CN107383121B

CN107383121B - 3,4-二羟基苯乙醇苷的制备方法及其在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

Info

Publication number: CN107383121B
Application number: CN201710637490.XA
Authority: CN
Inventors: 高宏伟; 杨磊; 李棣华; 吕沅珊
Original assignee: Tianjin Hospital Of Itcwm Nankai Hospital
Current assignee: Tianjin Hospital Of Itcwm Nankai Hospital
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2037-07-31
Also published as: CN107383121A

Abstract

本发明公开了一种3,4‑二羟基苯乙醇苷的制备方法，取大血藤粗粉，以乙醇为溶媒，加热回流提取，滤液减压回收至浸膏；浸膏加水溶解，再加入明胶溶液沉淀，上清液减压浓缩至浸膏；浸膏加水溶解，用大孔吸附树脂柱吸附，再用乙醇洗脱，减压浓缩至糖浆状，残留物烘干，粉碎成细粉；用甲醇超生提取细粉，滤液减压回收至干，残留物再用乙酸乙酯超声提取，滤液减压回收至干，残留物用少量水溶解，于C18反相硅胶柱中，用乙腈水溶液洗脱，收集3,4‑二羟基苯乙醇苷部分洗脱液，减压回收至浸膏，冻干。本发明所述方法工艺简单，利于大规模工业化生产操作、污染少、产品纯度高，制备的3,4‑二羟基苯乙醇苷可用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物，具有广阔应用前景。

Description

3,4-二羟基苯乙醇苷的制备方法及其在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及含有来自植物的药物制剂，具体是一种3,4-二羟基苯乙醇苷的制备方法及其在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），又称特发性溃疡性结肠炎，是一种病因尚不明确的非特异性的炎症性肠疾病。病变范围主要累及乙状结肠、直肠粘膜及粘膜下层，主要临床表现为腹痛、腹泻、脓血便和不明原因的体重减轻。有资料显示，UC的发病率和患病率在我国逐步升高，并且UC患者的生活质量明显下降，癌变的风险明显高于普通人群，所以WHO将其确定为现代难治病之一。溃疡性结肠炎的发病机制较复杂，与免疫功能失调、氧化还原系统失调、遗传因素、感染因素等联合作用有关。目前UC的治疗还是以5-氨基乙酰水杨酸、糖皮质激素及免疫抑制剂等为主，但是这些药物治愈率低、副作用大，单克隆抗体、细胞因子重组蛋白显示出一定的疗效，但费用高昂，很难大规模应用。因此，开发标本兼治、安全有效的药物，尤其是民族药物有着重要的实际价值。

溃疡性结肠炎可分属于不同的中医病名，根据本病的临床表现，属于医学“泄泻”、“痢疾”及“肠辟”等范畴，现代大多数中医学者认为本病发病是内因和外因的共同作用，内因源于肝、脾、肾脏腑功能失调，外因责之于湿邪蕴、气滞血瘀。在治疗上主要通过健脾益气、清热解毒、活性化瘀等辨证治疗溃疡性结肠炎。大血藤为治疗肠痈腹痛之要药,《景岳全书》记载大血藤一两许，以好酒二碗，煎一碗，午前一服，治疗肠痈，有清热解毒、活血，祛风止痛之功效，用于肠痈腹痛，热毒疮疡，经闭，痛经，跌扑肿痛，风湿痹痛等。现代研究表明大血藤所含化学成分主要为鞣质类、木质素类、酚酸类、黄酮类等，其中酚酸类主要成分为3,4-二羟基苯乙醇苷，苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学作用，如连翘脂苷A和红景天苷，开发前景十分广阔。目前从自然界中分离的苯乙醇苷类化合物120多种，多数存在于世界各地的药用植物中，这类化合物结构相似，生物活性强，受到药物工作者的高度重视。已有报道3,4-二羟基苯乙醇苷的苷元羟基酪醇用于治疗溃疡性结肠炎效果显著，但3,4-二羟基苯乙醇苷的生物学活性尚未有相关研究。另外，现有的3,4-二羟基苯乙醇苷提取分离方法主要采用硅胶层析法，但这些提取方法得到的3,4-二羟基苯乙醇苷的含量低，操作过程污染严重，基本无法进行大生产操作。

发明内容

本发明就是为了解决现有的3,4-二羟基苯乙醇苷提取分离方法存在的上述问题，所提出了一种3,4-二羟基苯乙醇苷的制备方法及其在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

本发明采用了如下的技术方案。

一种3,4-二羟基苯乙醇苷的制备方法，包括以下步骤：

a.取大血藤粗粉，以40%-95%乙醇为溶媒，大血藤与溶媒的重量比为1：6-20，加热回流提取1-4次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇至浸膏；浸膏加水溶解至体积为生药重量的0.5-2倍，再加入生药量1-3倍的明胶溶液，滤过，滤液减压浓缩至浸膏；

b.浸膏加水溶解至生药重量的0.5-5倍，用大孔吸附树脂柱进行吸附，以乙醇系统作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至糖浆状，残留物烘干，粉碎成细粉；

c. 用甲醇超声提取步骤b中获得的细粉，过滤，滤液减压回收溶剂至干，残留物再用乙酸乙酯超声提取，过滤，滤液减压回收溶剂至干，最后残留物用少量水溶解，加于C18反相硅胶柱中，用5%-85%乙腈水溶液进行洗脱，收集3,4-二羟基苯乙醇苷部分洗脱液，合并，减压回收溶剂至浸膏，冻干，得白色粉末。

所述大孔吸附树脂的型号为HPD100、HPD300、HPD5000、D101。

步骤b中所述乙醇系统为10%乙醇水溶液。

步骤c中对C18反相硅胶柱进行分离洗脱的溶剂为8%乙腈水溶液。

一种3,4-二羟基苯乙醇苷在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途。

所述3,4-二羟基苯乙醇苷的给药剂量为1mg/kg·d-20mg/kg·d。

本发明获得了如下有益效果。

本发明所述的3,4-二羟基苯乙醇苷的制备方法工艺简单，利于大规模工业化生产操作、污染少、产品纯度高。而且使用本发明所述方法提取的3,4-二羟基苯乙醇苷是从传统中药大血藤中获得的天然中药单体，其对人体毒副作用低，可以显著提高患者的用药安全性和用药依从性，其通过调控抗炎和抗氧化信号通路抵抗溃疡性结肠炎，可用于制备防治溃疡性结肠炎的药物，进而大幅度改善溃疡性结肠炎患者的治疗效果和生活质量，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷的HPLC色谱图；

图2是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对小鼠的临床症状效果统计图；

图3是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎结肠长度的影响图；

图4是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎结肠组织病理学结构的影响图；

图5是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中MPO含量的影响图；

图6是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中 MDA 含量的影响图；

图7是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中SOD 活力与 GSH-PX活力的影响图；

图8是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中炎症因子(TNF-α,IL-1β,和 IL-6)表达的影响图；

图9是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中NF-κB活性的影响图；

图10是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子(TNF-α, IL-1β,和 IL-6)表达的影响图；

图11是本发明3,4-二羟基苯乙醇苷对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NF-κB活性的影响图。

具体实施方式

以下参照附图及实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1：3,4-二羟基苯乙醇苷的制备

取大血藤粗粉10kg，以45%乙醇为溶媒，大血藤与溶媒的重量比为1：6.5，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇至浸膏；浸膏加水溶解至体积为生药重量的2倍，再加入生药量3倍的明胶溶液沉淀，滤过，滤液减压浓缩至浸膏；浸膏加水溶解至生药重量的2.5倍，加于已处理好的HPD300大孔吸附树脂柱上，流速2BV/h，上样完成后以10%乙醇5000ml为洗脱剂，流速2BV/h进行洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至浸膏，残留物烘干，粉碎成细粉；细粉用甲醇超声提取，过滤，滤液减压回收溶剂至干，残留物再用乙酸乙酯超声提取，过滤，滤液减压回收溶剂至干，最后残留物用少量水溶解，加于已处理好的C18反相硅胶柱中，用8%乙腈水溶液进行洗脱，收集3,4-二羟基苯乙醇苷部分洗脱液合并，减压回收溶剂至浸膏，冻干，得3,4-二羟基苯乙醇苷9g，经HPLC测定，纯度达95%。

实施例2：3,4-二羟基苯乙醇苷的制备

取大血藤粗粉8kg，以75%乙醇为溶媒，大血藤与溶媒的重量比为1：18，加热回流提取4次，每次1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇至浸膏；浸膏加水溶解至体积为生药重量的0.5倍，再加入生药量2倍的明胶溶液沉淀，滤过，滤液减压浓缩至浸膏；浸膏加水溶解至生药重量的5倍，加于已处理好的HPD100大孔吸附树脂柱上，流速3BV/h，上样完成后以5%乙醇6000ml为洗脱剂，流速1BV/h进行洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至浸膏，残留物烘干，粉碎成细粉；细粉用甲醇超声提取，过滤，滤液减压回收溶剂至干，残留物再用乙酸乙酯超声提取，过滤，滤液减压回收溶剂至干，最后残留物用少量水溶解，加于已处理好的C18反相硅胶柱中，用10%乙腈水溶液进行洗脱，收集3,4-二羟基苯乙醇苷部分洗脱液合并，减压回收溶剂至浸膏，冻干，得3,4-二羟基苯乙醇苷6.9g，经HPLC测定，纯度达95%。

实施例3：3,4-二羟基苯乙醇苷的制备

取大血藤粗粉5kg，以95%乙醇为溶媒，大血藤与溶媒的重量比为1：12，加热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇至浸膏；浸膏加水溶解至体积为生药重量的1.5倍，再加入生药量1倍的明胶溶液沉淀，滤过，滤液减压浓缩至浸膏；浸膏加水溶解至生药重量的3倍，加于已处理好的HPD5000大孔吸附树脂柱上，流速2BV/h，上样完成后以5%乙醇8000ml为洗脱剂，流速3BV/h进行洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至浸膏，残留物烘干，粉碎成细粉；细粉用甲醇超声提取，过滤，滤液减压回收溶剂至干，残留物再用乙酸乙酯超声提取，过滤，滤液减压回收溶剂至干，最后残留物用少量水溶解，加于已处理好的C18反相硅胶柱中，用20%乙腈水溶液进行洗脱，收集3,4-二羟基苯乙醇苷部分洗脱液合并，减压回收溶剂至浸膏，冻干，得3,4-二羟基苯乙醇苷4g，经HPLC测定，纯度达95%。

实施例4：3,4-二羟基苯乙醇苷减轻结肠炎的发生

4.1 材料方法

4.1.1实验动物：SPF级BALB/c小鼠，雄性，体重20-23g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

4.1.2实验材料

葡聚糖硫酸钠,简称DSS(MW =36000-50000, MP Biomedicals，USA)；大便隐血试剂盒、髓过氧化物酶 (MPO)、丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠TNF-α, IL-1β和IL-6检测试剂盒（Promega，USA），NF-κB p65其磷酸化抗体购自(Cell Signaling Technology)。

4.1.3动物模型的建立及分组干预

30只SPF级BALB/c小鼠随机分为3组，分别为：①对照组(n =10)；②DSS组(n =10)；③3,4-二羟基苯乙醇苷+DSS组(n =10)；参照Okayasu介绍的方法，建立急性DSS小鼠UC模型，适应性喂养一周，第8天自由饮用3％DSS水溶液，正常组给予去离子水，连续饮用7天。药物干预组采用灌胃给药，造模前3天开始给药，给药剂量为10mg/kg·d，给药体积为0.1ml/10g，连续给药10天。

4.1.4一般情况观察

造模后开始每天定时称量小鼠体重，进行隐血试验和观察粪便性状，进行临床症状观察评分/疾病活动指数，评分标准如表1所示。

注：大便性状：正常：成形大便；松散：不粘附于肛门的糊状，半成形大便；稀便：可粘附于肛门的稀水样便。

4.1.5标本的采集及处理

结肠组织取样：第8天，颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹腔，自回盲部到肛门取出结肠，测量整个结肠长度，距离肛门1cm处剪下结肠2cm置入4℃ 4％甲醛溶液固定24h，常规石蜡包埋，切片， H&E染色，中性树脂胶封片，观察结肠损伤情况，进行组织病理学评分。然后取一小块病变部位的结肠组织准确称重，加入冷生理盐水，低温下制成10％组织匀浆，取一部分匀浆测定MPO 活性，余下的匀浆组织以 3000r/min 离心 10min，取上清液，分装，-80℃保存，待测生化指标；另取一部分病变部位的结肠组织，抽提RNA，采用 Real-time RCR检测相关基因的表达；最后取一部分病变部位的结肠组织，抽提蛋白，采用 WB 检测相关蛋白的表达，余下部分编号，液氮储存。

4.1.6实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测相关基因表达

提取RNA, 反转成cDNA, 运用的是SYBR 荧光染料法，GADPH作为内参，按照试剂说明采用20μL的反应体系，每个基因做三个复孔，尽量排除加样误差，具体的反应体系如下：

SYBRGreen PCR mix 10μL

模板cDNA 1μL

上游引物 1μL

下游引物 1μL

无菌水 7μL

反应程序采用二步法：

反应结束后，保存数据，分析数据，根据2^-ΔΔCT法计算所检测基因的相对表达含量。

4.1.7 Western-blotting检测蛋白的表达及活性相关实验

提取蛋白，BSA试剂盒进行蛋白定量，配制10%的蛋白分离胶，蛋白变性后，每孔加入80mg的总蛋白，转膜，孵育一抗（1:1000）和二抗（1:5000），ECL发光液检测NF-κB p65其磷酸化蛋白的表达，GADPH作为内参对照。

4.2 实验结果

4.2.1 3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠DAI评分的影响

实验结果显示，除了溶剂对照组外，其余2组都出现不同程度的血便、稀便和体重减轻，其中模型组最为严重。提前给予3天3,4-二羟基苯乙醇苷治疗组，上述症状不同程度的减轻，如图2所示，模型组的DAI评分明显高于对照组(P<0.05)，而3,4-二羟基苯乙醇苷组有所下降(P<0.05)。

4.2.2 3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠长度的影响

实验结果显示，饮用3％DSS水溶液7天后，模型组小鼠肠壁充血、肿胀，重量略微增加，严重者自结肠至肛门肠段均为血内容物，如图3所示，模型组结肠长度较正常组明显缩短(P<0.01)，3,4-二羟基苯乙醇苷治疗后都不同程度抑制结肠缩短 (P<0.05)。

4.2.3 3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠组织病理学结构的影响

如图4所示，病理切片显示，正常组结构清晰，无中性粒细胞浸润和溃疡，模型组结肠粘膜破坏，隐窝结构破坏严重，可见多灶性浅溃疡和炎症细胞浸润，3,4-二羟基苯乙醇苷处理组结肠组织破坏和炎症细胞浸润都明显减少。

4.2.4 3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中MPO含量的影响

髓过氧化物酶（MPO），是中性粒细胞特异标志物。如图5所示，模型组结肠组织中，MPO的活性较对照组明显升高(P<0.01)，说明炎症反应明显加重，3,4-二羟基苯乙醇苷处理组MPO活性显著降低(P<0.05)。

4.2.5 3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中MDA含量的影响

丙二醛（MDA）是脂质氧化产物。如图6所示，模型组结肠组织中，MDA的含量较对照组明显升高(P<0.05)，说明氧化损伤的程度明显加重，3,4-二羟基苯乙醇苷处理组MDA的含量显著降低(P<0.05)。

4.2.6 3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中SOD 活力与谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）活力的影响

谷胱甘肽(GSH)过氧化物酶和超氧化物歧化酶（SOD）是组织中常见的二种抗氧化酶，可以清除活性氧（ROS）,降低氧化损伤。如图7所示，模型组结肠组织中，SOD活力与 GSH-PX 活力较对照组明显降低(P<0.05)，3,4-二羟基苯乙醇苷可以提高结肠组织中GSH-PX 活力和超氧化物歧化酶（SOD）的活力，降低结肠组织的氧化损伤(P<0.05)。

4.2.7 3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中炎症因子(TNF-α, IL-1β和IL-6)基因表达的影响

如图8所示，模型组结肠组织中炎症因子(TNF-α, IL-1β和IL-6)基因表达较对照组明显升高(P<0.05)，3,4-二羟基苯乙醇苷处理组显著降低(P<0.01)。

4.2.8 3,4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导UC小鼠结肠组织中炎症相关蛋白NF-κB活性的影响

如图9所示，与对照组相比，模型组，NF-κB的磷酸化强度明显增强， 3,4-二羟基苯乙醇苷治疗组，NF-κB的磷酸化强度被抑制。由此可知，3,4-二羟基苯乙醇苷可以抑制结肠组织中NF-κB的活化。

4.3 结论

3,4-二羟基苯乙醇苷对溃疡性结肠炎有明显的保护作用，3,4-二羟基苯乙醇苷可以降低DSS诱导的急性UC模型动物DAI评分，减轻UC所致小鼠体重减轻和结肠长度缩短；同时改善炎性细胞浸润，3,4-二羟基苯乙醇苷还能抑制结肠组织中MPO活性增强和MDA含量增高，增强抗氧化酶SOD与GSH-PX的活力；另外3,4-二羟基苯乙醇苷还能抑制结肠组织中炎症因子的升高，并且这种作用与其抑制炎性信号通路的关键调节蛋白NF-κB活性相关。综上所述，3,4-二羟基苯乙醇苷可以用于防治溃疡性结肠炎。

实施例5 3,4-二羟基苯乙醇苷对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子表达的影响

5.1实验材料: 脂多糖(LPS)购于sigma公司，肽牛血清（FBS）、1640培养基和姨酶购于Gibco公司。

5.2实验方法

取对数生长期生长良好的细胞铺到六孔板中，24小时后加药处理，实验分为3组，cont组、LPS组、3,4-二羟基苯乙醇苷+LPS组，3,4-二羟基苯乙醇苷预处理2小时后，加100ng/ml的LPS刺激4h，收集细胞，提取RNA，Real-time PCR 检测相关炎症因子的表达变化，重复上面相同的处理。提取蛋白，Western检测相关蛋白的表达。

5.3实验结果

如图10所示，与对照组相比，LPS刺激后，TNF-α，IL-1β和 IL-6的表达明显升高(P<0.01)，用3,4-二羟基苯乙醇苷预处理细胞后，上述炎症因子(TNF-α, IL-1β和 IL-6)的表达明显降低(P<0.01)，由此说明3,4-二羟基苯乙醇苷可以抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子的表达；如图11所示，与对照组相比，LPS刺激后，NF-κB的磷酸化强度明显增强，用3,4-二羟基苯乙醇苷预处理细胞后，NF-κB的磷酸化强度被抑制。由此说明，3,4-二羟基苯乙醇苷可以抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NF-κB的活化。

Claims

1.一种3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

c. 用甲醇超声提取步骤b中获得的细粉，过滤，滤液减压回收溶剂至干，残留物再用乙酸乙酯超声提取，过滤，滤液减压回收溶剂至干，最后残留物用少量水溶解，加于C18反相硅胶柱中，用5%-85%乙腈水溶液进行洗脱，收集3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷部分洗脱液，合并，减压回收溶剂至浸膏，冻干，得白色粉末。

2.根据权利要求1所述的一种3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂的型号为HPD100、HPD300、HPD5000、D101。

3.根据权利要求1所述的一种3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：步骤b中所述乙醇系统为10%乙醇水溶液。

4.根据权利要求1所述的一种3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：步骤c中对C18反相硅胶柱进行分离洗脱的溶剂为8%乙腈水溶液。