CN115531403B - 人参皂苷与牛磺胆酸联用在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用 - Google Patents

人参皂苷与牛磺胆酸联用在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人参皂苷与牛磺胆酸联用在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用，通过建立异硫氰酸苯酯(APIT)诱导大鼠急性胆汁淤积型肝炎模型，结果显示，人参皂苷与牛磺胆酸联用能够缓解胆汁淤积性肝病症状，主要表现为降低血清ALT、ALP、Tbil、γ‑GT水平，恢复胆汁排泄量，抑制肝脏炎症因子表达水平，为临床治疗胆汁淤积性肝病提供了一种疗效确切且副作用小的新的药物。

Description

人参皂苷与牛磺胆酸联用在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病 的药物中的应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及人参皂苷与牛磺胆酸联用在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用。
背景技术
胆汁淤积是由于机体胆汁形成和分布障碍，从而导致胆汁酸在肝细胞和胆管大量蓄积的现象。胆汁淤积症可导致胆汁淤积性肝病的发生。胆汁淤积性肝病的发生原因较复杂，病毒感染、药物、妊娠、免疫、遗传、肠外营养等均可引起肝内胆汁淤积，如不及时有效治疗，甚至可能进展为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝肿瘤。目前临床上主要的治疗药物有熊去氧胆酸（UDCA）、S-腺苷蛋氨酸、考来烯酸胺、奥贝胆酸和贝特类药等，其中UDCA是临床推荐一线药物，主要目的是改善由于胆汁淤积所致的临床症状和肝脏损伤。然而，临床疗效尚无法令人满意，约有30%的患者对UDCA无效，且UDCA起效缓慢，较为昂贵，临床上急需更有效的药物。
人参皂苷Re(Ginsenoside Re，G-Re)、Rd(Ginsenoside Rd，G-Rd)是从三七、人参中提取出的四环三萜类物质。目前已有研究报道，人参皂苷Re可以通过上调GPX4减轻氧化应激，从而缓解6-羟基多巴胺诱导的细胞损伤。人参皂苷Re还可以通过抑制 TLR4 途径，缓解LPS 诱导的全身炎症。并且，人参皂苷Re还被报道通过影响Bcl-2和Bax水平来减轻缺血再灌注后心肌细胞凋亡。此外，人参皂苷Re还能够调节自噬，抑制JNK和NF-κB激活，从而降低胰岛素。人参皂苷Rd能激活AMPK和SIRT1，从而调节氧化应激和细胞凋亡，并改善糖尿病驱动的血管损伤。还有研究报道，人参皂苷Rd能通过诱导p62驱动的有丝分裂介导的NLRP3炎症小体失活来改善结肠炎。还有研究报道，人参皂苷Rd通过表皮生长因子受体信号轴抑制结直肠癌的转移。由此可见，人参皂苷Re、Rd有抗炎、抗癌、抗氧化、抗细胞凋亡等多种生物活性，并且在治疗糖尿病和急性缺血性中风等疾病方面效果显著。牛磺胆酸是一种天然利胆药物,在临床用于治疗胆囊炎、胆汁缺乏、胆道消化不良等症，能促进胆汁分泌。
目前，尚未见关于人参皂苷Re、Rd与牛磺胆酸的药物组合在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供人参皂苷与牛磺胆酸联用在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用，所述人参皂苷为人参皂苷Re或人参皂苷Rd中的一种或两种的组合。
优选地，所述人参皂苷与牛磺胆酸的质量比为1-3:1。
优选地，所述人参皂苷为人参皂苷Re与人参皂苷Rd按质量比为1-2:1-13的组合物。
优选地，本发明所述的胆汁淤积性肝病为胆汁淤积性肝炎，更优选为异硫氰酸苯酯APIT诱导的急性胆汁淤积型肝炎。
本发明所述的人参皂苷Re、Rd可以通过人参或三七中提取纯化得到，也可以通过市购获得。
本发明通过异硫氰酸苯酯(APIT)诱导大鼠急性胆汁淤积型肝炎模型，结果显示，人参皂苷与牛磺胆酸联用对APIT诱导的胆汁淤积所导致的Tbil、ALT、ALP和γ-GT活性升高有显著的抑制作用，对APIT诱导的肝细胞损伤、炎症细胞浸润以及胆汁排泄量的抑制也有显著的改善。表明人参皂苷与牛磺胆酸联用对APIT诱导的胆汁淤积型肝炎具有较好的治疗作用；且人参皂苷与牛磺胆酸联用对APIT诱导的胆汁淤积所导致的IL-1β、TNF-α和IL-6mRNA水平升高有显著的抑制作用，对NOS、COX-2、IL-18、NLRP3的蛋白水平升高也有显著的改善，表明人参皂苷与牛磺胆酸联用对APIT诱导的胆汁淤积型肝炎具有良好的抗炎作用，为临床治疗胆汁淤积性肝病提供更有利的药效学依据。
本发明还提供了一种预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物，包含有效含量的人参皂苷与牛磺胆酸和药学上可接受的载体。本发明预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物可经本领域常规方法制备成适宜的剂型。优选的，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、粉剂、注射剂、散剂、糖浆剂、丸剂、合剂或颗粒剂。
所述药学上可接受的载体包括但不限于填充剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂、助悬剂、防腐剂、粘合剂等等，其用量为本领域常规用量。
本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：
本发明提供了人参皂苷与牛磺胆酸联用在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的新用途，通过建立异硫氰酸苯酯(APIT)诱导大鼠急性胆汁淤积型肝炎模型，结果显示，人参皂苷与牛磺胆酸联用能够缓解胆汁淤积性肝病症状，主要表现为降低血清ALT、ALP、Tbil、γ-GT水平，恢复胆汁排泄量，抑制肝脏炎症因子表达水平，为临床治疗胆汁淤积性肝病提供了一种疗效确切且副作用小的新的药物。
附图说明
图1为人参皂苷与牛磺胆酸联用对胆汁淤积大鼠病理学变化的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
本发明实施例所采用的试药或试剂如下：
人参皂苷Re（批号：S27142）；人参皂苷Rd（批号：S27663）；熊去氧胆酸（批号：s25093）；牛磺胆酸（批号：s23028），均购自上海源叶生物科技有限公司；
上述药物溶于总体积1%的DMSO，震摇充分溶解后加蒸馏水配置成给药剂量为G-Re（10mg/kg）、G-Rd（20mg/kg）、牛磺胆酸（10mg/kg）、Re-Rd（5：10mg/kg）、Re-牛磺胆酸（5：5mg/kg）、Rd-牛磺胆酸（10：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（5：10：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（2：13：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（5：5：10mg/kg）溶液。
急性胆汁淤积性肝病由异硫氰酸苯酯(APIT)诱导（液态，每1ml含1.13g）由橄榄油稀释至110 mg/kg。
熊去氧胆酸作为阳药组，剂量为 50 mg/kg, 溶于总体积1%的DMSO，震摇充分溶解后加蒸馏水配置成2.5 mg/ml的溶液。
下述各实验例证明本发明所述的技术效果。
实施例1：人参皂苷与牛磺胆酸联用对胆汁淤积性肝病中的保护作用
1、实验材料
清洁级雄性SD大鼠，体重200±20 g，由吴氏实验动物提供，在塑料笼具内分笼饲养，自由摄食与饮水7天，使其适应环境。
2、实验方法
本实验例应用异硫氰酸苯酯(APIT)建立大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型，研究人参皂苷与牛磺胆酸联用对该模型大鼠的治疗作用。
2.1实验分组
大鼠72只，随机分为正常对照组、模型组、熊去氧胆酸阳药组、G-Re （10mg/kg）、G-Rd（20mg/kg）、牛磺胆酸（10mg/kg）、Re-Rd（5：10mg/kg）、Re-牛磺胆酸（5：5mg/kg）、Rd-牛磺胆酸（10：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（5：10：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（2：13：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（5：5：10mg/kg）给药组。
2.2给药方法
阳药组和给药组按20 ml/kg的剂量灌胃给药，正常对照组、模型组给予同等体积生理盐水，每天一次，给药6天，灌药第6天后除正常对照组外，其余各组大鼠均灌胃给予APIT 110mg/kg，所有大鼠在给予APIT后8小时，进行胆排泄试验测定2h胆汁流量；然后，腹主动脉取血制备血清，取左叶肝脏置于10％甲醛溶液中固定备用。
3、实验数据检测与处理
3.1检测指标
3.1.1血清指标测定
大鼠腹主动脉取血后，血液样本室温静止30min以上，3000 rpm 离心10 min，然后取上清液得到血清样本。然后按照试剂盒说明书进行操作，检测各组血清中谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）水平、血清总胆红素 (Tbil)、谷酰转移酶(γ-GT)活性。
3.1.2肝病理组织学观察
大鼠肝脏用10％中性甲醛固定，石蜡包埋，4-5μm切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，常规HE染色，乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封固，使用显微镜观察。
3.1.3胆排泄实验
大鼠腹腔注射乌拉坦1g /kg麻醉，胆总管插管，用预先称重并加入1mol/L的KH2PO4 100μL的离心管，冰块上收集胆汁。
3.2统计学分析
采用SPSS 26.0软件进行数据处理，统计方法选择单因素方差分析。
4.实验结果
各实验组对胆汁淤积大鼠血清生化指标的影响如表1所示，对胆汁排泄量的影响如表2所示，对胆汁淤积大鼠肝组织病理学变化的影响如图1所示。
表1 对胆汁淤积大鼠血清生化指标的影响
###表示和正常对照组相比P<0 .001，##表示和正常对照组相比P<0 .01，
***表示和模型对照组相比P<0 .001，**表示和模型对照组相比P<0.01，*表示和模型对照组相比P<0.05。
表2各实验组对胆汁淤积大鼠胆汁排泄量的影响
###表示和正常对照组相比P<0.001，
**表示和模型对照组相比P<0.01，*表示和模型对照组相比P<0.05。
Tbil、ALP和γ-GT活性升高是肝内胆汁淤积的血清学标志，ALT是反应肝功能的血清学标志。由表1和表2可知，模型组Tbil、ALP、γ-GT和ALT活性明显升高，胆汁排泄量显著减少；由图1可知，模型组出现炎性浸润和肝细胞坏死现象；表明大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型造模成功。
并且由表1和表2可知，熊去氧胆酸和各给药组对APIT诱导的胆汁淤积所导致的Tbil、ALT、ALP和γ-GT活性升高有显著的抑制作用，对APIT诱导的肝细胞损伤、炎症细胞浸润以及胆汁排泄量的抑制也有显著的改善。在同等剂量条件下，联用组作用强于单用组，且Re-Rd-牛磺胆酸（5：10：5）效果最佳，提示人参皂苷与牛磺胆酸联用具有协同效应。
5、实验结论
人参皂苷与牛磺胆酸联用对APIT诱导的胆汁淤积型肝炎具有较好的治疗作用。
实施例2：人参皂苷与牛磺胆酸联用对胆汁淤积性肝病中炎症指标的影响
1、实验材料
清洁级雄性SD大鼠，体重200±20 g，由吴氏实验动物提供，在塑料笼具内分笼饲养，自由摄食与饮水7天，使其适应环境。
2、实验方法
本实验例应用异硫氰酸苯酯(APIT)建立大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型，研究人参皂苷Re对该模型大鼠的治疗作用。
2.1实验分组
大鼠72只，随机分为正常对照组、模型组、熊去氧胆酸组、G-Re （10mg/kg）、G-Rd（20mg/kg）、牛磺胆酸（10mg/kg）、Re-Rd（5：10mg/kg）、Re-牛磺胆酸（5：5mg/kg）、Rd-牛磺胆酸（10：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（5：10：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（2：13：5mg/kg）、Re-Rd-牛磺胆酸（5：5：10mg/kg）给药组。
2.2给药方法
给药组和阳药组按20ml/kg的剂量灌胃给药，正常对照组、模型组给予同体积生理盐水，每天一次，给药6天，灌药第6天后除正常对照组外，其余各组大鼠均灌胃给予APIT110mg/kg，所有大鼠在给予APIT8小时后处死，取肝脏用生理盐水冲洗净表面残留血液并用滤纸擦拭干净后，储存于-80℃备用。
3、实验数据检测与处理
3.1检测指标
3.1.1 RT-qPCR检测炎症因子mRNA的表达程度
取50-100 mg的大鼠肝组织，加入1mLTRIzol，用1 mL注射器反复抽提至均匀混悬，再依次加入氯仿、异丙醇、75%酒精并分别于12000 rpm，4℃离心后获得RNA样本，使用紫外分光光度仪器测量RNA浓度，按照说明书要求配置逆转录体系，于逆转录仪器上制得cDNA样本。按照说明书配置PCR反应体系（DEPC水2 µL、Mix 5 µL、上下游引物各1 µL、cDNA 1 µL）。
PCR扩增反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，退火60 ℃ 30 s，40个循环。本研究使用相对定量方法，应用 2－ΔΔCt 分析数据。
3.1.2
3.2统计学分析
采用SPSS 26.0软件进行数据处理，统计方法选择单因素方差分析。
4.实验结果
各实验组对胆汁淤积大鼠肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平的影响如表3所示，对胆汁淤积大鼠肝脏中炎性蛋白水平的影响如表4所示。
表3 各实验组对胆汁淤积大鼠肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平的影响
##表示和正常对照组相比P<0 .01， #表示和正常对照组相比P<0 .05,
***表示和模型对照组相比P<0 .001，**表示和模型对照组相比P<0 .01，*表示和模型对照组相比P<0 .05。
表4各实验组对胆汁淤积大鼠肝脏中炎性蛋白水平的影响
##表示和正常对照组相比P<0 .01， #表示和正常对照组相比P<0 .05,
***表示和模型对照组相比P<0 .001，**表示和模型对照组相比P<0 .01，*表示和模型对照组相比P<0.05。
NLRP3是参与炎症反应的关键调节因子，COX-2和iNOS是两种重要的炎性蛋白，IL-18、IL-1β、TNF-α和IL-6是促炎因子，都可以参与炎症反应的发生和放大过程。由表3和表4可知，模型组IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平明显升高，iNOS、COX-2、IL-18、NLRP3的蛋白水平明显升高，表明大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型中炎症水平升高。
并且由表3和表4可知，熊去氧胆酸和各给药组对APIT诱导的胆汁淤积所导致的IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平升高有显著的抑制作用，对NOS、COX-2、IL-18、NLRP3的蛋白水平升高也有显著的改善。在同等剂量条件下，联用组作用强于单用组，且Re-Rd-牛磺胆酸（5：10：5）效果最佳，提示人参皂苷与牛磺胆酸联用具有协同效应。
5、实验结论
人参皂苷与牛磺胆酸对APIT诱导的胆汁淤积型肝炎具有良好的抗炎作用。

Claims (6)

1.人参皂苷与牛磺胆酸联用在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的药物中的应用，其特征在于，所述人参皂苷为人参皂苷Re或人参皂苷Rd中的一种或两种的组合；所述胆汁淤积性肝病为胆汁淤积性肝炎。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷与牛磺胆酸的质量比为1-3:1。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷为人参皂苷Re与人参皂苷Rd按质量比为1-2:1-13的组合物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胆汁淤积性肝炎为异硫氰酸苯酯APIT诱导的急性胆汁淤积型肝炎。
5.一种预防或治疗胆汁淤积性肝炎的药物，其特征在于，包含有效含量的人参皂苷与牛磺胆酸和药学上可接受的载体；所述人参皂苷为人参皂苷Re或人参皂苷Rd中的一种或两种的组合。
6.根据权利要求5所述的一种预防或治疗胆汁淤积性肝炎的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、注射剂、散剂、糖浆剂、丸剂、合剂或颗粒剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Protective Effects of Ginsenosides on 17α-Ethynyelstradiol-Induced Intrahepatic Cholestasis via Anti-Oxidative and Anti-Inflammatory Mechanisms in Rats;Yan-Jiao Xu等;《The American Journal of Chinese Medicine》;第45卷(第8期);第1-17页 *

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