CN113667030A - 一种金桂花粗多糖的脱色纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金桂花粗多糖的脱色纯化方法。该方法包括：对烘干后的金桂花粉碎、脱脂、浸提、离心后，将其浸提液低温冷冻后再室温解冻，使冷冻的金桂花多糖浸提液在部分融化时在表层产生色素聚集现象，弃去表面色素聚集层后，浓缩，脱蛋白，醇沉得到金桂花粗多糖析出物，加水复溶，对金桂花多糖复溶液也进行冻融法脱色，弃去表面色素聚集层，经透析后冷冻干燥，得脱色纯化后的金桂花粗多糖。本发明通过冻融法处理金桂花粗多糖浸提液和复溶液，获得金桂花粗多糖浸提液脱色率介于50％‑52％，金桂花粗多糖析出物保留率介于76％‑78％、金桂花粗多糖中总糖百分比介于80％‑82％的脱色纯化方法，脱色效果显著，多糖保留率较高。
Description
技术领域
本发明属于多糖提取领域，具体涉及一种金桂花粗多糖的脱色纯化方法。
背景技术
水提醇沉是植物多糖最普遍的提取方法，但植物根、茎、叶、花、果及种子的多糖，一般含有丰富且成分复杂的色素，在热水浸提环节会有大量的色素溶解出来，得到的植物多糖浸提液往往呈褐色、红色、绿色、黄色等色泽，对醇沉后的粗多糖纯化、结构表征及其生物活性探究造成了重要的影响，故需要进行脱色处理。
目前粗多糖中的色素常用的脱除方法有活性炭法、氧化法(双氧水、次氯酸等)、大孔树脂吸附法、反胶束法等脱除色素。活性炭吸附法在脱色的同时也会导致多糖的损失，且活性炭较难去除；H2O2用量过大会导致多糖的氧化降解，从而造成多糖的损失；大孔树脂吸附法脱色成本较高，且需再生处理，只适合处理量少、粘度小、色素含量低的体系；反胶束法脱色存在试剂有害、且不易回收、成本高的缺点；新型方法如聚酰胺、冷电弧-光催化-吸附脱色法存因成本、试验条件、仪器设备等原因，应用受限。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种金桂花粗多糖的脱色纯化方法。
本发明基于目前尚未见金桂花多糖脱色的研究报道，本发明的目的在于提供一种金桂花粗多糖脱色纯化的方法。该方法具有操作步骤简单易行，脱除色素效果显著，多糖保留率较高，且属于物理方法脱色因此具有能保持多糖结构与生物活性的优点。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，包括如下步骤：
(1)将金桂花烘干，粉碎，过筛，得到金桂花细粉；
(2)通过索氏抽提法脱除步骤(1)所述金桂花细粉的脂质和部分脂溶性色素，真空干燥，得到脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉；
(3)将步骤(2)所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉加入水中，在磁力搅拌状态下进行浸提处理，得到金桂花多糖浸提液；
(4)将步骤(3)所述金桂花多糖浸提液离心分离沉淀，取上清液，再将上清液过抽滤装置，取滤液，将所述滤液进行冻融处理，弃去表面色素聚集层，得到脱色后的金桂花多糖浸提液；
(5)将步骤(4)所述脱色后的金桂花多糖浸提液减压浓缩，得到浓缩液，采用Sevage法对浓缩液脱除蛋白，得到脱除蛋白后的浓缩液，将所述去除蛋白后的浓缩液与无水乙醇混合，进行醇沉处理，离心取沉淀，得到金桂花粗多糖析出物；
(6)将步骤(5)所述金桂花粗多糖析出物加水复溶，得到复溶液，将所述复溶液进行冻融处理，弃去表面色素聚集层，经透析45-50h后(透析液为去离子水)冷冻干燥，得到脱色纯化的金桂花粗多糖。
进一步地，步骤(1)所述过筛的筛孔大小为40-60目。
进一步地，步骤(2)中，通过索氏抽提法脱除所述金桂花细粉的脂质和脂溶性色素的次数为6-8次。
进一步地，步骤(2)所述真空干燥的温度为45-55℃，干燥的时间为3-5h。
进一步地，步骤(3)所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉与水的料液比为1:20-1:40g/mL。
进一步地，步骤(3)所述浸提处理的温度为95-99℃，浸提处理的时间为3.5-5h。
进一步地，步骤(4)所述离心的转速为6000-10000r/min，离心的温度为4-6℃，离心的时间为10-15min；
进一步地，步骤(4)所述冻融处理包括：先将所述滤液置于-5℃～-20℃环境中在3-6h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中0.5h(在此期间升温至部分融化且色素聚集在表层)。本发明发现使用低温冻融法对金桂花多糖浸提液和复溶液具有显著的脱色效果。
进一步地，步骤(5)所述浓缩液的体积为脱色后的金桂花多糖浸提液体积的1/3-1/5。
优选地，步骤(5)所述无水乙醇的体积为去除蛋白后的溶液体积的4倍。
进一步地，步骤(6)所述金桂花粗多糖析出物与水的质量体积比为1:30-1:50g/mL；
进一步地，步骤(6)所述冻融处理包括：先将所述复溶液置于-5～-20℃环境中在3-6h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中在0.5h内升温至部分融化且色素聚集在表层；所述冻融处理的次数为1-3次。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，通过冻融法处理金桂花多糖浸提液和复溶液，获得金桂花多糖浸提液脱色率介于50％-52％，金桂花粗多糖析出物保留率介于76％-78％、最终金桂花粗多糖中总糖百分比介于80％-82％的脱色纯化技术，不仅操作简单、安全、经济、环保，脱色效果显著，且对金桂花多糖的保留效果较好及对金桂花多糖生物活性影响甚微。
附图说明
图1为本发明实施例提供的金桂花粗多糖脱色纯化方法的流程图；
图2为本发明实施例中金桂花多糖浸提液脱色前400-700nm的紫外全波段扫描图；
图3为本发明实施例中金桂花粗多糖中总糖百分比测定所用标准曲线。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例中金桂花多糖浸提液的脱色率是通过如下方法计算的。该方法包括：首先扫描脱色前金桂花多糖浸提液在400-700nm处具有最大吸收峰的波长位置(参照图2所示)，而后在此最大吸收波长下(本试验最大吸收波长为420nm)，测定脱色前后的金桂花多糖浸提液的吸光值(即OD值)，并代入以下公式(1)得到脱色率：
(1)
以下实施例中金桂花粗多糖析出物的质量保留率采用下列公式(2)计算：
(2)
以下实施例中最终得到的金桂花粗多糖中的总糖百分比可以通过苯酚-硫酸法测得。以葡萄糖浓度为横坐标，490nm处的吸光值(OD值)为纵坐标，绘制标准曲线(参照图3所示)。测定金桂花粗多糖溶液在490nm处的OD值，并代入标准曲线方程，即可计算出金桂花粗多糖中的总糖质量，并代入公式(3)得到相应的金桂花粗多糖中的总糖百分比。
(3)
实施例1
一种金桂花粗多糖脱色纯化的方法(可参照图1所示)，包括如下步骤：
(1)将金桂花烘干，粉碎，过40目筛，得到金桂花细粉；
(2)通过索氏抽提法脱除步骤(1)所述金桂花细粉的脂质和部分脂溶性色素，回流提取6次，真空干燥(温度为45℃，时间为5h)，得到脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉；
(3)将步骤(2)所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉加入蒸馏水，所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉与水的料液比为1:30g/mL，在磁力磁力搅拌状态下进行浸提处理，浸提处理的温度为95℃，浸提处理的时间为5h，得到金桂花多糖浸提液；
(4)将步骤(3)所述金桂花多糖浸提液离心分离沉淀，离心的转速为6000r/min，离心的温度为6℃，离心的时间为15min，取上清液，将上清液抽滤，取滤液，将所述滤液进行冻融处理，所述冻融处理包括：先将所述滤液置于-5℃环境中在6h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中在0.5h内升温至部分融化且表层出现色素聚集现象，弃去表面色素聚集层，得到脱色后的金桂花多糖浸提液，且脱色率为50％；
(5)将步骤(4)所述脱色后的金桂花多糖浸提液浓缩，得到浓缩液，所述浓缩液的体积为脱色后的金桂花多糖浸提液体积的1/5，采用Sevage法对浓缩液脱除蛋白，得到去除蛋白后的浓缩液，将所述去除蛋白后的浓缩液与4倍无水乙醇混合，所述无水乙醇的体积为去除蛋白后的溶液体积的4倍，进行醇沉处理，离心取沉淀，得到金桂花粗多糖析出物；
(6)将步骤(5)所述金桂花粗多糖析出物加水复溶，所述金桂花粗多糖析出物与蒸馏水的质量体积比为1：30g/mL，得到复溶液，将所述复溶液进行冻融处理，所述冻融处理包括：先将所述复溶液置于-5℃环境中在4h内降温至完全冷冻且色素聚集在表层，然后置于室温环境中0.5h内升温至部分融化；所述冻融处理的次数为1次，弃去表面色素聚集层，经透析48h后真空冷冻干燥，得到呈均匀淡黄色的金桂花粗多糖。而未经冻融法脱色的金桂花粗多糖呈偏暗的黑色，说明冻融法对金桂花粗多糖的脱色效果显著。且金桂花粗多糖析出物的质量保留率为78％，脱色前后金桂花粗多糖中的总糖百分比由52％提高至80％。
实施例2
一种金桂花粗多糖脱色纯化的方法，包括如下步骤：
(1)将金桂花烘干，粉碎，过筛(筛孔大小为50目)，得到金桂花细粉；
(2)通过索氏抽提法脱除步骤(1)所述金桂花细粉的脂质和部分脂溶性色素，回流提取的次数为7次，真空干燥(温度为50℃，时间为4h)，得到脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉；
(3)将步骤(2)所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉加入蒸馏水，所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉与水的料液比为1:40g/mL，在磁力搅拌状态下进行浸提处理，浸提处理的温度为97℃，浸提处理的时间为4h，得到金桂花多糖浸提液；
(4)将步骤(3)所述金桂花多糖浸提液离心分离沉淀，离心的转速为8500r/min，离心的温度为5℃，离心的时间为12.5min，取上清液，将上清液抽滤，取滤液，将所述滤液进行冻融处理，所述冻融处理包括：先将所述滤液置于-10℃环境中在4.5h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中在0.5h内升温至部分融化且表层出现色素聚集现象，弃去表面色素聚集层，得到脱色后的金桂花多糖浸提液，经测定金桂花多糖浸提液的脱色率为52％；
(5)将步骤(4)所述脱色后的金桂花多糖浸提液浓缩，得到浓缩液，所述浓缩液的体积为脱色后的金桂花多糖浸提液体积的1/4，采用Sevage法对浓缩液脱除蛋白，得到脱除蛋白后的溶液，将所述脱除蛋白后的溶液与无水乙醇混合，所述无水乙醇的体积为去除蛋白后的溶液体积的4倍，进行醇沉处理，离心取沉淀，得到金桂花粗多糖析出物；
(6)将步骤(5)所述金桂花粗多糖析出物加水复溶，所述金桂花粗多糖析出物与水的质量体积比为1:40g/mL，得到复溶液，将所述复溶液进行冻融处理，所述冻融处理包括：先将所述复溶液置于-10℃环境中在4.5h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中在0.5h内升温至部分融化且表层出现色素聚集现象；所述冻融处理的次数为2次，弃去表面色素聚集层，经透析48h后真空冷冻干燥，得到呈均匀淡黄色的金桂花粗多糖。而未经冻融法脱色的金桂花粗多糖呈偏暗的黑色，说明冻融法对金桂花粗多糖的脱色效果显著。且金桂花粗多糖析出物的质量保留率为77％，脱色前后金桂花粗多糖中的总糖百分比由52％提高至81％。
实施例3
一种金桂花粗多糖脱色纯化的方法，包括如下步骤：
(1)将金桂花烘干，粉碎，过筛(筛孔大小为60目)，得到金桂花细粉；
(2)通过索氏抽提法脱除步骤(1)所述金桂花细粉的脂质和部分脂溶性色素，回流提取的次数为8次，真空干燥(温度为55℃，时间为3h)，得到脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉；
(3)将步骤(2)所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉加入水中，所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉与水的料液比为1:50g/mL，在磁力搅拌状态下进行浸提处理，浸提处理的温度为99℃，浸提处理的时间为3.5h，得到金桂花多糖浸提液；
(4)将步骤(3)所述金桂花多糖浸提液离心分离沉淀，离心的转速为10000r/min，离心的温度为4℃，离心的时间为10min，取上清液，将上清液抽滤，取滤液，将所述滤液进行冻融处理，所述冻融处理包括：先将所述滤液置于-20℃环境中在3h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中在0.5h内升温至部分融化且表层出现色素聚集现象，弃去表面色素聚集层，得到脱色后的金桂花多糖浸提液，且脱色率为52％；
(5)将步骤(4)所述脱色后的金桂花多糖浸提液浓缩，得到浓缩液，所述浓缩液的体积为脱色后的金桂花多糖浸提液体积的1/3，采用Sevage法对浓缩液脱除蛋白，得到脱除蛋白后的溶液，将所述去除蛋白后的溶液与无水乙醇混合，所述无水乙醇的体积为去除蛋白后的溶液体积的4倍，进行醇沉处理，离心取沉淀，得到金桂花粗多糖析出物；
(6)将步骤(5)所述金桂花粗多糖析出物加水复溶，所述金桂花粗多糖析出物与水的质量体积比为1:50g/mL，得到复溶液，将所述复溶液进行冻融处理，所述冻融处理包括：先将所述复溶液置于-5℃环境中在3h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中在0.5h内升温至部分融化且表层出现色素聚集现象；所述冻融处理的次数为3次，弃去表面色素聚集层，经透析48h后真空冷冻干燥，得到呈均匀淡黄色的金桂花粗多糖。而未经冻融法脱色的金桂花粗多糖呈偏暗的黑色，说明冻融法对金桂花粗多糖的脱色效果显著。且金桂花粗多糖析出物的质量保留率为76％，脱色前后金桂花粗多糖中的总糖百分比由52％提高至82％。
实施例4
一种金桂花粗多糖脱色纯化的方法，包括如下步骤：
(1)将金桂花烘干，粉碎，过50目筛(筛孔大小为60目)，得到金桂花细粉；
(2)通过索氏抽提法脱除步骤(1)所述金桂花细粉的脂质和部分脂溶性色素，回流提取的次数为6次，真空干燥(温度为55℃，时间为3h)，得到脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉；
(3)将步骤(2)所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉加入蒸馏水，所述脱脂和脱除部分脂溶性色素的金桂花细粉与水的料液比为1:30g/mL，在磁力搅拌状态下进行浸提处理，浸提处理的温度为99℃，浸提处理的时间为4h，得到金桂花多糖浸提液；
(4)将步骤(3)所述金桂花多糖浸提液离心分离沉淀，离心的转速为9000r/min，离心的温度为4℃，离心的时间为11min，取上清液，将上清液抽滤，取滤液，将所述滤液进行冻融处理，所述冻融处理包括：先将所述滤液置于-20℃环境中在3h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中在1.5h内升温至部分融化且出现表层色素聚集现象，弃去表面色素聚集层，得到脱色后的金桂花多糖浸提液，且脱色率为51％；
(5)将步骤(4)所述脱色后的金桂花多糖浸提液浓缩，得到浓缩液，所述浓缩液的体积为脱色后的金桂花多糖浸提液体积的1/3，采用Sevage法对浓缩液脱除蛋白，得到脱除蛋白后的溶液，将所述脱除蛋白后的溶液与无水乙醇混合，所述无水乙醇的体积为去除蛋白后的溶液体积的4倍，进行醇沉处理，离心取沉淀，得到金桂花粗多糖析出物；
(6)将步骤(5)所述金桂花粗多糖析出物加水复溶，所述金桂花粗多糖析出物与水的质量体积比为1:30g/mL，得到复溶液，将所述复溶液进行冻融处理，所述冻融处理包括：先将所述复溶液置于-20℃环境中在3h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中在0.5h内升温至部分融化且表层出现色素聚集现象；所述冻融处理的次数为2次，弃去表面色素聚集层，经透析48h后真空冷冻干燥，得到呈均匀淡黄色的金桂花粗多糖。而未经冻融法脱色的金桂花粗多糖呈偏暗的黑色，说明冻融法对金桂花粗多糖的脱色效果显著。且金桂花粗多糖析出物的质量保留率为77％，脱色前后金桂花粗多糖中的总糖百分比由52％提高至81％。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将金桂花烘干，粉碎，过筛，得到金桂花细粉；
(2)通过索氏抽提法脱除步骤(1)所述金桂花细粉的脂质和脂溶性色素，真空干燥，得到脱脂和脱除脂溶性色素的金桂花细粉；
(3)将步骤(2)所述脱脂和脱除脂溶性色素的金桂花细粉加入水中，并在搅拌状态下进行浸提处理，得到金桂花多糖浸提液；
(4)将步骤(3)所述金桂花多糖浸提液离心分离沉淀，取上清液，再将上清液抽滤，取滤液，将所述滤液进行冻融处理，弃去表面色素聚集层，得到脱色后的金桂花多糖浸提液；
(5)将步骤(4)所述脱色后的金桂花多糖浸提液减压浓缩，得到浓缩液，采用Sevage法对浓缩液脱除蛋白，得到脱除蛋白后的浓缩液，将所述脱除蛋白后的浓缩液与无水乙醇混合，进行醇沉处理，离心取沉淀，得到金桂花粗多糖析出物；
(6)将步骤(5)所述金桂花粗多糖析出物加蒸馏水复溶，得到复溶液，将所述复溶液进行冻融处理，弃去表面色素聚集层，经透析后冷冻干燥，得到脱色纯化的金桂花粗多糖。
2.根据权利要求1所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(1)所述过筛的筛孔大小为40-60目。
3.根据权利要求1所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(2)中，通过索氏抽提法脱除所述金桂花细粉的脂质和脂溶性色素的回流次数为6-8次。
4.根据权利要求1所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(2)所述真空干燥的温度为45-55℃，干燥的时间为3-5h。
5.根据权利要求1所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(3)所述脱脂和脱除脂溶性色素的金桂花细粉与水的料液比为1:20-1:40g/mL。
6.根据权利要求1所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(3)所述浸提处理的温度为95-99℃，浸提处理的时间为3.5-5h。
7.根据权利要求1所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(4)所述离心的转速为6000-10000r/min，离心的温度为4-6℃，离心的时间为10-15min。
8.根据权利要求1所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(4)所述冻融处理包括：先将所述滤液置于-5～-20℃环境中在3-6h内完全冷冻，然后置于室温环境中0.5h。
9.根据权利要求1所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(5)所述浓缩液的体积为脱色后的金桂花多糖浸提液体积的1/3-1/5，所述无水乙醇的体积为去除蛋白后的溶液体积的4倍。
10.根据权利要求1-9任一项所述的金桂花粗多糖脱色纯化的方法，其特征在于，步骤(6)所述金桂花粗多糖析出物与蒸馏水的复溶质量体积比为1:30-1:50g/mL；所述冻融处理包括：先将所述复溶液置于-5～-20℃环境中在3-6h内降温至完全冷冻，然后置于室温环境中0.5h；所述冻融处理的次数为1-3次。
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