CN114515302B - 溪黄草提取物作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了溪黄草或其提取物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的用途。本发明通过国内外公认的溃疡性结肠炎动物模型，证实溪黄草提取物能够有效的改善小鼠的结肠病理损伤；降低小鼠血液中促炎因子水平，提高抗炎因子水平；调节Th17/Treg平衡。将溪黄草或其提取物制备成预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物，具有广阔的市场应用前景。

Description

溪黄草提取物作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗溃疡 性结肠炎的药物中的用途
技术领域
本发明涉及溪黄草及其提取物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的用途。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)是一种原因不明的慢性非特异性 炎症性肠病，临床上常用的治疗药物包括柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奥硝唑等。 然而上述药物在防治溃疡性结肠炎或多或少存在的不足。具体如下：(1)柳 氮磺吡啶进入体内后分解为5-氨基水杨酸(5-ASA),以减少自由基产生、干 扰炎性递质合成、调节肠道菌群、维持肠粘膜电解质平衡等达到治疗目的， 但结肠远端药物浓度低、长期应用不良反应严重,故临床多给予短期、配合直 肠给药。(2)美沙拉嗪虽然能较好的治疗溃疡性结肠炎，但不良反应也很明显，如该药物服用过多会致使患者肠胃道感到轻微疼痛，有些患者还会感到 头疼、恶心等症状，严重时还会发生皮疹。(3)奥硝唑对人体尚无毒性，一 方面能有效的避免高浓度药物对肝脏、肠、胃等器官的伤害，一方面又能较 好的恢复血小板凝血功能，对充血、出血的浅表小溃疡、小脓肿起一定抑制 作用，能较好的治疗溃疡性结肠炎。单独使用奥硝唑片极易出现不良反应，如胃部有不适感且恶心、口腔有异味、头晕和四肢麻木等，部分可能会引起过敏反应，如瘙痒、皮疹等。
中药溪黄草来源于唇形科香茶菜属线纹香茶菜Isodon lophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don) H.Hara[Rabdosia lophanthoides(Buch.-Ham ex D．Don) Hara或Plectranthus striatusBenth．或Isodon striatus(Benlh.)Kudo]，具有清热利湿、退黄功效，用于湿热黄疸、湿热泻痢、急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎而有黄疸者。现市场上作“溪黄草”入药的原植物除线纹香茶菜外，还有香茶属植物狭基线纹香茶菜I. lophanthoides var .gerardianus(Bentham) H.Hara，溪黄草I. serra(Maxim.) Kud。研究表明，溪黄草主要含有黄酮类、萜类、酚酸、挥发油和香豆素等成分。现代药理学研究表明，溪黄草具有肝保护、促进胆汁分泌、抗炎抗氧化、抗肿瘤的药理作用。梁均方,线纹香茶菜化学成分的研究[J],嘉应大学学报，1996,1:59~60公开了线纹香茶菜具有治疗肠炎的功效，但是肠炎与溃疡性结肠炎属于两种完全不同的病症，它们的发病原因完全不一样，导致人体所出现的症状表现也并不类似，溃疡性结肠炎相对更为严重，治疗难度更大，例如，从西医的角度，如果是慢性结肠炎，可以使用抗感染药物和皮质类固醇，还要根据患者的具体症状选择相应的药物，比如胃肠解痉药物、促进胃肠蠕动药、缓解便秘的药物；如果是溃疡性结肠炎，患者必须卧床休息，要积极给患者补充液体，维持电解质平衡，要补充蛋白质，改善全身的营养状况。重症患者需要进行手术，要根据患者的情况选择正确的手术方式，比如结直肠全切除手术等。
从中医角度，目前还没有使用溪黄草治疗溃疡性结肠炎的研究报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种溪黄草或其提取物在制备预防和/或 治疗溃疡性结肠炎的药物中的用途。
进一步地，所述提取物为溪黄草水提物，其中咖啡酸含量0.0100～0.0200 mg·g-1，迷迭香酸含量0.3000～0.4000mg·g-1。
进一步地，所述溪黄草为狭基线纹香茶菜I.lophanthoides var.gerardianus(Bentham)H.Hara的干燥全草。
进一步地，所述药物是改善溃疡性结肠病理损伤的药物。
进一步地，所述药物是降低炎症因子水平的药物。
更进一步地，所述炎症因子为MOP和/或IL-17。
进一步地，所述药物是升高抗炎因子水平的药物。
更进一步地，所述抗炎因子为IL4和/或TGF-β1。
进一步地，所述药物是减少肠系膜淋巴结中Th17细胞的药物。
进一步地，所述药物是增加肠系膜淋巴结中Tregs细胞的药物。
进一步地，所述药物是以溪黄草或其提取物为活性成分，加入药学上可 接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
更进一步地，所述制剂为口服制剂或灌肠制剂；所述口服制剂为颗粒剂、 溶液剂、丸剂、膏剂或片剂；所述灌肠制剂为溶液剂或栓剂。
本发明溪黄草或其提取物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的 用途，通过国内外公认的溃疡性结肠炎动物模型，证实溪黄草提取物能够有 效的改善小鼠的结肠病理损伤；降低小鼠血液中促炎因子水平，提高抗炎因 子水平；调节Th17/Treg平衡。将溪黄草或其提取物制备成预防和/或治疗溃 疡性结肠炎的药物，具有广阔的市场应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1小鼠体重变化率
图2小鼠结肠H&E染色切片
图3溪黄草小鼠肠系膜淋巴细胞Th17/Treg的影响
具体实施方式
实施例1溪黄草提取物的制备
取狭基线纹香茶菜，加水煎煮，合并煎液，浓缩为稠膏，即得。
实施例2溪黄草提取物的质量研究
1、仪器与试剂
仪器：DW调温电热套(上海平环燃烧设备工程技术有限公司)；Laborta4011digital旋转蒸发仪(德国Heidolph)；Waters2695高效液相色谱仪，Empower 色谱工作站；KQ-400DE型数控超声波清洗器；Sartorius CP225D型十万分之一天平；SartoriusBT214D型万分之一天平。
试药：按实施例1制备的溪黄草提取物；咖啡酸对照品(批号 110885-2017-3，纯度99.7％)，迷迭香酸对照品(批号111817-201706，纯度 90.5％)均来自中国药品生物制品鉴定所；屈臣氏饮用水；乙腈为色谱纯，其 他化学试剂均为分析纯。
2、溪黄草中迷迭香酸、咖啡酸含量的测定
2.1色谱条件
Agilent Eclipse XBD-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)，流动相乙腈(A) -0.3％磷酸(B)梯度洗脱(0～12min，12％A；12～20min，12％A；20～30，25％A)， 流速1.0mL/min，检测波长为329nm，柱温30℃。
2.2溶液的制备
对照品溶液的配制精密称取咖啡酸、迷迭香酸对照品12.47mg、6.24mg， 分别置50ml、10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀作为对照品储备液；精 密移取咖啡酸和迷迭香酸对照品储备液1.0ml至10ml量瓶中，加甲醇定容， 摇匀即得4.99μg·mL-1、0.1129mg·mL-1的混合对照品溶液。
供试品溶液的配制：取溪黄草提取物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入50％乙醇20mL，称定质量，超声提取30min，放冷再称定质量，用 50％乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得。
2.3系统适用性考察试验
2.3.1线性关系考察精密吸取混合对照品溶液0.5、1、2、5、10、15、20μL 注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下条件测定。以进样量为横坐标(X)、峰面 积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到回归方程分别为Y咖啡酸＝5.0×106X －5670.7(r＝0.9996)、Y迷迭香酸＝3.0×106X－41328(r＝0.9999)，咖啡酸 在0.0025～0.0998μg、迷迭香酸在0.0565～2.2580μg线性关系良好。
2.3.2精密度试验取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下条件平行测定6 次，记录峰面积，得咖啡酸和迷迭香酸的峰面积RSD值分别为1.42％、0.78％。 表明该仪器精密度良好。
2.3.3稳定性试验取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24、 48h各进样，按“2.1”项下条件测得咖啡酸和迷迭香酸峰面积RSD分别为1.42％、 0.78％，表明供试品溶液在48h内稳定性良好。
2.3.4重复性试验取同一批次溪黄草粗粉，照“2.2.2”项方法平行制备6份供 试品溶液，按“2.1”项下条件测定，外标一点法计算两种成分的含量。结果咖 啡酸和迷迭香酸含量的RSD分别为2.32％、1.85％。表明该方法重复性较好。
2.3.5加样回收率试验取已知含量的溪黄草药材粗粉(咖啡酸0.1146mg·g-1； 迷迭香酸3.6263mg·g-1)精密称定6份，各0.5g，分别精密加入混标溶液(咖 啡酸0.0601mg·ml-1；迷迭香酸1.706mg·ml-1)1ml，按2.2.2项下制备供试品 液，外标一点法计算含量，并计算加样回收率。结果见表1
表1溪黄草咖啡酸和迷迭香酸加样回收率结果
Figure SMS_1
Figure SMS_2
2.3.6溪黄草提取物咖啡酸、迷迭香酸含量测定根据既定的测定方法对实 施例1制备的溪黄草提取物中的咖啡酸、迷迭香酸进行测定，结果测得溪黄 草提取物中含有咖啡酸0.0100～0.0200mg·g-1，迷迭香酸0.3000～0.4000 mg·g-1。
实施例3溪黄草提取物对小鼠溃疡性结肠炎的改善效果
1实验方法
1.1动物模型的构建及样本的处理
将72只6-8周龄的雄鼠C57BL/6J(18-20g；SPF-级)在SPF的环境下光照 和黑暗循环适应性饲养一周，保持饮水和饲料充足。然后将小鼠随机分为对 照组(Ctrl组)，模型组(葡聚糖硫酸钠组，DSS组)，阳性对照组(5-氨基 水杨酸，5-ASA组)，和3个浓度的溪黄草治疗组(RL-L，75mg/Kg；RL-M，150mg/Kg，RL-H，300mg/Kg，溪黄草提取物按实施例1制备)，每组小鼠 12只。第1-16天，治疗组小鼠用RL灌胃，同时阳性对照组灌胃5-ASA溶液， 对照组和模型组灌胃等体积的去离子水，每只小鼠的灌胃体积为100μL，每日 给药一次。第7-12天，在给药的同时，对治疗组、模型组及阳性对照用2.8％ 的DSS饮用水喂养6天诱发溃疡性结肠炎。在造模及治疗期间，各组小鼠均 自由饮水饮食。在溃疡性结肠炎诱导和恢复阶段，每天检测各组小鼠的生存 状态，记录体重，进行疾病活动指数(DA1)评分，小鼠的DAI的具体评分 标准见表2。在第6天及第15天收集小鼠粪便。在16天后处死小鼠，收集小 鼠的血液、结肠组织和肠系膜淋巴结。将血液在分别在3000r和12000r离心 5min和10min，收集血清样品用于酶联免疫(Elisa)测定。将结肠组织拍照， 测量结肠长度，用灭菌后的PBS轻轻冲洗肠腔，清楚肠溶物，取部分组织固 定物与4％的多聚甲醛溶液，用于结肠组织染色及免疫组化分析，余下部分与 -80℃保存待用。将肠系膜淋巴结MINs，研磨，制备单细胞悬浮液，用于流式细胞染色及分析。
表2小鼠疾病活动度(DAI)评分标准表
Figure SMS_3
1.2组织染色
使用4％的多聚甲醛固定结肠组织，然后包埋于石蜡中，采用H&E法染 色。用NikonEclipse Ts2R+FL显微镜观察组织染色切片。并对切片结果进行 组织学评分。评分标准如表3所示，组织病理学评分＝上皮细胞评分+炎性渗润评分+粘膜损伤评分。
表3小鼠结肠组织病理学评分标准
Figure SMS_4
1.3血清炎症因子水平测定
采用Elisa试剂盒(NOVUS Biologicals,USA)测定血清中炎症因子MOP， IL-4、INF-γ、IL-17、TGF-β1水平。
1.4流式细胞分析
制备肠系膜淋巴结单细胞悬浮液，采用BD Cytofix/Cytoperm胞内因子染 色试剂盒方法对肠系膜淋巴结中的Th17细胞及Treg细胞进行细胞内外染色、固定、分析。
2实验结果
2.1溪黄草可减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎
为研究溪黄草在溃疡性结肠炎中潜在的治疗价值，采用小鼠模型，将72 只C57BL/6J雄性小鼠随机为对照组(Ctrl组)，模型组(DSS组)，阳性对 照组(5-ASA组)，和3个浓度的溪黄草治疗。结果显示，与Ctrl组小鼠相 比，其他各组在第6天灌胃DSS后，小鼠体重先增加，随后肠炎的发生，体 重逐渐降低(图1)，并表现出了明显的结肠长度缩短(表4)和疾病活动指 数DAI评分升高(表4)。从表4还可见：阳性对照组(5-ASA组)可显著 增加DSS组小鼠的结肠长度，降低DIA评分，3个浓度的溪黄草治疗组均可 增加DSS组小鼠的结肠长度，降低DIA评分；通过HE染色对结肠组织进行 病理评价，如图2所示，DSS组小鼠结肠存在明显的隐窝形态改变、杯状细 胞大量破损或丢失、炎性细胞浸润和严重的粘膜损伤，阳性对照组(5-ASA 组)小鼠结肠隐窝形态改变缓解，杯状细胞结构清晰，组织中炎性细胞浸润 减轻；3个浓度的溪黄草治疗组均可缓解DSS组小鼠结肠隐窝形态改变，保护杯状细胞，降低炎性细胞浸润；由此可见，溪黄草可较为有效的改善小鼠 的结肠病理损伤。
表4小鼠DAI评分、结肠长度及结肠组织病理学评分
Figure SMS_5
注：表中同一列中，与Ctrl组比较：***p<0.001；与DSS组比较：##p<0.01和###p<0.001。
2.2血清中炎症因子水平
研究表明，过渡的炎症因子可导致肠道屏障的破坏/肠道内环境的紊乱及 结肠粘膜损伤。采用Elisa测定血清中炎症因子水平。结果如表5所示。结果 表明，与模型组相比较，溪黄草治疗组小鼠血液中促炎因子如MOP、IL-17 水平显著降低，抗炎因子IL4、TGF-β1水平显著升高。
表5血清中炎症因子水平
Figure SMS_6
注：表中同一列，与Ctrl组比较，**p<0.01；与DSS组比较，#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001。
2.3溪黄草可调节Th17/Treg平衡
研究证明免疫细胞的异常激活会引起炎症因子的过度分泌，因此，采用 流式细胞术检测了模型小鼠肠系膜淋巴结中免疫细胞的变化情况。如图3所 示，与DSS组相比，溪黄草治疗组肠系膜淋巴结中的Th17细胞(CD4+、IL-17+) 的比例明显降低，同时Tregs细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+)的比例明增加， 这说明溪黄草对Th17/Treg平衡具有调节作用。
综上，本发明溪黄草或其提取物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药 物中的用途，通过国内外公认的溃疡性结肠炎动物模型，证实溪黄草提取物 能够有效的改善小鼠的结肠病理损伤；降低小鼠血液中促炎因子水平，提高 抗炎因子水平；调节Th17/Treg平衡。将溪黄草或其提取物制备成预防和/或 治疗溃疡性结肠炎的药物，具有广阔的市场应用前景。

Claims (8)

1.溪黄草提取物作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的用途；
所述提取物为溪黄草水提物，其中咖啡酸含量0.0100 ~ 0.0200 mg·g-1，迷迭香酸含量0.3000 ~ 0.4000 mg·g-1；
所述溪黄草为狭基线纹香茶菜 I. lophanthoides var .gerardianus (Bentham)H.Hara的干燥全草。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物能改善溃疡性结肠病理损伤。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物能降低炎症因子水平；所述炎症因子为MOP和/或IL-17。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物能升高抗炎因子水平；所述抗炎因子为IL4和/或TGF-β1。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物能减少肠系膜淋巴结中Th17细胞。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物能增加肠系膜淋巴结中Tregs细胞。
7.根据权利要求1~6任一项所述的用途，其特征在于，所述药物是以溪黄草提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述制剂为口服制剂或灌肠溶液剂或栓剂；所述口服制剂为颗粒剂、溶液剂、丸剂、膏剂或片剂。
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