛、粘液脓血便等症状为其主要的临床表现。该疾的病因及病理机制目前尚不十分明确，可能因为多种因素相互作用所诱发；免疫异常、遗传易感性及肠道微生物作用等成为溃疡性结肠炎的主要致病因素[1]，各种生化介质，包括各种细胞因子、生长因子、黏附分子等，在这一异常的免疫反应中都发挥着极其重要的作用。目前关于溃疡性结肠炎发病机制研究的聚焦点是针对那些参与溃疡性结肠炎的免疫反应和炎症过程的细胞因子和炎疗介质进行的研究[2]。溃疡性结肠炎在我国的发病呈现持续上升趋势，并且流行病学的资料也显示国内外的UC发病率都呈现出逐年上升的趋势[6，7]，其发病率在我国更是有迅速上升的趋势[8]。目前使用的一些药物对溃疡性结肠炎治疗尚缺乏特异性，以西医治疗主要有水杨酸类、激素类、免疫抑制剂、抗生素、生物制剂等为主的内科综合、营养支持疗法以及外科手术等，这些治疗并不能影响其自然病程，不同程度的副作用也是它们使用受到限制。在对溃疡性结肠炎的治疗方面，西医治疗直肠炎的最终方法莫过于手术，对患者的身体，精力，造成相当大的痛苦。相比较而言，传统医药及其相关制剂治疗较为有效，不仅能够缓解溃疡性结肠炎的临床症状，并且能有效防止疾病的复发。本发明的有益效果是：对于溃疡性结肠炎具有疗效好、疗程短、副作用小、使用方便等优点。

黄精为百合科多年生草本植物，来源于黄精属(Polygonatum)植物黄精(P.sibiricum Del.ex Red.)、滇黄精(P.kingianum Coll.et Hemsl.)和多花黄精(P.cyrtonema Hua)物的干燥根茎，为常用补益中药，是传统常用药食同源中药，汉朝的《神农本草经》、明朝的《本草纲目》和清朝的《青阳县志》均有其药膳食补功效的记载[9]。黄精作为一种传统的中药，具有宽中益气、益肾填精、滋阴润肺、生津补脾等功效[10]。现代研究表明黄精具有广泛的药理作用，主治肺燥干咳、体虚乏力、心悸气短、久病津亏口干、糖尿病、高血压等症状，其对抗衰老、降血糖、降血脂防动脉硬化、肿瘤、调节免疫、抗病毒等有一定作用[3、4]，还含有黄精皂苷、烟酸、糖类、醌类和氨基酸等，。现代临床研究报道，菊花煎剂可通过灌肠方式在临床上应用后，有效抑制患者血小板膜糖蛋白异常表达，表明其用于治疗溃疡性结肠炎具有较好疗效[11，12]。

黄精、菊花为具有悠久历史的药食同源药物，目前黄精的研究主要集中在黄精多糖、黄精皂苷的功能和作用方面，菊花在胃肠道疾病中应用也就是集中在外用灌肠给药上。黄精、菊花提取物组合口服用药的研究尚未见报道，尤其是在治疗溃疡性结肠炎症疾病中更是一片空白，所以，本研究发明制备的黄精菊冲剂在治疗溃疡性结肠炎上有着重要的现实意义。

【参考文献】

1.Abraham C，Cho JH.Inflammatory bowel disease[J].New Engl J Med，2009，361：2066-2078；

2.师永盛，霍丽娟，安丽婷.溃疡性结肠炎患者结肠黏膜COX-2和TNF-α的表达及意义[J].山西医科大学学报，2011，42(4)：327-329.

3.Gupta RB，Harpaz N，Itzkowitz S，et al.Histologic inflammation is a risk factor for progression to colorectalneoplasia in ulcerative colitis：a cohort study[J].Gastroenterology，2007，133：1099-1105；

4.Judge T A，Lewis JD，Lichtenstein GR.Colonic dysplasia and cancer in inflammatory boweldisease[J].Gastrointest Endosc Clin N Am，2002，12(3)：495-523.

5.Viscido A，Bagnardi V，Sturniolo G C，et al.Survival and causes of death in Italian patients with ulcerativecolitis.A GISC nationwide study[J].Dig Liver Dis，2001，33(8)：686-692

6.Jiang XL，Cui HF.An analysis or 10218 ulcerative colitis cases in China[J].World JGestroenterol，2002，8：158-161.

7.Smyth CM，Picha SB，Rathore O，et al.Increasing rates and changing patterns of hospital adminssions forpatients with inflammatory bowel disease in Ireland：1996-2001[J].Ir J Med Sci，2005，174：28-32.

8.Yun J，Xu CT，Pan BR.Epidemiology and gene markers of ulcerative colitis in Chinese[J].World JGastroenterol，2009，15：788-803.

9.张洁，马百平，杨云，孙国珍.黄精属植物甾体皂苷类成分及药理活性研究进展[J].中国药学杂志，2006，41(5)：330-332.

10.陈晔，孙晓生.黄精的药理研究进展.中药新药与临床药理，2010，21(3)：328-330.

11.赵立群，刘同亭.菊花煎保留灌肠治疗溃疡性结肠炎的疗效观察，现代中西医结合杂志，2005，14(12)：1587

12.刘同亭，赵立群，孙自勤，王要军.菊花煎灌肠对溃疡性结肠炎血小板膜糖蛋白的影响，中国中医基础医学杂志，2000，6(2)44-46)，

发明目的

本项发明的目的在于发现黄精、菊花提取物组合而成的黄精菊冲剂可用于治疗溃疡性结肠炎病症的医药新用途。

技术方案

黄精菊冲剂在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

所述的黄精菊提取物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于所述的黄精提取物中总多糖含量为30.1-36.7％，总皂苷含量为15.23-20.09％，菊花总黄酮含量为69.87-70.32％；组合物黄精菊冲剂中中按重量比计，黄精提取物与菊花提取物的重量比例为4∶1。

其中所述的黄精菊冲剂由如下方法制得：黄精药材干燥根茎，粉碎，过40目筛，在80℃，以30倍于生药体积的水浸提2-3次，每次3h，过滤，合并提取液，反渗透膜浓缩至5倍，真空冷冻干燥得黄精提取物。菊花干燥花，留取花序部分，在90℃，以12-15倍于生药提交的水热浸1h，过滤，澄清后，浓缩干燥得菊花花序提取物，总黄酮含量为6.97-7.32％；将黄精提取物与菊花提取物按照4∶1比例组合成黄精菊冲剂。

具体来说：

本项发明是经过研究证明多花黄精药材干燥根茎、粉碎、过筛，经水提醇沉，壳聚糖絮凝法、真空冻干后制备得黄精提取物，与菊花的花序水煎剂冻干粉，以4∶1比例制备得中药复方黄精菊冲剂，通过观察各空白、模型、药物不同剂量组模型小鼠的疾病活动指数、HE染色后结肠组织病理切片分析、检测各组小鼠结肠组织中氧化水平及炎症因子含量变化，结果表明该药物在200-400mg/kg量范围内该可改善葡聚糖硫酸钠(DSS，分子量5000)诱导的小鼠溃疡性结肠炎。即：本发明中制备的黄精菊冲剂可改善DSS诱导的小鼠结肠炎症程度，降低模型小鼠体内氧化水平和炎症因子含量，显示对黄精菊冲剂可用于治疗溃疡性结肠炎疾病的新医药用途。

有益效果

1、溃疡性结肠炎是一种以溃疡形成和慢性炎症为主要病理特点的消化道疾病，病变多累及直肠和乙状结肠，可遍及整个结肠，为阶段性和弥漫性分布。临床上表现为腹泻、腹痛及血便等。目前尚无明确治疗药物。本发明设计的黄精和菊花是常见的药食两用中药材。中医认为黄精可提高免疫能力，菊花可清热解毒，目前，没有任何研究报道黄精提取物可用于溃疡性结肠炎的相关治疗，仅见临床研究报道菊花煎剂灌肠用于治疗溃疡性结肠炎，本发明人通过体内实验证明黄精提取物和菊花提取物组合而成的中药复方黄精菊冲剂可显著改善葡聚糖钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎。本发明的黄精菊冲剂具有较好的稳定性，可以用于制备治疗相应疾病的药物。

2、本发明中除测定黄精提取物的总皂苷含量(15.23-20.09％)之外，同时测定总多糖(30.1-36.7％)含量，以及菊花提取物中总黄酮(69.87-70.32％)含量。本发明中的黄精菊冲剂是个复杂体系，体内结果证明黄精菊冲剂整体入药有效，尚不能确定活性成分及辅助成分类型。具体来说本发明的实验结果表明，在实施例1中所制备的黄精菊冲剂高剂量(400mg/kg)给药组中，HE染色病理切片显示给药组结肠炎症程度明显改善，给药组NO、IL-1和IL-6含量明显低于模型组，结肠组织中反映氧化水平的MDA含量明显低于模型组(P＜0.01)，反映胶原沉积的HYP的含量均明显低于模型组，说明黄精菊冲剂对溃疡性结肠炎部有一定的保护作用，提示黄精菊冲剂具有减轻氧自由基损伤，抑制炎症因子生成、保护结肠组织的作用。实施例1制备的黄精菊冲剂呈剂量依赖性改善溃疡性小鼠结肠的炎症程度。体外实验结果也证实了黄精菊冲剂抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW.7的TNF-α因子释放，显示一定抗炎作用的药物用途。因此说明，本发明保护范围内黄精菊冲剂对溃疡性结肠有一定的保护作用，不在本发明保护范围效果不佳。

3、本发明涉及实验材料来自原植物，原植物分别范围广，成本低，提取物活性明确，具有广泛的实用价值。

附图说明

1.图1不同剂量的黄精菊冲剂对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重及结肠长度的影响。(与空白组相比，^##p＜0.01；与模型组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01；阳性对照药物：柳氮磺胺吡啶。)

2.图2不同剂量黄精菊冲剂对造模第8天各组模型小鼠的血红蛋白含量、NO、MDA、IL-1β及IL-6含量的影响。(与空白组相比，^##p＜0.01；与模型组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01；阳性对照药物：柳氮磺胺吡啶。)

3.图3不同剂量黄精菊冲剂对LPS诱导小鼠RAW264.7细胞TNF-α释放量的的影响。(与空白组相比，^##p＜0.01；与模型组相比，^*p＜0.05，阳性对照药物：吲哚美欣。)

具体实施方式

实施例1

一、黄精提取物的制备和质量标准考察

黄精为百合科黄精属多花黄精Polygonum cyrtonema Hua.的干燥根茎，购于陕西西发。黄精干燥地下根茎，粉碎，过40目筛。在80℃，以30倍于生药体积的水浸提2-3次，每次3h，过滤，合并提取液，然后，在50℃下，按照3％比例加入壳聚糖进行絮凝沉淀，澄清1小时处理，在4200rpm/min下离心10min分离得澄清溶液，真空冷冻干燥得黄精冻干粉，用于制备黄精菊冲剂的原料。

1、黄精提取物的总皂苷含量测定：

①标准溶液、样品溶液的制备：称取干燥至恒重所得人参皂苷Rg1对照品1.06mg，甲醇定容于10ml量瓶，作为标准溶液。精密称取黄精冻干粉5.11mg，甲醇溶，定容于25ml量瓶，混匀，作为样品液。

②标准曲线的绘制：分别取人参皂苷Rb1对照品溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，置于10ml具塞试管中水浴挥干，加0.2ml的5％香草醛/冰醋酸和0.8ml高氯酸溶液，于60℃水浴加热15nih，冷却后加5ml冰醋酸，以溶液浓度C为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线，得A＝0.9814C+0.0627(R²＝0.9995)，在0.2748-1.374mg/mL范围内，与吸收度呈良好的线性关系。依同法制备空白对照。于波长550nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

③样品中总皂苷含量测定：吸取样品液1mL，按标准曲线制备步骤操作，测定吸收度。计算黄精总皂苷含量为15.23-20.09％。

2、黄精提取物的总多糖含量测定：

为了排除样品溶液中单糖的干扰并简化操作步骤，采用苯酚-硫酸法与3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定黄精提取物中多糖含量。

2.1.溶液的配制

葡萄糖标准溶液的配制精密称取烘干至恒重的葡萄糖适量，用蒸馏水溶解并定容，分别配制的1mg/ml和0.08mg/ml的葡萄糖标准溶液。

精密称取无杂质的黄精药材粉末各1g，加入10ml石油醚(60-90℃)热回流脱脂30min，回收石油醚，挥干溶剂加入蒸馏水100ml，热回流提取2h，取上清液，过滤，精密吸取1ml作为DNS法测定用的还原糖供试品溶液。另取上清液1ml，加入蒸馏水定容至50ml，精密吸取1ml作苯酚-硫酸法测定用总糖供试品溶液。精密称取2.5g苯酚，用蒸馏水溶解并定容于50ml容量瓶中制备苯酚溶液的配制。取0.65g 3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶于适量蒸馏水中，再加入32.5ml的2mol/l的NaOH溶液，再加入4.5g丙三醇，用蒸馏水定容于100ml制备DNS溶液。

2.标准曲线的制作

分别精密吸取1mg/ml葡萄糖标准品溶液各0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8ml，加入蒸馏水至4ml，再分别精确加入5ml的DNS溶液，混匀后置沸水浴中煮沸5min，冷却至室温，定容至10ml，以空白管为对照，在540nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线Y＝5.765x+0.0311(R²＝0.9993)，在0.2～1.8mg范围呈线性范围，用于DNS法测定还原糖。

精密量取84μg/ml的葡萄糖标准品溶液各0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml于6只10ml量瓶中，分别加入水定容至2ml，再分别精密加入1ml的5％苯酚溶液和7ml的浓硫酸溶液，摇匀，水浴加热20min，冷却至室温，以空白管为对照，在490nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线Y＝0.0059x-0.0015(R2＝0.9995)，0～168μg范围呈线性范围，用于苯酚-硫酸法测定总糖。联合3，5-二硝基水杨酸法和苯酚-浓硫酸法，通过紫外分光光度法分别测定黄精原药材中还原糖和总糖的含最，多糖含量＝总糖含量(％)-还原糖含量(％)。计算得黄精提取物中多糖含量为30.1-36.7％。

二、菊花提取物的制备及其含量测定

1、菊花煎剂的制备

取菊花，只摘取花序部分，去除绿色花托部分。用10倍量水煎浸泡10min，加热煎煮1小时，药渣加水生药体积的8倍量，煎煮30min，合并水煎液。浓缩，冻干，制备得菊花煎粉末。

2、菊花煎剂中总黄酮的含量测定

2.1对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，甲醇溶解，溶于100ml量瓶中，配制成每1ml中含有芦丁0.2mg的对照品溶液。

2.2标准曲线的绘制：吸取上述对照品溶液0，1，2，3，4，5，6ml，分别置于25ml量瓶中，各加水至6ml，分别加入5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀放置5min。再分别加入1％硝酸铝溶液1ml。摇匀，放置5分钟，分别加入4％氢氧化钠10ml，再加水至刻度。放置15min，在500nm处测定吸收度A值，得回归方程：y＝0.125x-0.00431(r＝o，9986)。

2.3样品溶液的制备

取药材1g，用10倍量水煎浸泡10min，加热煎煮1小时，药渣加水生药体积的8倍量，煎煮30min，合并水煎液。定容于200ml量瓶中，放冷，加水至刻度，取10ml于50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，再取5ml，定容于25ml量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，照标准曲线方法，在500nm下测定吸光度值A。测定，计算得总黄酮含量为6.97-7.32％.

三、黄精菊冲剂的制备

将制备得到的黄精冻干粉、菊花煎剂粉末，，按照4∶1比例组合成黄精菊冲剂，在-20℃冷藏保存备用。

实施例2

黄精菊冲剂对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的作用。

实验用药以蒸馏水稀释配制成黄精菊冲剂高、中及低剂量(400，200和100mg/kg)。进行下述体内药效学研究。对于溃疡性结肠炎研究中常用的动物疾病模型建立方法可以分为免疫学方法，复合法以及化学刺激法３大类造模方式。目前最常用的为利用DSS诱导的溃疡性结肠炎模型。DSS是一种是由蔗糖合成的硫酸盐形式的脂多糖，具有抗止血、抗凝血的作用。作用机制可能为：通对肠道上皮细胞的增生产生抑制作用进而进一步对肠道黏膜屏障功能产生破坏，最终使肠腔内菌群失调，免疫功能发生紊乱。该模型是成功率和重复率高，简单易行。其临床症状、结肠肉眼病变和组织病理学改变均与人类溃疡性结肠炎相似。由于可以反复利用DSS刺激以产生类似人类结肠炎急性期和缓解期的变化，这是研究UC发病机制和药物疗效较理想的模型。

1材料与仪器

BALB/c小鼠，雌性，体重18-22g，由南京市青龙山动物繁殖场提供。NO、MDA等生化试剂盒购于南京建成生物工程研究所。小鼠IL-1，6ELISA试剂盒购于欣博盛生物公司。葡聚糖硫酸钠钠，柳氮磺胺购于江苏平光制药有限责任公司。

2实验方法

利用分子量为5kD，浓度为5％的葡聚糖硫酸钠钠(DSS)饮用10天，诱导BALB/c小鼠得急性溃疡性结肠炎，建立急性溃疡性结肠炎模型。每隔1天更换新鲜的DSS溶液。于造模半个小时后，药物各个剂量组每天予以相应剂量，正常组与DSS模型组分别予以相应体积的蒸馏水，给药方式为灌胃给药，连续给药7天。阳性药物组柳氮磺胺给药组(50mg/kg)，黄精菊冲剂高、中、低剂量组(400、200和100mg/kg)，每组8只。在实验过程中观察和记录包括精神、饮食、活动、排便情况以及体重变化的情况等小鼠的一般情况，记录各组小鼠的每天疾病活动指数(DAI)。在造模后第8天，对各组小鼠进行摘眼球取血，置于1.5ml离心管中，加入抗凝剂EDTA(终浓度3.7umol/mL-5.4umol/mL)，采用氰化高铁血红蛋白法测定血红蛋白含量。迅速剖开各组小鼠腹腔，游离结肠和远端回肠，取出肛门至盲肠末端的整个肠段，观察各组结肠的外观形态改变，记录各组组织损伤(HI)评分，测量肛门至盲肠末端的整个肠段长度，并拍照。在结肠远端炎症反应明显处取长约2cm的结肠组织置于10％中性福尔马林浸泡同定，24h后石蜡包埋，连续切片4μm，HE染色，在光学显微镜下观察了解肠黏膜变化情况。进行评分、记录。余下部分编号，称重，用铝箔包好，立即放入液氮(-196℃)中速冻，转入低温冰箱(-80℃)存放。采用BCA进行结肠组织蛋白定量，测定各组小鼠结肠组织的生化指标MDA、NO、IL-1β和IL-6含量的变化。

各组的结肠病理组织切片，经HE染色，观察。病理分析结果显示：在正常组中，基本上没有出现炎性细胞的浸润；与正常组相比较，模型组表现出大量炎性细胞的浸润和杯状细胞缺失，严重的出现了淋巴滤泡；与模型组相比较，黄精菊冲剂的低剂量组(100mg/kg)中出现的炎性细胞浸润较为严重已侵至粘膜下层，少数可达浆膜层，中、高剂量组(200，100mg/kg)HE染色结果和组织损伤可以看出，炎性细胞浸润等现象逐渐减少。

表1 各组小鼠疾病活动指数(DAI)和组织切片损伤评分(HI)的平均值(n＝8)

结果表明：黄精菊冲剂能够改善DSS所引起的结肠炎性细胞浸润等组织损伤(表1)。药物的高剂量给药显著降低模型的DAI值。模型组粘膜多不完整，多灶性浅表溃疡，大部分腺体被破坏，排列紊乱。大量炎症细胞浸润。阳性药物柳氮磺胺吡啶组合黄精菊冲剂高剂量组的结肠粘膜较为完整，表皮连续，腺体排列较规则，少量炎症细胞浸润。黄精菊冲剂可改善DSS诱导的溃疡性结肠炎症，这可能与药物抗炎、调节免疫平衡有关。

3、黄精菊冲剂对DSS诱导的模型小鼠体重及结肠长度变化的影响

除正常组外，其余各组小鼠随着饮用DSS溶液时间的延长均出现了不同程度的精神萎软，饮食量减少，大便性状发生变化。模型组小鼠出现了明显的血便，严重者同时肛周黏附少量血液。与正常组比较，模型组小鼠体重呈逐渐降低趋势，在第7天体重下降明显(P＜0.001)。与模型组比较，经过给药后体重均有所回升，黄精菊冲剂高剂量组(400mg/kg)组效果最好，在给药结束后体重回升至21.98±0.054(P＜0.001)；黄精菊冲剂低剂量组(100mg/kg)不能显著性改变因DSS诱导小鼠结肠炎所导致的体重的缺失(图1A)。与正常组比较，模型组小鼠的结肠和盲肠的长度显著性缩短(P＜0.01)。给药后结肠缩短现象均出现不了同程度的缓解(P＜0.05，P＜0.01)。结果表明黄精菊冲剂对DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠缩短具有一定的改善作用。(图1B)

4、黄精菊冲剂对模型小鼠血红蛋白含量、MDA、NO、IL-1β及6含量变化的影响

与空白组相比，模型组中小鼠血红蛋白的含量降低，而各生化指标MPO、SOD、MDA、NO及IL-1β，6的表达增加。黄精菊冲剂药物组中，模型组相比，高、中剂量组可显著升高模型小鼠的血红蛋白含量(P＜0.01，P＜0.001)，显著降低IL-1β，6的含量；同时，高剂量组还可显著降低MDA、NO含量，而低剂量组对小鼠血红蛋白含量及各生理指标的变化均无影响(P＞0.05)。结果表明：黄精菊冲剂可改善DSS诱导的模型小鼠的血红蛋白含量降低，炎症因子指标增加等具有一定的改善作用(图2)。

表2 各组小鼠的外周血中的血红蛋白含量

注：与正常组相比，##P＜0.01；与模型组比，**P＜0.01；*P＜0.05

实施例3

黄精菊冲剂对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制作用

将取对数生长期的RAW264.7细胞，配成1×10⁵/ml单细胞悬液，接种于96孔板，每孔200ul。培育4h待细胞贴壁后，除空白对照组和模型对照组外，将上清液换为加药培养基(各化合物100μM、阳性药(地塞米松)10μM)，置37℃，5％CO₂条件下培养20h，再加入MTT(PBS配制为5mg/ml)，各孔20ul，继续培养4h后，弃去上清，吸干残留液体，各孔加入DMSO150ul，使充分溶解后立即在490nm下检测各孔吸光度，取平均值，计算细胞增殖抑制率(％)＝(模型组OD值-样品组OD值)/(模型组OD值-空白组OD值)×100％。结果显示，在100μg/ml浓度下的黄精菊冲剂与RAW264.7细胞共培养，无明显细胞毒性。脂多糖LPS(1μg/mI)诱导下RAW264.7细胞6小时后，以吲哚美欣(indomethacin)为阳性药物，并采用ELISA试剂盒法测定不同浓度黄精菊冲剂对细胞释放TNF-α含量的影响。结果显示，在100μg/ml浓度下的黄精菊冲剂作用24小时，可显著抑制脂多糖诱导的TNF-α的释放(图3)。

四.讨论

溃疡性结肠炎是非特异性溃疡性疾病。近年研究表明，过量的产生ROS是溃疡性结肠炎发病过程中的组织损伤和形成溃疡的关键因素。当机体处于正常状态下，由于机体本身具有一整套完善的抗氧化防御系统，所以其能很好的防御ROS对组织和细胞的损伤，但当机体产生过量的ROS时，ROS可引起一系列损伤，进而使机体处于氧化应激状态，发生脂质过氧化反应，产生MDA等脂质过氧化物，使组织损害加重，产生大量的炎性细胞的浸润。而炎症组织损伤会进一步刺激ROS的产生和活性氧的代谢，至此形成一个正反馈，进而导致抗氧化系统的缺失。DSS诱导急性结肠炎模型的主要特征为结肠的缩短并伴随着水肿，结肠长度的缩短在一定程度上可以作为反映炎症严重程度的一个指标。血红蛋白(haemoglobin，Hb)是存在于血液中所有的血红蛋白衍生物，Hb水平的降低和溃疡性结肠炎疾病活动性评分的增加相关，可以作为反映炎症性肠病疾病活动性的简便而可靠的指标之一。MDA是一种脂质过氧化产物，是氧化应激的标志物。产生自由基过多或对自由基的清除能力降低时会引起生物膜上发生脂质过氧化，促使IL-β、IL-6等大量的炎症因子的产生。

本实验结果表明，在实施例1中所制备的提取物给药组中，HE染色病理切片分析显示给药组高、低剂量组的结肠炎症程度明显改善，黄精菊冲剂高剂量给药组的过氧化指标以及炎症指标((如MDA、NO、IL-1及IL-6)含量明显低于模型组，说明黄精菊冲剂高、中剂量对DSS诱导的溃疡性结肠都有一定的保护作用，提示黄精菊冲剂具有减轻氧自由基损伤，抑制炎症因子释放、保护结肠组织的作用。这可能与黄精的调节机体免疫平衡、菊花的抗炎、抗氧化等功效相关。

Claims (3)

1.黄精菊冲剂在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的黄精菊冲剂在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于按重量比计，黄精提取物与菊花提取物的为4∶1。

3.根据权利要求2所述的黄精菊冲剂在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于所述的黄精菊冲剂由如下方法制得：黄精药材干燥根茎，粉碎，过40目筛，在80℃，以30倍于生药体积的水浸提2-3次，每次3h，过滤，合并提取液，反渗透膜浓缩5倍，真空冷冻干燥得黄精提取物，总多糖含量为30.1～36.7％，总皂苷的含量为15.23～20.09％。菊花干燥花，留取花序部分，在90℃，以12～15倍于生药体积的热水浸提1h，过滤，澄清后，浓缩干燥得菊花花序提取物，总黄酮的含量为6.97-7.32％。将黄精提取物与菊花提取物按照重量比4∶1比例组合成黄精菊冲剂。