CN113952432A

CN113952432A - 三仁汤在制备治疗脂肪性肝病药物中的应用

Info

Publication number: CN113952432A
Application number: CN202111506197.2A
Authority: CN
Inventors: 彭景华; 胡义扬; 刘伟; 尹艺晓; 方怡; 唐浩; 王君
Original assignee: Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Current assignee: Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2022-01-21

Abstract

本发明涉及三仁汤在制备治疗脂肪性肝病药物中的应用，所述三仁汤由以下重量份配比的原料药组成：杏仁6‑24份、滑石9‑36份、通草3‑12份、白豆蔻3‑12份、竹叶3‑12份、厚朴3‑12份、生薏苡仁9‑36份、半夏5‑20份。三仁汤宣畅气机，清利湿热，应用于治疗高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠，能够显著减少小鼠肝细胞脂肪变性、气球样变和炎症细胞浸润，降低肝脏内TG含量；还能够降低小鼠血清ALT活性，改善小鼠肝功能，改善小鼠胰岛素抵抗。本发明对已知中药组合物三仁汤发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

Description

三仁汤在制备治疗脂肪性肝病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药用途技术领域，具体地说，涉及三仁汤在制备治疗脂肪性肝病药物中的应用。

背景技术

脂肪肝(fatty liver)是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。脂肪性肝病正严重威胁国人的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，发病率在不断升高，且发病年龄日趋年轻化。正常人肝组织中含有少量的脂肪，如甘油三酯(Triglyceride，TG)、磷脂、糖脂和胆固醇等，其重量约为肝重量的3％-5％，如果肝内脂肪蓄积太多，当肝内脂质含量超过肝脏湿重的5％，或肝组织切片光镜下每单位面积见1/3以上肝细胞有脂滴存在时，称为脂肪肝。其临床表现轻者无症状，重者病情凶猛。一般而言，脂肪肝属可逆性疾病，早期诊断并及时治疗常可恢复正常。

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(simplefatty liver，SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，NAFLD现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人NAFLD患病率10％-30％，其中10％-20％为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25％。

NAFLD除可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外，还可影响其他慢性肝病的进展，并参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响NAFLD患者生活质量和预期寿命的重要因素。为此，NAFLD是当代医学领域的新挑战，近期内NAFLD对人类健康的危害仍将不断增加。

三仁汤，中医方剂名。为祛湿剂，具有宣畅气机，清利湿热之功效。主治湿温初起及暑温夹湿之湿重于热证。头痛恶寒，身重疼痛，肢体倦怠，面色淡黄，胸闷不饥，午后身热，苔白不渴，脉弦细而濡。临床常用于治疗肠伤寒、胃肠炎、肾盂肾炎、布氏杆菌病、肾小球肾炎以及关节炎等证属湿重于热者。

文献：时吉萍,强时茸.三仁汤临症新用体会[J].中医药通报,2011,10(03):27-28.公开了一例使用三仁汤加减方治疗脂肪肝的病例，所述的三仁汤加减方由以下原料药组成：杏仁10克、蔻仁10克、苡仁20克、制半夏10克、厚朴10克、柴胡10克、枳壳10克、茵陈30克、五味子10克，六剂后加用川楝子10克，配合舒肝丸服用，有效改善患者症状。中国专利文献CN109745344A公开了一种以心脾相关理论治疗心力衰竭的方法，五脏中，心主血脉，心之气阴、气阳不足，则气血凝滞，血脉不通，心脾功能失调是心衰之病理产物"痰"与"瘀"产生的重要因素。心衰后期，水饮内停，阳虚水肿，则见水肿以下肢为甚，尿少，心悸，神疲，舌淡胖，苔白，脉沉细或虚数，甚则气促咳唾，胸胁胀痛，肋间饱满，形成悬饮。调理脾胃以治疗心衰可分为五法：健运中气法，以香砂六君子汤、桂枝汤、丹参饮合方化裁；调脾养血法，以归脾汤为主；醒脾化湿法，以三仁汤、藿朴夏苓汤、茯苓杏仁甘草汤加减；健脾涤痰法，以温胆汤、小陷胸汤加减；温阳理中法，以附子理中汤加味。但是关于本发明三仁汤在制备治疗脂肪性肝病药物中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供三仁汤在制备治疗脂肪性肝病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，提供了三仁汤在制备治疗脂肪性肝病药物中的应用。

优选地，所述的三仁汤由以下重量份配比的原料药组成：杏仁6-24份、滑石9-36份、通草3-12份、白豆蔻3-12份、竹叶3-12份、厚朴3-12份、生薏苡仁9-36份、半夏5-20份。

更优选地，所述的三仁汤由以下重量份配比的原料药组成：杏仁9-18份、滑石13.5-27份、通草4.5-9份、白豆蔻4.5-9份、竹叶4.5-9份、厚朴4.5-9份、生薏苡仁13.5-27份、半夏7.5-15份。

更优选地，所述的三仁汤由以下重量份配比的原料药组成：杏仁12份、滑石18份、通草6份、白豆蔻6份、竹叶6份、厚朴6份、生薏苡仁18份、半夏10份。

优选地，所述的脂肪性肝病为非酒精性脂肪性肝病。

在本发明的另一方面，提供了以上任一所述三仁汤的制备方法，所述三仁汤的制备方法包括以下步骤：按重量份配比称取原料药，粉碎、混匀，得到药物混合物，加入药材质量8倍的水，没过药材表面，浸泡30分钟，煎煮1.5小时，煎煮的药液经无纺布过滤，收集滤液；再次向所剩药渣加入药材质量8倍的水，煎煮1.5小时，药液经无纺布过滤，收集滤液，合并两次滤液浓缩即得。

在本发明的另一方面，提供一种治疗非酒精性脂肪性肝病的药物组合物，所述的药物组合物以三仁汤原料药的提取物为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

如上任一所述药物组合物的剂型为外用剂型或内用剂型。

优选地，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、巴布剂、喷雾剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

本发明优点在于：

1、三仁汤出自《温病条辨》，功用：宣畅气机，清利湿热，主治：湿温初起及暑温夹湿。方中以杏仁宣利上焦肺气，盖肺主一身之气，气化则湿亦化；白豆蔻芳香化湿，行气宽中，畅中焦之脾气；薏苡仁甘淡性寒，利湿清热而健脾，可以疏导下焦，使湿热从小便而去。三仁合用，三焦分消，是为君药。配伍滑石之甘淡性寒，通草、竹叶甘寒淡渗，加强清利湿热之力，是为臣药。半夏、厚朴辛苦性温，行气化湿，散结除痞，既助行气化湿之功，又使寒凉而不碍湿，是为佐药。诸药相合，宣上畅中渗下，使湿热之邪从三焦分消。

2、三仁汤应用于治疗高脂饮食诱导的NAFLD小鼠，能够有效降低NAFLD小鼠肝组织的NAS评分，小鼠肝细胞脂肪变性、气球样变和炎症细胞浸润明显减少，改善了小鼠肝细胞形态病变。三仁汤应用于治疗高脂饮食诱导的NAFLD小鼠，能够降低肝脏内TG含量；还能够降低小鼠血清ALT活性，改善小鼠肝功能，改善小鼠胰岛素抵抗。

3、本发明对已知中药组合物三仁汤发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

附图说明

图1.三仁汤、三仁汤高剂量及奥贝胆酸对照药对高脂饮食诱导的小鼠NAFLD的作用。NAS，NAFLD activity score；ALT，alanine aminotransferase；HOMA-IR，homeostaticmodel assessment for insulin resistance。(*P＜0.05，**P＜0.01。)

图2.三仁汤、三仁汤低剂量及Saroglitazar对照药对高脂饮食诱导的小鼠NAFLD的作用。NAS，NAFLD activity score；ALT，alanine aminotransferase；HOMA-IR，homeostatic model assessment for insulin resistance。(*P＜0.05，**P＜0.01。)

图3.三仁汤各提取部位对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝组织病理的作用。肝组织HE染色，200倍放大，NAS，NAFLD activity score。(*P＜0.05，**P＜0.01。)

图4.三仁汤各提取部位对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝组织油红染色和TG含量的作用。肝组织油红O染色，200倍放大。(*P＜0.05，**P＜0.01。)

图5.三仁汤各提取部位对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠胰岛素抵抗的作用。HOMA-IR，homeostatic model assessment for insulin resistance。(*P＜0.05，**P＜0.01。)

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1本发明中药组合物的制备(一)

按重量份配比称取杏仁12份、滑石18份、通草6份、白豆蔻6份、竹叶6份、厚朴6份、生薏苡仁18份、半夏10份。

实施例2本发明中药组合物的制备(二)

按重量份配比称取杏仁6份、滑石9份、通草3份、白豆蔻3份、竹叶3份、厚朴3份、生薏苡仁9份、半夏5份。

实施例3本发明中药组合物的制备(三)

按重量份配比称取杏仁24份、滑石36份、通草12份、白豆蔻12份、竹叶12份、厚朴12份、生薏苡仁36份、半夏20份。

实施例4本发明中药组合物的制备(四)

按重量份配比称取杏仁9份、滑石13.5份、通草4.5份、白豆蔻4.5份、竹叶4.5份、厚朴4.5份、生薏苡仁13.5份、半夏7.5份。

实施例5本发明中药组合物的制备(五)

按重量份配比称取杏仁18份、滑石27份、通草9份、白豆蔻9份、竹叶9份、厚朴9份、生薏苡仁27份、半夏15份。

实施例6本发明中药组合物的制备(六)

按重量份配比称取杏仁15份、滑石22.5份、通草7.5份、白豆蔻7.5份、竹叶7.5份、厚朴7.5份、生薏苡仁22.5份、半夏12.5份。

实施例7本发明中药组合物的制备(七)

按重量份配比称取杏仁21份、滑石31.5份、通草10.5份、白豆蔻10.5份、竹叶10.5份、厚朴10.5份、生薏苡仁31.5份、半夏17.5份。

实施例8本发明中药组合物的制备(八)

按重量份配比称取杏仁18.6份、滑石27.9份、通草9.3份、白豆蔻9.3份、竹叶9.3份、厚朴9.3份、生薏苡仁27.9份、半夏15.5份。

实施例9本发明中药组合物的制备(九)

按重量份配比称取杏仁6.6份、滑石9.9份、通草3.3份、白豆蔻3.3份、竹叶3.3份、厚朴3.3份、生薏苡仁9.9份、半夏5.5份。

实施例10本发明中药组合物的制备(十)

按重量份配比称取杏仁10.2份、滑石15.3份、通草5.1份、白豆蔻5.1份、竹叶5.1份、厚朴5.1份、生薏苡仁15.3份、半夏8.5份。

实施例11本发明中药组合物水煎剂的制备(十一)

按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，混匀，加入药材质量8倍的水，没过药材表面，浸泡30分钟，煎煮1.5小时。煎煮的药液经无纺布过滤，收集滤液。再次向所剩药渣加入药材质量8倍的水，煎煮1.5小时，药液经无纺布过滤，收集滤液，合并两次滤液浓缩即得水煎剂。

实施例12本发明中药组合物颗粒剂的制备(十二)

按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1的清膏。清膏加入乙醇，静置24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.2的稠膏。稠膏进行喷雾干燥，得干膏细粉。将干膏细粉加入糊精，混合均匀，按常规方法制粒，干燥，制成颗粒剂。

实施例13本发明中药组合物片剂的制备(十三)

按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1的清膏。清膏进行喷雾干燥，得到干膏细粉。将干膏细粉与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合均匀，按常规方法制粒，干燥，加入硬脂酸镁、二氧化硅，混匀，按常规方法压片，制成分散片。

实施例14本发明中药组合物胶囊剂的制备(十四)

按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.15的清膏。清膏进行喷雾干燥，得到干膏细粉。加入硬脂酸镁、滑石粉，混匀，按常规方法加入空心胶囊，制成胶囊剂。

实施例15本发明中药组合物滴丸剂的制备(十五)

按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.18的清膏。清膏进行喷雾干燥，得到细粉。加入适量水或/和黄酒，制成水丸剂。或加入适量乙醇和大豆油制成软材，软材用微丸制丸机制丸，干燥，过筛，制成微丸。或以聚乙二醇为基质、二甲基硅油为冷凝液，滴制成丸，制成滴丸剂。

实施例16本发明中药组合物口服液的制备(十六)

按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1的清膏。清膏加入乙醇，静置24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.2的稠膏。按常规方法取甜菊糖溶解于纯水中，加入苯甲酸钠、纯化水，与稠膏混合均匀，制成口服液。

实施例17三仁汤治疗高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病(一)

1材料与方法

1.1实验小鼠

高脂饲料(60％热量来源于脂肪，货号D12492i，Research Diets公司)饲养16周诱导小鼠NAFLD模型，对照组给对照饲料(10％热量来源于脂肪，货号D12450B，ResearchDiets公司)。

2实验方法

2.1分组与给药

2.1.1三仁汤与三仁汤高剂量的分组与给药方法

雄性C57BL/6J小鼠，7周龄，随机分为正常组(n＝10)、模型组(n＝10)、三仁汤组(n＝10)、三仁汤高剂量组(n＝10)、奥贝胆酸组(n＝10)。对照组予对照饲料，其余各组小鼠均予高脂饲料。

对照组予对照饲料，其余各组小鼠均予高脂饲料。至第12周末，三仁汤组灌胃三仁汤制剂(10ml/kg鼠重，含生药1.09g/ml)，三仁汤高剂量组灌胃三仁汤高剂量制剂(10ml/kg鼠重，含生药2.18g/ml)，奥贝胆酸组灌胃奥贝胆酸(10ml/kg鼠重，0.5mg/ml)，其余各组灌胃等量灭菌饮用水，至16周末取材。

2.1.2三仁汤与三仁汤低剂量的分组与给药方法

雄性C57BL/6J小鼠，7周龄，随机分为正常组(n＝9)、模型组(n＝10)、三仁汤组(n＝9)、三仁汤低剂量组(n＝9)、Saroglitazar对照药组(n＝9)。对照组予对照饲料，其余各组小鼠均予高脂饲料。至第12周末，三仁汤组灌胃三仁汤制剂(10ml/kg鼠重，含生药1.09g/ml)，三仁汤低剂量组灌胃三仁汤低剂量制剂(10ml/kg鼠重，含生药0.55g/ml)，Saroglitazar对照药组灌胃Saroglitazar(3mg/kg鼠重)，其余各组灌胃等量灭菌饮用水，至16周末取材。

2.1.3三仁汤制剂的制备

三仁汤高剂量制剂，即按成人给药量：称取杏仁24份、滑石36份、通草12份、白豆蔻12份、竹叶12份、厚朴12份、生薏苡仁36份和半夏20份，加入药材质量8倍的水，没过药材表面，浸泡30分钟，煎煮1.5小时。煎煮的药液经无纺布过滤，收集滤液。再次向所剩药渣加入药材质量8倍的水，煎煮1.5小时，药液经无纺布过滤，收集滤液。合并两次滤液，浓缩定容至所需体积，得到三仁汤高剂量制剂(含生药2.18g/ml)。

三仁汤制剂，即按成人给药量：称取杏仁12份、滑石18份、通草6份、白豆蔻6份、竹叶6份、厚朴6份、生薏苡仁18份和半夏10份(采用普通高等教育中医类规划教材《方剂学》，上海科学技术出版社，1995年6月第1版，ISBN 7-5323-3708-1/R·1033(课)中“三仁汤”所记述的药物配比)，加入药材质量8倍的水，没过药材表面，浸泡30分钟，煎煮1.5小时。煎煮的药液经无纺布过滤，收集滤液。再次向所剩药渣加入药材质量8倍的水，煎煮1.5小时，药液经无纺布过滤，收集滤液。合并两次滤液，浓缩定容至所需体积，得到三仁汤制剂(含生药1.09g/ml)。

三仁汤低剂量制剂，即按成人给药量：称取杏仁6份、滑石9份、通草3份、白豆蔻3份、竹叶3份、厚朴3份、生薏苡仁9份和半夏5份，加入药材质量8倍的水，没过药材表面，浸泡30分钟，煎煮1.5小时。煎煮的药液经无纺布过滤，收集滤液。再次向所剩药渣加入药材质量8倍的水，煎煮1.5小时，药液经无纺布过滤，收集滤液。合并两次滤液，浓缩定容至所需体积，得到三仁汤低剂量制剂(含生药0.55g/ml)。

2.2检测方法

2.2.1肝组织苏木精-伊红染色(haematoxylin and eosin，HE)染色

使用苏木素-伊红染色试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：C0105)染色。肝组织石蜡切片(4μm)在70℃烤片机(德国LEICA公司，型号：HI1220)上烤40分钟，按以下顺序脱蜡：二甲苯，10分钟；二甲苯，10分钟；无水乙醇，5分钟；无水乙醇，2分钟；95％乙醇，2分钟；85％乙醇，2分钟；70％乙醇，2分钟；自来水，洗3次；双蒸水，洗3次。然后，按以下顺序染色：苏木精染液，15分钟；自来水，洗3次；双蒸水，洗3次；盐酸酒精，3秒；自来水，洗3次；双蒸水，洗3次；伊红，10秒，95％乙醇，1分钟；95％乙醇，1分钟；无水乙醇，1分钟；无水乙醇，1分钟；二甲苯，1分钟；二甲苯，1分钟。中性树脂封片剂(国药集团化学试剂有限公司，货号：E675007-00100)封片。所有病理片经数字化摄片机(德国LEICA，型号：SCN400)扫描并存档。

2.2.2肝组织病理评分系统

根据中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组的推荐意见，采用NASH活动度积分(NASH activity score，NAS)系统(表1)评分，NAS＜3分可排除NASH，NAS＞4分则可诊断为NASH，介于两者之间者为有NASH可能。规定肝脂肪变性＞33％但不伴有小叶内炎症、气球样变和纤维化者为非酒精性单纯性脂肪肝，脂肪变性达不到此程度者仅称为肝细胞脂肪变。

表1NAS评分标准

2.2.3肝组织油红O染色

肝组织冰冻切片(8μm)使用油红O染色试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：D027)染色，具体为：油红O储备液与稀释液按5:2的比例配好用滤纸慢速过滤2遍为油红O应用液。将冰冻切片从-20℃拿出室温回温10分钟，依次按以下步骤：双蒸水，洗1次；60％异丙醇，20-30秒；油红O应用液，15分钟；60％异丙醇洗1次；37℃双蒸水，10秒；复染液，5min；双蒸水，60秒。中性树脂封片，显微镜下观察拍照。

2.2.4血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)测定

ALT测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：C009-2-1)检测，按说明书操作。

2.2.5肝组织TG含量测定

称取50mg肝组织，加入无水乙醇和丙酮混合液(1:1)匀浆，肝组织匀浆液4℃静置过夜，次日离心15分钟(4℃，3000rpm)，取上清液用于测定TG含量。TG检测生化试剂盒(浙江东瓯诊断产品有限公司，货号：A0-10017)检测，按说明书操作。

3结果

3.1三仁汤显著改善高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝组织病理，与三仁汤高剂量和对照药无显著差异

肝组织HE染色后，镜下观察到正常对照组小鼠肝细胞形态正常，肝小叶结构清晰，肝索排列整齐。模型组小鼠肝细胞出现不同程度的肿胀，胞质内出现巨大脂肪空泡肝细胞核被挤到边缘，伴有肝细胞气球样变，部分汇管区和小叶内可见炎细胞浸润。三仁汤及高剂量三仁汤干预后，小鼠肝细胞脂肪变性、气球样变明显减轻，炎症细胞浸润减少。奥贝胆酸对照药组小鼠的肝细胞脂肪变性、气球样变也明显减轻，炎症细胞少见，见图1。

肝组织病理NAS评分显示，模型组小鼠肝组织脂肪变、小叶内炎症及肝细胞气球样变评分及NAS总分均较正常对照组明显升高，三仁汤、三仁汤高剂量及奥贝胆酸组小鼠的肝组织脂肪变、小叶内炎症及肝细胞气球样变评分及NAS总分均较模型组显著降低，见图1，表2。各药物组NAS评分无明显差异。

表2三仁汤、三仁汤高剂量及奥贝胆酸对NAFLD小鼠肝组织NAS评分的影响

注：数据以中位数(四分位间距)表示，与正常组比较，*P＜0.05；与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与模型组比较，##P＜0.01。

3.2三仁汤显著改善高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏脂质沉积，与三仁汤高剂量和对照药无显著差异

肝组织油红O染色显示，正常对照组小鼠肝细胞内少见油红O染料，模型组小鼠肝细胞内可见明显的巨大红色脂滴。三仁汤、三仁汤高剂量和奥贝胆酸干预后，较模型组肝细胞内红色脂滴明显减少，见图1。

肝组织TG含量测定结果也提示模型组小鼠肝组织TG含量较正常对照组明显升高，三仁汤、三仁汤高剂量及奥贝胆酸组小鼠肝组织TG含量较模型组明显降低。其中各药物组之间无明显差异，见图1、表3。

3.3三仁汤明显改善高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝功能与胰岛素抵抗，与三仁汤高剂量无显著性差异

与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清ALT活性明显升高，三仁汤、三仁汤高剂量及奥贝胆酸干预后小鼠血清ALT活性较模型组显著降低。其中各药物组之间无明显差异，见图1、表3。

与正常组小鼠比较，模型组小鼠HOMA-IR明显升高，三仁汤及三仁汤高剂量干预后小鼠胰岛素抵抗指数较模型组降低。奥贝胆酸组小鼠胰岛素抵抗指数与模型组比较无显著差异，见图1、表3。

表3三仁汤、三仁汤高剂量及奥贝胆酸对NAFLD小鼠肝组织TG、ALT及HOMA-IR的作用(均数±标准差)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.4三仁汤显著改善NAFLD小鼠肝组织病理，总体优于三仁汤低剂量、Saroglitazar对照药

肝组织HE染色提示，模型组小鼠肝细胞脂肪变性明显，伴随小叶内炎症细胞浸润及气球样变，三仁汤及三仁汤低剂量干预后，肝脏上述病变显著减轻。Saroglitazar对照药对照药组小鼠的肝细胞可见明显的肝细胞肿大、气球样变，脂肪变性少见，见图2。肝组织病理NAS评分提示，模型组肝脏脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均较正常对照组明显升高。三仁汤组肝组织脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均较模型组显著下降。三仁汤低剂量组肝组织脂肪变评分与模型组无显著性差异，但小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均较模型组显著下降。Saroglitazar组肝组织脂肪变、小叶内炎症评分较模型组显著下降，但肝细胞气球样变评分及NAS总分与模型组无显著性差异。三仁汤组及三仁汤低剂量组肝细胞气球样变评分均较Saroglitazar组更低，见表4。

表4三仁汤、三仁汤低剂量及Saroglitazar对NAFLD小鼠肝组织NAS评分的影响

注：数据以中位数(四分位间距)表示，与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与Saroglitazar组比较，^^P<0.01。

3.5三仁汤显著改善NAFLD小鼠肝脏脂质沉积，与Saroglitazar对照药无显著性差异

肝组织TG含量测定结果提示模型组小鼠肝组织TG含量较正常对照组明显升高，三仁汤及Saroglitazar组小鼠肝组织TG含量较模型组明显降低，三仁汤低剂量组肝组织TG含量较模型组无显著差异。其中三仁汤及Saroglitazar组之间无明显差异，见图2、表5。

肝组织油红O染色显示，正常对照组小鼠肝细胞内少见油红O染料，模型组小鼠肝细胞内可见明显的巨大红色脂滴。三仁汤、三仁汤低剂量和Saroglitazar干预后，较模型组肝细胞内红色脂滴明显减少，见图2。

3.6三仁汤明显改善NAFLD小鼠肝功能与胰岛素抵抗

与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清ALT活性明显升高，三仁汤干预后小鼠血清ALT活性较模型组显著降低，三仁汤低剂量对ALT无显著作用，Saroglitazar对照药组ALT水平显著高于模型组，提示Saroglitazar的肝毒性，见图2、表5。

与正常组小鼠比较，模型组小鼠HOMA-IR明显升高，三仁汤、三仁汤低剂量及Saroglitazar对照药干预后小鼠HOMA-IR指数较模型组降低，其中三仁汤优于三仁汤低剂量，与Saroglitazar对照药无显著性差异，见图2、表5。表5三仁汤、三仁汤低剂量及Saroglitazar对NAFLD小鼠肝组织TG、ALT、HOMA-IR的作用(均数±标准差)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与三仁汤低剂量组比较，^P＜0.05。

实施例18三仁汤制剂各提取部位显著改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病

1材料与方法

1.1三仁汤各有效部分的提取

①提取部位1：在三仁汤制剂(制备方法同实施例17)药液中加入乙醇，边加边搅拌，使乙醇含量达到90％，常温静置两天。第三天将上清液取出，剩余沉淀物即为提取部位1。

②提取部位2：将上述上清液放入真空过滤机过滤，得到过滤液。将过滤液放入旋转蒸发仪回收乙醇。将得到的药液用双蒸水重悬，转移至分液漏斗，再加入2倍体积的石油醚萃取，静置，直至液面出现清晰分层，上层部分为石油醚萃取部位(或脂溶性部位)，下层物质为水溶液部位(或小分子部位)，分别收集下层与上层溶液。其中下层水溶液部位再如上所述进行萃取，反复萃取5次。收集水溶液部位，放于水浴锅蒸发皿中蒸干，得到提取部位2。

③提取部位3：将上述石油醚萃取部位放入旋转蒸发仪回收石油醚，并得到脂溶性混合物，即提取部位3。

1.2实验小鼠

1.3实验分组

雄性C57BL/6J小鼠，7周龄，随机分为正常组(n＝9)、模型组(n＝10)、三仁汤组(n＝9)、三仁汤提取部位1组(n＝9)、三仁汤提取部位2组(n＝9)、三仁汤提取部位3组(n＝9)、Saroglitazar对照药组(n＝9)。

2实验方法

2.1给药方法

正常组予对照饲料，其余各组小鼠均予高脂饲料。至12周末，三仁汤组灌胃三仁汤(10ml/kg鼠重，含生药1.09g/ml)，三仁汤提取部位1组灌胃三仁汤提取部位1(10ml/kg鼠重，含生药1.09g/ml)，三仁汤提取部位2组灌胃三仁汤提取部位2(10ml/kg鼠重，含生药1.09g/ml)，三仁汤提取部位3组灌胃三仁汤提取部位3(10ml/kg鼠重，含生药1.09g/ml)，Saroglitazar对照药组灌胃Saroglitazar(3mg/kg鼠重)，其余各组灌胃等量灭菌饮用水，至16周末取材。

2.2检测方法

2.2.1肝组织HE染色、油红O染色、TG检测

同实施例17。

2.2.2血清葡萄糖测定

Quantich-mTM Glucose AssayKit(BioAssay Systems，货号：DIGL-100)检测，按说明书操作。

2.2.3血清胰岛素测定

Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISAkit(Crystal Chem，货号：90080)检测，按说明书操作。

3结果

3.1三仁汤各提取部位显著改善高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝组织病理

肝组织HE染色结果提示，模型组小鼠肝细胞膨大，细胞质疏松，胞质内可见巨大脂肪空泡肝细胞核被挤到边缘，伴有肝细胞气球样变，部分汇管区和小叶内可见炎细胞浸润。三仁汤及三仁汤各提取部位干预后，小鼠肝组织病理明显改善。Saroglitazar对照药组小鼠的肝细胞虽然脂肪变性较模型组减少，但肝细胞明显肿大，见图3。

肝组织病理NAS评分提示，模型组肝组织脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均较正常对照组显著增高。三仁汤组肝组织脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均较模型组显著下降。提取部位1组、提取部位2组及提取部位3组肝组织脂肪变评分与模型组无显著差异，但小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均较模型组显著下降。Saroglitazar对照药组肝组织脂肪变评分、小叶内炎症评分较模型组显著下降，但肝细胞气球样变评分及NAS总分与模型组无显著差异，见表6。

表6三仁汤、各提取部位、Saroglitazar对NAFLD小鼠肝组织NAS评分的作用

注：数据以中位数(四分位间距)表示，与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与Saroglitazar组比较，^^P＜0.01。

3.2三仁汤各提取部位显著改善高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏脂质沉积

肝组织油红O染色显示，正常对照组小鼠肝细胞内少见油红O染料，模型组小鼠肝细胞内可见明显的巨大红色脂滴。三仁汤、三仁汤各提取部位及Saroglitazar对照药干预后，较模型组肝细胞内红色脂滴明显减少，见图4。

肝组织TG含量测定结果提示模型组小鼠肝组织TG含量较正常对照组明显升高，三仁汤、三仁汤各提取部位及Saroglitazar对照药组小鼠肝组织TG含量较模型组明显降低。其中各药物组之间无明显差异，见图4、表7。

3.3三仁汤各提取部位明显改善高脂饮食诱导的NAFLD小鼠胰岛素抵抗

与正常组小鼠比较，模型组小鼠空腹血糖明显升高，三仁汤、三仁汤提取部位2、三仁汤提取部位3及Saroglitazar干预后小鼠空腹血糖较模型组显著降低，三仁汤提取部位1组与模型组无显著性差异，见图5、表7。

与正常组小鼠比较，模型组小鼠空腹胰岛素明显升高，三仁汤、三仁汤提取部位2、三仁汤提取部位3及Saroglitazar干预后小鼠空腹胰岛素较模型组显著降低，三仁汤提取部位1组与模型组无显著性差异，见图5、表7。

与正常组小鼠比较，模型组小鼠HOMA-IR指数明显升高，三仁汤、三仁汤提取部位2及Saroglitazar干预后小鼠HOMA-IR指数较模型组显著降低。三仁汤提取部位1及三仁汤提取部位2干预后与模型组无显著性差异，见图5、表7。

表7三仁汤、各提取部位、Saroglitazar对NAFLD小鼠肝组织TG、空腹血糖、空腹胰岛素及HOMA-IR的作用(均数±标准差)

实施例19三仁汤治疗高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病(二)

1材料与方法

1.1实验小鼠

1.2分组方法

雄性C57BL/6J小鼠，7周龄，随机分为正常组(n＝10)、模型组(n＝10)、三仁汤组(n＝10)、三仁汤高剂量组(n＝10)、中药对照组(n＝10)。

2实验方法

2.1给药方法

正常组予对照饲料，其余各组小鼠均予高脂饲料。至第12周末，三仁汤组灌胃三仁汤(10ml/kg鼠重，含生药1.09g/ml)，三仁汤高剂量组灌胃三仁汤(10ml/kg鼠重，含生药2.18g/ml)，中药对照组灌胃中药对照制剂(10ml/kg鼠重，3.47g/ml)，其余各组灌胃等量灭菌饮用水，至16周末取材。

2.2制备方法

(一)三仁汤制剂的制备：

(二)中药对照组制剂的制备：

按成人给药量：称取杏仁10份、蔻仁10份、苡仁20份、制半夏10份、厚朴10份、柴胡10份、枳壳10份、茵陈30份、五味子10份、川楝子10份，加入药材质量8倍的水，没过药材表面，浸泡30分钟，煎煮1.5小时。煎煮的药液经无纺布过滤，收集滤液。再次向所剩药渣加入药材质量8倍的水，煎煮1.5小时，药液经无纺布过滤，收集滤液。合并两次滤液，浓缩定容至所需体积，得到中药对照制剂(含生药3.47g/ml)。

2.3肝组织生化指标检测

2.3.1肝组织TG含量测定

2.3.2血清ALT测定

3实验结果

肝组织病理NAS评分显示，模型组小鼠肝组织脂肪变、小叶内炎症及肝细胞气球样变评分及NAS总分均较正常对照组明显升高，差异有显著性(P＜0.01)。三仁汤、三仁汤高剂量及中药对照组小鼠的肝组织脂肪变、小叶内炎症及肝细胞气球样变评分及NAS总分均较模型组降低，其中三仁汤高剂量组NAS总分降低最多，其次是三仁汤组，与模型组相比，差异有显著性(P＜0.01)，见表8。各药物组NAS评分无明显差异。

表8NAFLD小鼠肝组织NAS评分

注：数据以中位数(四分位间距)表示，与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

肝组织TG含量测定结果也提示模型组小鼠肝组织TG含量较正常对照组明显升高，三仁汤和三仁汤高剂量小鼠肝组织TG含量较模型组显著降低(P＜0.01)，中药对照组小鼠肝组织TG含量较模型组有降低趋势，差异无统计学意义，见表9。

与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清ALT活性明显升高，三仁汤、三仁汤高剂量及中药对照干预后小鼠血清ALT活性较模型组降低，其中三仁汤组和三仁汤高剂量组差异有显著性(P＜0.01)。中药对照组较模型组也显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表9。

与正常组小鼠比较，模型组小鼠HOMA-IR指数明显升高，三仁汤及三仁汤高剂量干预后小鼠HOMA-IR指数较模型组降低。中药对照组小鼠胰岛素抵抗指数与模型组比较无显著差异，见表9。

表9NAFLD小鼠肝组织TG、ALT、HOMA-IR(均数±标准差)

三仁汤出自《温病条辨》，功用：宣畅气机，清利湿热，主治：湿温初起及暑温夹湿。方中以杏仁宣利上焦肺气，盖肺主一身之气，气化则湿亦化；白豆蔻芳香化湿，行气宽中，畅中焦之脾气；薏苡仁甘淡性寒，利湿清热而健脾，可以疏导下焦，使湿热从小便而去。三仁合用，三焦分消，是为君药。配伍滑石之甘淡性寒，通草、竹叶甘寒淡渗，加强清利湿热之力，是为臣药。半夏、厚朴辛苦性温，行气化湿，散结除痞，既助行气化湿之功，又使寒凉而不碍湿，是为佐药。诸药相合，宣上畅中渗下，使湿热之邪从三焦分消。

三仁汤应用于治疗高脂饮食诱导的NAFLD小鼠，能够有效降低NAFLD小鼠肝组织的NAS评分，小鼠肝细胞脂肪变性、气球样变和炎症细胞浸润明显减少，改善了小鼠肝组织病理学病变。三仁汤应用于治疗高脂饮食诱导的NAFLD小鼠，能够显著减少小鼠肝脏脂质沉积，降低肝脏TG含量；还能够降低小鼠体内ALT活性，改善小鼠肝功能，降低小鼠胰岛素抵抗指数。本发明对已知中药组合物三仁汤发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.三仁汤在制备治疗脂肪性肝病药物中的应用，其特征在于，所述三仁汤由以下重量份配比的原料药组成：杏仁6-24份、滑石9-36份、通草3-12份、白豆蔻3-12份、竹叶3-12份、厚朴3-12份、生薏苡仁9-36份、半夏5-20份。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述三仁汤由以下重量份配比的原料药组成：杏仁9-18份、滑石13.5-27份、通草4.5-9份、白豆蔻4.5-9份、竹叶4.5-9份、厚朴4.5-9份、生薏苡仁13.5-27份、半夏7.5-15份。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述三仁汤由以下重量份配比的原料药组成：杏仁12份、滑石18份、通草6份、白豆蔻6份、竹叶6份、厚朴6份、生薏苡仁18份、半夏10份。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的脂肪性肝病为非酒精性脂肪性肝病。

5.权利要求1-3任一所述的三仁汤，其特征在于，所述三仁汤的制备方法包括以下步骤：按重量份配比称取原料药，粉碎、混匀，得到药物混合物，加入药材质量8倍的水，没过药材表面，浸泡30分钟，煎煮1.5小时，煎煮的药液经无纺布过滤，收集滤液；再次向所剩药渣加入药材质量8倍的水，煎煮1.5小时，药液经无纺布过滤，收集滤液，合并两次滤液浓缩即得。

6.一种治疗非酒精性脂肪性肝病的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物以三仁汤原料药的提取物为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型为外用剂型或内用剂型。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、巴布剂、喷雾剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。