CN114276470A - 一种石斛多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种石斛多糖及其制备方法和应用。所述石斛多糖通过以下步骤制备得到：(1)提取：选取石斛，加入适量水，固液比为1g:10mL‑1g:40mL，升温至60‑90℃，搅拌1‑3小时，然后过滤得到提取液，提取次数为2‑4次；(2)醇沉：将提取液浓缩，缓慢加入一定浓度的乙醇，边搅拌边加入，当乙醇浓度达到50‑90％时即停止，室温静置沉淀12‑24h；(3)将醇沉液离心，收集沉淀；(4)将沉淀用水溶解，过大孔树脂，以水为洗脱液，收集组分，浓缩烘干得到石斛多糖，本发明的制备工艺简捷，耗时短，适合于大规模工业生产。得到的石斛多糖，安全无毒副作用可用于护肤品，具有很好的抑菌抗氧化效果。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取应用领域，尤其涉及一种石斛多糖及其制备方法和应用。
背景技术
石斛，在《神农本草经》中被列为“上品”，民间称为“救命仙草”。其来源于兰科多年草本金钗石斛、铁皮石斛、鼓槌石斛、流苏石斛的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎，主要分布在云贵川等地。现代研究表明，石斛包括多糖类、黄酮类、香豆素类、酚类、萜类、生物碱类、氨基酸类、鞣质等多种化学成分，具有保护胃黏膜、增强免疫力、抗氧化、降血糖、降血脂、抗菌等多种药理作用。
多糖是石斛中一种重要的有效成分，其在石斛中的含量一般在20-30％之间。研究表明石斛多糖具有提高免疫力、抗菌、抗氧化、缓解干燥综合征症状等功效。其中抗氧化作用表现于，石斛多糖可增强过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)的水平，并具有清除活性氧、自由基的作用。
衰老是一个多环节的生物学过程。机体衰老很大程度上归因于自由基等引起的氧化损伤的增加，以及机体缺乏修复损伤的活性物质。抗氧化酶能够有效地清除自由基，实现抗衰老功效。石斛多糖可以通过激活超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶来发挥抗衰老功效。
对于抗氧化护肤品的研究较多，各种面膜也是常见的抗氧化美容产品。虽然现有的面膜等产品能够起到一定的抗氧化、抗衰老的效果，但是其功效成分多为化学合成物质，因而长期使用还是会对于皮肤产生一定的刺激性。因此，寻找纯天然、植物体系、安全有效的抗氧化剂具有十分广阔的前景。目前已知许多天然来源的成分具有抗氧化作用，但是在涉及对皮肤的刺激性、气味等问题时，我们发现众多植物提取物作为抗氧化剂并不适合添加到面膜中使用。因此，我们提出了一种石斛多糖及其在制备护肤品中的应用用于解决上述问题。
申请号为CN201711480845.5的专利公开了一种铁皮石斛多糖的提取工艺。其工艺步骤是：原料、除去枝叶、洗净、压榨、粉碎、冷冻--解冻、过筛、有机溶剂回流脱脂、水提、抽滤、真空浓缩、复溶、活性炭脱色、过滤、醇降，过滤、挥发、粗品、复溶、酶解除淀粉、醇降、过滤、复溶、纳米膜透析、醇降，过滤、冷冻干燥，得石斛多糖纯品。该工艺使用了多次冷冻-解冻技术、有机溶剂回流脱脂技术等，得到的多糖粗品得率约16％。该工艺步骤复杂，耗能高，溶剂成本高，且多糖得率不高。
申请号为CN201510237026.2的专利公开了一种铁皮石斛多糖的纯化方法，其工艺步骤是原料，粉碎，过筛，脱脂，水提，抽滤，真空浓缩，醇沉，离心分离，粗品，复溶，除淀粉，反复超低温速冻、融化、离心，透析，醇沉，离心分离，冷冻干燥，得石斛多糖。该方法采用的提取溶剂较多，时间较长，工艺复杂，若工业应用，会产生大量的废水。
申请号为CN201711484882.3的专利公开了一种微波提纯铁皮石斛多糖的方法。该方法是先将铁皮石斛切成粗粉，再用有机溶剂回流，分离得药渣，药渣加水后用微波萃取，萃取液过滤，滤液用活性炭脱色，再过滤并收集滤液，真空浓缩后得到浓缩液，浓缩液用有机溶剂分离制备铁皮石斛多糖粗品，多糖粗品加水溶解后用盐酸溶液调节等电点除蛋白质，再用纳米膜透析除去小分子，再用有机溶剂分离并冷冻干燥制备铁皮石斛多糖纯品。微波能耗高，设备贵，有一定的潜在辐射泄露危险，盐酸处理法在断开糖与蛋白质之间的结合键之外，也会促使多糖中糖苷键的断裂；此外，也会对容器造成腐蚀。
发明内容
发明目的：在针对现有技术问题的同时，兼顾工业应用的要求，本发明提供了一种具有抗氧化功效的石斛多糖及其制备方法和应用，该制备方法环保，高效，可以制备抗氧化功效的石斛多糖应用于护肤品，替代化学抗氧化剂。
技术方案：一种石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：选取石斛，加入适量水，固液比为1g:10mL-1g:40mL，升温至60-90℃，搅拌1-3小时，然后过滤得到提取液，提取次数为2-4次；
(2)醇沉：将提取液浓缩，缓慢加入一定浓度的乙醇，边搅拌边加入，当乙醇浓度达到50-90％时即停止，室温静置沉淀12-24h；
(3)将醇沉液离心，收集沉淀；
(4)将沉淀用水溶解，过大孔树脂，以水为洗脱液，收集组分，浓缩烘干得到石斛多糖。
优选的，步骤(1)中，所述的石斛为铁皮石斛或霍山石斛，更优选铁皮石斛；加入适量水之前，先将石斛药材切为2-4mm薄片，更优选2mm；提取时固液比为1g：10mL或1g：15mL，提取次数为2次或3次；搅拌时间为1h或2h；。
优选的，步骤(2)中，所述一定浓度的乙醇为90-98％乙醇，更优选95％乙醇；乙醇浓度达到80％时即停止，室温静置时间为12h。
优选的，步骤(4)中，沉淀溶解的用量比为沉淀：水＝1g:30mL-1g:100mL，更优选沉淀：水＝1g：30mL-1g：50mL。
优选的，步骤(4)中，所述大孔树脂型号为D301、D301T、D311、D318中的一种，更优选D301T大孔树脂；所述大孔树脂柱的柱高为10-100cm，直径为1-10cm，更优选的，所述大孔树脂柱的柱高为30-80cm，直径为2-7cm。
优选的，步骤(4)中，所述收集组分，收集洗脱时间段为10-100min，更优选的，收集洗脱时间段为40-80min，洗脱流速0.6-1.0mL/min。
一种石斛多糖，由上述的制备方法制得。
所述的石斛多糖在制备具备抗氧化功效的护肤品中的应用。
优选的，所述化妆品为面膜、乳液、面霜或精华露等，石斛多糖所占质量分数在0.1％-20％，更优选1％-15％。
进一步优选的，所述面膜，以重量计，由以下原料制成：石斛多糖5-20份，银耳多糖0.1-0.5份，1,3-丙二醇1-5份，纤维素0.1-1.0份，甘油1-10份，甘油聚醚-26 1-5份，尿囊素0.1-1份，赤藓醇1-10份，β-葡聚糖1-10份，1,2-己二醇0.1-5份，对羟基苯乙酮0.1-5份，烟酰胺1-10份，玫瑰花水1-5份。
更优选的，所述面膜，以重量计，由以下原料制成：石斛多糖10-15份，银耳多糖0.1-0.3份，1,3-丙二醇1-3份，纤维素0.2-0.5份，甘油1-10份，甘油聚醚-26 1-5份，尿囊素0.1-0.3份，赤藓醇3-8份，β-葡聚糖3-8份，1,2-己二醇1-2份，对羟基苯乙酮1-5份，烟酰胺3-8份，玫瑰花水1-5份。
有益效果：
(1)本发明的工艺简捷，耗时短，适合于大规模工业生产。
(2)本发明制备得到的石斛多糖来源于铁皮石斛，安全无毒副作用可用于护肤品，作为无添加抗氧化剂按质量分数计，为0.1％-20％，具有很好的抑菌抗氧化效果。
附图说明
图1石斛多糖对DPPH自由基的清除能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
一、多糖制备
实施例1：
(1)提取：选取500g石斛药材切片，厚度为2mm，加入水5L，升温至90℃，进行搅拌1h，然后过滤得到提取液，提取3次；
(2)醇沉：将提取液浓缩至小体积，缓慢加入95％乙醇，边搅拌边加入，当乙醇浓度达到80％时即可停止。室温静置沉淀12h。
(3)将醇沉液离心，收集沉淀。
(4)将沉淀用水溶解，沉淀与水的比例为1g:50mL；过大孔树脂，沉淀与树脂的重量比为1:90，以水为洗脱液，洗脱流速0.6mL/min，收集洗脱时间70-80min的组分，浓缩烘干得到石斛多糖97.5g。
计算得知多糖产率为19.5％。
实施例2：
(1)提取：选取500g石斛药材切片,厚度为2mm，加入水7.5L，升温至90℃，进行搅拌2h，然后过滤得到提取液，提取2次；
(2)醇沉：将提取液浓缩至小体积，缓慢加入95％乙醇，边搅拌边加入，当乙醇浓度达到80％时即可停止。室温静置沉淀12h。
(3)将醇沉液离心，收集沉淀。
(4)将沉淀用水溶解，沉淀与水的比例为1g:40mL；过大孔树脂，沉淀与树脂的重量比为1:70，以水为洗脱液，洗脱流速0.8mL/min，收集洗脱时间50-60min的组分，浓缩烘干得到石斛多糖104.5g。
计算得知多糖产率为20.9％。
实施例3：
(1)提取：选取500g石斛药材粉碎切片,厚度为2mm，加入水7.5L，升温至90℃，进行搅拌2h，然后过滤得到提取液，提取2次；
(2)醇沉：将提取液浓缩至小体积，缓慢加入95％乙醇，边搅拌边加入，当乙醇浓度达到80％时即可停止。室温静置沉淀12h。
(3)将醇沉液离心，收集沉淀。
(4)将沉淀用水溶解，沉淀与水的比例为1g:30mL；过大孔树脂，沉淀与树脂的重量比为1:50，以水为洗脱液，洗脱流速1.0mL/min，收集洗脱时间40-50min的组分，浓缩烘干得到石斛多糖106.1g。
计算得知多糖产率为21.2％。
二、检测与分析
实施例4：石斛多糖含量的检测
通过硫酸苯酚法检测所得石斛多糖含量，具体方法如下：
(1)以水为空白，分别各精密量取浓度为0.10mg/mL的葡萄糖对照品溶液0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL，置于10mL具塞试管中，加水至1.0mL，精密加入临用配置的5％苯酚溶液1mL，再精密加4mL硫酸，摇匀，于90℃水浴锅中加热15min，取出试管冰浴冷却5min。以水为空白，按照紫外-可见分光光度法，在488nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为A＝9.35x+0.0356，r2＝0.999。
(2)精确称取所制石斛多糖0.1g于烧杯，加入适量水溶解，定容至250mL容量瓶中，摇匀，得供试品溶液。取供试品溶液0.2mL，于10mL具塞试管中，再加0.8mL水补至1mL，精密加入临用配置的5％苯酚溶液1mL，再精密加4mL硫酸，摇匀，于90℃水浴锅中加热15min，取出试管冰浴冷却5min。在488nm处测定吸光度。
表1多糖含量检测结果
| 实例 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 多糖含量/％ | 85 | 86 | 88 |
实施例5：石斛多糖的抗氧化活性分析
DPPH自由基清除能力测定：
取0.2mmol·L-1DPPH乙醇试剂2mL，置于5mL离心管中，加入梯度浓度的石斛多糖水溶液2mL。静置30min，在517nm下检测吸光度值，即为As；以95％乙醇代替DPPH溶液为本底，即为A1；以95％乙醇代替样品为空白对照，即为A2。以抗坏血酸为阳性对照。DPPH清除率K(％)＝[1-(As-A1)/A2]x100％。
测定实施例3所得的石斛多糖的自由基清除能力，测定结果如图1所示，实施例3所得的石斛多糖水溶液对自由基的清除能力十分优秀，浓度在1.8mg/mL时，对DPPH的清除率就超过了50％，可见本发明所提供的石斛多糖具有很好的抗氧化能力。
三、多糖应用：一种面膜的制备
实施例6：
按照质量份数：水60份，石斛多糖10份，银耳多糖0.1份，1,3-丙二醇2份，纤维素0.5份，甘油5份，甘油聚醚-263份，尿囊素0.5份，赤藓醇5份，β-葡聚糖5份，1,2-己二醇1份，对羟基苯乙酮1份，烟酰胺5份，玫瑰花水3份。
然后按照以下方法制备含有石斛多糖的面膜；
(1)将水、1,2-丙二醇、甘油、甘油聚醚-26、尿囊素、纤维素、赤藓醇及玫瑰花水加入高速搅拌罐中，加热至85℃，至原料完全溶解，30HZ搅拌速率搅拌1小时；
(2)降温至70℃，加入β-葡萄糖、1,2-己二醇、对羟基苯乙酮，搅拌混合；
(3)降温至40℃，加入烟酰胺、石斛多糖、银耳多糖，然后搅拌混合；
(4)降温至40℃以下，停止搅拌、出料、静置。对所得物料进行检验，检验合格即可进行下一步。
(5)然后，将面膜基质浸入适量面膜精华液中，得到石斛多糖面膜。
实施例7：
按照质量份数：水50份，石斛多糖15份，银耳多糖0.1份，1,3-丙二醇3份，纤维素0.5份，甘油9份，甘油聚醚-263份，尿囊素0.5份，赤藓醇5份，β-葡聚糖5份，1,2-己二醇1份，对羟基苯乙酮1份，烟酰胺5份，玫瑰花水3份。
然后按照实施例6的方法制备含有石斛多糖的面膜；
四、面膜产品使用效果
实施例8：面膜产品使用测评
对实施例6、实施例7的面膜进行功效评价：
选取年龄为35-55岁的无皮肤病过敏史的健康女性受试志愿者100名，平均年龄37岁，随机分为4组，第1、2组志愿者每晚洁面后使用实施例6或例7的面膜；第3组志愿者每晚洁面后使用市售的一款抗衰老面膜；第4组志愿者共十人，每晚洁面后面部涂覆甘油为对照组。
在面膜使用前后分别对志愿者面部衰老症状进行评分，评价标准为：粗糙干燥、细纹、色素改变、面部色泽、皮肤弹性5项，每项依照严重程度分为轻度、中度、重度三个等级，轻度记为1分、中度2分、重度3分，最高15分；
症状积分值改善率＝(治疗前评分值-治疗后评分值)/治疗前评分值×100％；
显效：症状积分值改善率大于75％；
有效：症状积分值改善率大于35％；
无效：症状积分值改善小于35％或者无改变甚至皮肤状况变差；
总有效率＝(显效+有效)/总例数×100％
结果如下：
表2面膜测评结果
| 实验组 | 试验人数 | 显效人数 | 有效人数 | 无效人数 | 有效率 |
| 实施例6 | 30 | 19 | 9 | 2 | 93.3 |
| 实施例7 | 30 | 17 | 10 | 3 | 90.0 |
| 市售面膜 | 30 | 11 | 13 | 8 | 73.3 |
| 对照组 | 10 | 0 | 0 | 10 | 0 |
由表可以看出，本发明所制的石斛多糖面膜具有良好的改善肤质的效果，抗氧化抗衰老效果显著，相比市售面膜效果更佳。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种石斛多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取：选取石斛，加入适量水，固液比为1g:10mL-1g:40mL，升温至60-90℃，搅拌1-3小时，然后过滤得到提取液，提取次数为2-4次；
(2)醇沉：将提取液浓缩，缓慢加入一定浓度的乙醇，边搅拌边加入，当乙醇浓度达到50-90％时即停止，室温静置沉淀12-24h；
(3)将醇沉液离心，收集沉淀；
(4)将沉淀用水溶解，过大孔树脂，以水为洗脱液，收集组分，浓缩烘干得到石斛多糖。
2.根据权利要求1所述的石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的石斛为铁皮石斛或霍山石斛；加入适量水之前，先将石斛药材切为2-4mm薄片。
3.根据权利要求1所述的石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述一定浓度的乙醇为90-98％乙醇。
4.根据权利要求1所述的石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，沉淀溶解的用量比为沉淀：水＝1g:30mL-1g:100mL。
5.根据权利要求1所述的石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述大孔树脂型号为D301、D301T、D311、D318中的一种；所述大孔树脂柱的柱高为10-100cm，直径为1-10cm。
6.根据权利要求1所述的石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述收集组分，收集洗脱时间段为10-100min，洗脱流速0.6-1.0mL/min。
7.一种石斛多糖，由权利要求1-6任一项所述的制备方法制得。
8.权利要求7所述的石斛多糖在制备具备抗氧化功效的护肤品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述化妆品为面膜、乳液、面霜或精华露。
10.根据权利要求9所述的的应用，其特征在于，所述面膜，以重量计，由以下原料制成：石斛多糖5-20份，银耳多糖0.1-0.5份，1,3-丙二醇1-5份，纤维素0.1-1.0份，甘油1-10份，甘油聚醚-26 1-5份，尿囊素0.1-1份，赤藓醇1-10份，β-葡聚糖1-10份，1,2-己二醇0.1-5份，对羟基苯乙酮0.1-5份，烟酰胺1-10份，玫瑰花水1-5份。
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