CN111196865A - 一种铁皮石斛活性成分的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛活性物质的提取方法，包括酶‑溶剂提取、酶‑Sevag试剂脱蛋白、活性炭脱色、透析、干燥步骤。本发明在常规水提取之前进行乙酸乙酯脱脂和酶解，并在Sevag试剂脱蛋白前先酶解，有效地增加了铁皮石斛多糖的释放、减少了铁皮石斛多糖的损失、降低了脂溶性成分和醇溶性糖的含量，同时保证了石斛多糖较高的提取率和较高的活性。本方法避免了单一成分提取对名贵药材的浪费，在获得石斛多糖的同时获得石斛碱，不仅保持了多糖的高收率，且具有较高的经济效益。

Description

一种铁皮石斛活性成分的提取方法

【技术领域】

本发明属于植物多糖领域，具体涉及一种铁皮石斛活性成分的提取方法。

【背景技术】

铁皮石斛是属兰科石斛多年附生的草本植物，俗称黑节草、铁吊兰，是中国传统的名贵药材，享有“救命仙草”、“中华仙草”等美誉。铁皮石斛已被《中华人民共和国药典(2015版)》收载。

铁皮石斛中含有多糖、生物碱、菲类和微量元素等，其中铁皮石斛多糖是最主要的活性成分，具有的抗氧化、抗衰老和治疗某些疾病等作用，因此作为功效原料广泛应用于药品、保健食品和化妆品。铁皮石斛提取物已作为化妆品原料收录于《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》中，同时《中华人民共和国药典》也将铁皮石斛多糖的含量作为评价铁皮石斛质量的重要指标。

石斛多糖的提取多采用传统的水提醇沉方法，原理是基于多糖易溶于水、不溶或微容于有机溶剂的性质，用高浓度乙醇(80％左右)将其从水中沉淀析出，再用适量无水乙醇或丙酮洗涤，经冷冻干燥后获得粗多糖，其基本流程是：样品→脱脂→70％～80％乙醇除杂→蒸馏水浸提→醇沉过夜→离心→冷冻干燥→粗多糖。超声波辅助提取法是基于超声波的机械效应、热效应和空化效应作用，从而增大物质分子运动的频率和速度，提高溶剂穿击力，加快有效物质溶出，从而缩短提取时间。

近年来，又有若干制备工艺在石斛多糖的提取中获得应用。微波辅助提取法是基于微波穿透能力强的特点，利用物质在微波场中吸收微波能力的差异，使物质的某些区域或某些组分被选择性溶出。闪式提取法是一种用于植物软硬组织破碎的新型提取技术，依靠高速机械剪切力和超动分子渗滤技术，在室温及溶剂存在下数秒内把物料粉碎至细微颗粒，并使有效成分迅速达到组织内外平衡，通过过滤达到提取的目的，具有溶剂用量少、提取时间短、效率高等优点。酶解提取法是指利用酶促反应，加速植物细胞壁结构的破坏，从而有利于有效成分从细胞中释放出来，缩短提取时间，同时酶促反应是在较温和的条件下进行，可以有效降低生物活性物质的失活率。

【发明内容】

本发明提供一种铁皮石斛活性成分的提取方法，能够高效地提取出石斛多糖和铁皮石斛总生物碱，提高石斛多糖提取率同时较大限度保持多糖的活性。

本发明的技术解决方案如下：

一种铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)酶解提取：以80目以上的干铁皮石斛粗粉为原料，加入乙酸乙酯脱脂，过滤，得到的滤渣Ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂，在40～70℃进行酶解，酶解pH为3.0～6.0；升温使酶灭活，过滤，得到的滤渣Ⅱ干燥后加入酸性乙醇加热回流进行醇提，过滤得到滤液①和滤渣Ⅲ，在干燥的滤渣Ⅲ中加水进行水提，过滤得到滤液②和滤渣Ⅳ；将滤液②浓缩至适量，加入乙醇醇沉，在2～5℃下醇沉过夜；过滤，得到的滤渣Ⅴ干燥后得到粗多糖；

2)脱蛋白：取粗多糖复溶，加入蛋白酶30～50℃进行恒温处理，离心，取上清液，加入由氯仿：正丁醇(vol)＝4.0:1～4.5:1形成的Sevag试剂，剧烈震荡，离心取上清液，重复上述步骤至无变性蛋白析出；

3)脱色：向步骤2)中脱蛋白后的溶液加入活性炭或大孔吸附树脂进行脱色,抽滤，得到溶液A；

4)透析：将步骤3)中脱色后的溶液A进行透析除去水溶性小分子杂质，得到溶液B；

5)干燥：将步骤4)处理后的溶液B冷冻干燥，得到铁皮石斛多糖。

进一步的，上述步骤1)还包括：滤液①经过减压蒸干、1～2％盐酸水溶液溶解、二氯甲烷萃取、氨水调节pH＝8～12、氯仿萃取、减压蒸干，可以得到铁皮石斛总生物碱提取物。可以得到铁皮石斛总生物碱。

进一步的，上述步骤1)的酶试剂为纤维素酶和/或果胶酶，添加量为0.5～2.0％。

进一步的，上述步骤1)中的乙酸乙酯的加入量为10～30倍量，温度为50～90℃。

进一步的，上述步骤1)中的醇提为加入10～30倍量70～95％酸性乙醇(pH＝3～5)、40～70℃回流提取1.5～2.5h，重复1～4次。

进一步的，上述步骤1)中的水提为加入10～30倍量水提取1～4h，重复1～4次。

进一步的，上述步骤1)中的醇沉的含醇量为65～85％，醇沉时间为12～24h。

进一步的，上述步骤2)中的蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的一种或多种。

进一步的，上述步骤2)中的Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比为1∶3～1∶5。进一步的，上述步骤3)中的活性炭的加入量为0.5～1.5％，水浴时间为0.5～2h；

或加入4～7％预处理后的大孔树脂于200r/min摇床震荡吸附2h。

进一步的，上述步骤4)为：将步骤3)中脱色后的溶液装入已处理好的透析袋中，置于容器中通自来水，使水流自下而上；之后，按上述过程通纯净水透析，其中自来水透析24～48h、纯净水透析12～24h。

本发明的有益效果：本发明以干铁皮石斛粗粉为原料，通过溶剂提取法除去脂溶性成分和醇溶性糖，保证粗多糖有较高的纯度，同时结合酶法在较温和的条件下分解植物组织，加快多糖的释放，较大限度保持多糖的活性，同时还可获得铁皮石斛总生物碱，在提纯多糖的同时，减少名贵药材资源的浪费也可获得较高的经济效益；在粗多糖溶液中含有大量蛋白质，这些蛋白质会结合多糖形成糖蛋白，对后续的多糖分离造成很大的影响，本发明通过Sevag-酶联合脱蛋白法除去粗多糖溶液中蛋白质，在传统的Sevag法上结合酶法，以温和的条件使蛋白质变性，增加了蛋白脱除率，降低了多糖的损失；此外，本发明在特定步骤结合了酶法，进一步降低了有机溶剂的使用量和工艺条件，提高了产品的纯度和质量。

与现有技术相比，本发明所述的一种铁皮石斛多糖的提取及精制方法，根据副产物和杂质的特性，改变提取和萃取溶剂，适当引入生物酶，将铁皮石斛粗多糖提取率由原来20％提高到30％以上，将副产物铁皮石斛总生物碱的提取率由原来的0.6％提高到3％以上；在联合脱蛋白中采用Sevag试剂，避免了三氯乙酸法处理后多糖发黄和盐酸法分解多糖的缺点，使得到的多糖色泽洁白且含量高，经蛋白酶处理后，显著的减少了Sevag试剂使用次数，减少了有机溶剂的污染；经过本发明得到的多糖具有更优越的抗氧化性，其自由基清除率高于常规产品。

【附图说明】

图1为本发明的步骤流程示意图；

图2为本发明多糖脱色前后效果对比结果；

图3为本发明多糖部分理化性质检测结果。

【具体实施方式】

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

本发明公开了一种铁皮石斛活性成分的提取方法，主要步骤，如图1所示，具体包括：

1)酶解提取：以80目以上的干铁皮石斛粗粉为原料，加入乙酸乙酯脱脂，过滤，得到的滤渣Ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂，在40～70℃进行酶解，酶解pH为3.0～6.0；升温使酶灭活，过滤，得到的滤渣Ⅱ干燥后加入酸性乙醇加热回流进行醇提，过滤得到滤液①和滤渣Ⅲ，在干燥的滤渣Ⅲ中加水进行水提，过滤得到滤液②和滤渣Ⅳ；将滤液②浓缩至适量，加入乙醇醇沉，在2～5℃下醇沉过夜；过滤，得到的滤渣Ⅴ干燥后得到粗多糖；滤液①经过减压蒸干、1～2％盐酸水溶液溶解、二氯甲烷萃取、氨水调节pH＝8～12、氯仿萃取、减压蒸干可以得到铁皮石斛总生物碱提取物。

酶试剂优选纤维素酶和/或果胶酶，添加量为0.5～2.0％；乙酸乙酯优选加入量为10～30倍量，温度为50～90℃；醇提优选加入10～30倍量70～95％酸性乙醇、40～70℃回流提取1.5～2.5h，重复1～4次；水提优选加入10～30倍量水提取1～4h，重复1～4次；醇沉优选含醇量为65～85％，醇沉时间为12～24h。

2)脱蛋白：取粗多糖复溶，加入蛋白酶30～50℃进行恒温处理，离心，取上清液，加入由氯仿：正丁醇(vol)＝4.0:1～4.5:1形成的Sevag试剂，剧烈震荡，离心取上清液，重复上述步骤至无变性蛋白析出；蛋白酶优选胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的一种或多种，以除去粗多糖溶液中蛋白质；Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比优选为1∶3～1∶5。

3)脱色：向步骤2)中脱蛋白后的溶液加入0.5～1.5％活性炭，进行水浴脱色，水浴时间优选为0.5～2h(或加入4～7％预处理后的大孔树脂于200r/min摇床震荡吸附2h)，得到溶液A；

4)透析：将步骤3)中脱色后的溶液A装入已处理好的透析袋中，置于容器中通自来水，使水流自下而上；之后，按上述过程通纯净水透析，其中自来水透析24～48h、纯净水透析12～24h，得到溶液B；

5)干燥：将步骤4)处理后的溶液B冷冻干燥，得到铁皮石斛多糖。

以下实例中，检测铁皮石斛多糖含量均采用苯酚-硫酸比色法，通过紫外分光光度法测定波长在488nm处的吸光度OD484，标准曲线为OD484＝83.254C+0.1073(R2＝0.9993)；检测蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法，通过紫外分光光度法测定波长在595nm处的吸光度OD595；检测色素通过紫外分光光度法测定波长在450nm处的吸光度OD450。

铁皮石斛多糖提取率按照以下公式计算：

每次操作均各取0.1mL用于检测多糖及蛋白质。按下式计算蛋白脱除率及多糖保存率：

脱色率按下式计算：

以下实例中，检测铁皮石斛总生物碱含量采用酸性染料比色法，通过紫外分光光度法测定波长在620nm处的吸光度OD620，标准曲线为OD620＝0.1370C-0.1110(R2＝0.9997)。

以下实例中，检测铁皮石斛多糖抗氧化能力采用1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)法，通过紫外分光光度法测定波长在517nm处的吸光度OD517，标准曲线为OD517＝0.1706C+0.1865(R2＝0.9937)。

本发明所述的一种铁皮石斛多糖的提取及精制方法，根据副产物和杂质的特性，改变提取和萃取溶剂，适当引入生物酶，将铁皮石斛粗多糖提取率由原来20％提高到30.50％，将副产物铁皮石斛总生物碱的提取率由原来的0.6％提高到3.62％。在联合脱蛋白中采用Sevag试剂，避免了三氯乙酸法处理后多糖发黄和盐酸法分解多糖的缺点，使得到的多糖色泽洁白且含量高，经蛋白酶处理后，显著的减少了Sevag试剂使用次数，减少了有机溶剂的污染。经过本发明得到的多糖具有更优越的抗氧化性，其自由基清除率达到了53.21％。

以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序，所描述的方向仅限于附图。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。

实施例一

干铁皮石斛经粉碎过80目筛，得到铁皮石斛粗粉原料。

分别取1.0g粗粉3份。

3份均按照以下方法处理：

粗粉加入10～30倍量乙酸乙酯加热1～2h，温度为50～90℃，过滤，滤渣I干燥后加入加适量水，调pH至3.0～6.0，加入0.5～2.0％纤维素酶和/或果胶酶，40～70℃恒温酶解1.5～2.5h；迅速升温至90℃酶灭活10min，过滤，滤渣Ⅱ干燥；加入10～30倍量75～95％酸性乙醇(pH＝3～5)、40～70℃回流提取1.5～2.5h进行醇提，重复两次，过滤合并滤液，得到滤液①和滤渣Ⅲ；滤渣Ⅲ干燥，加水提取两次，过滤合并滤液，得到滤液②和滤渣Ⅳ；将滤液②减压浓缩至适量，加入乙醇醇沉，在2～5℃下醇沉过夜；过滤，得到的滤渣Ⅴ干燥后得到粗多糖。

经过计算，本实施例粗多糖的平均提取率为(30.50±1.80)％。

对比例一

取与实施例一相同的1.0g干铁皮石斛粗粉3份，采用常规水提醇沉法按筛选出较佳的提取条件进行提取：用30倍量水70℃提取2h，重复提取两次。经过计算，本实施例粗多糖的平均提取率(15.01±0.64)％。

实施例二

称取3份3.0g上述实施例一所得的粗多糖，分别加100mL水溶解，按照如下酶-Sevag联合脱蛋白法进行脱蛋白：

加入胰蛋白酶30～50℃进行恒温处理，离心，取上清液，加入Sevag试剂(Sevag试剂：氯仿：正丁醇(vol)＝4.0:1～4.5:1；Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比优选为1∶3～1∶5)，剧烈震荡，离心取上清液，重复上述步骤至无变性蛋白析出。结果发现，重复3次操作后无明显变性蛋白沉淀。

每次操作均各取0.1mL用于检测多糖及蛋白质，检测结果如表1所示，结果以(x±s)表示。仅使用蛋白酶脱蛋白多糖保存率和蛋白脱除率分别为(97.65±1.21)％、(60.11±2.31)％；使用胰蛋白酶-Sevag联用法脱蛋白多糖保存率和蛋白脱除率分别为(84.32±1.53)％、(78.70±2.08)％。

对比例二

称取3份3.0g与实施例二相同的粗多糖，分别加100mL水溶解，按照如下Sevag剂脱蛋白法进行脱蛋白：

加入Sevag试剂(Sevag试剂：氯仿：正丁醇(vol)＝4.0:1～4.5:1；Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比优选为1∶3～1∶5)，剧烈震荡，离心取上清液，重复上述步骤至无变性蛋白析出。使用Sevag试剂法脱蛋白发现至少需要7次才无明显变性蛋白沉淀。

每次操作均各取0.1mL用于检测多糖及蛋白质，检测结果如表1所示，结果以(x±s)表示，最终多糖保存率和蛋白脱除率分别为(78.59±2.76)％、(73.69±2.11)％。

表1 Sevag试剂法及胰蛋白酶-Sevag联用法蛋白脱除率及多糖保存率结果

注：表1中每组方法三个样品，结果用平均数±方差表示；第一栏是使用蛋白酶脱蛋白，所以Sevag试剂法第一栏无数据。

实施例三

分别取3份上述实施例二中脱蛋白后的多糖溶液，分别加入0.5～1.5％活性炭，进行水浴脱色0.5～2h，抽滤后测定脱色前后的脱色率及多糖保存率，分别为(82.68±0.82)％、(86.43±0.45)％。脱色前后见图2。

对比例三

取与实施例三相同的3份脱蛋白后的多糖溶液，加入4～7％预处理后的大孔树脂于200r/min摇床震荡吸附2h，抽滤后测定脱色前后的脱色率及多糖保存率，分别为(65.52±0.99)％、(86.74±0.78)％。

实施例四

取2.0g干铁皮石斛粗粉按实施例一操作得到滤液①，减压蒸干，8mL 1～2％盐酸溶液溶解，等体积加入二氯甲烷萃取1次，氨水调水相pH＝8～12，用等体积氯仿萃取5次，合并氯仿层(减压蒸干后，得到铁皮石斛总生物碱)并定容于100mL，取5mL总生物碱溶液用于检测含量并计算提取率。平行实验三次，结果以(x±s)表示，铁皮石斛总生物碱提取率为(3.62±0.20)％。

实施例五

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)是一种稳定的自由基(易溶于乙醇，且在517nm处有最大吸光度)。当加入自由基清除剂后，DPPH吸光度会减弱或消失(DPPH吸光度减小程度与自由基清除程度呈线性关系)。因此可以利用DPPH测定铁皮石斛多糖清除自由基的能力，用来代表铁皮石斛多糖的抗氧化能力(即清除率越大，则表明物质清除能力越强，抗氧化能力越强)。

按本发明方法制得铁皮石斛多糖冻干粉，加水配置成浓度为1.0mg/mL的铁皮石斛多糖溶液；用无水乙醇配制浓度为4mg/mL的DPPH溶液。分别将3.0mL DPPH溶液加入到1.0mL铁皮石斛多糖溶液与1.0mL蒸馏水中，混匀，室温避光30min，于517nm波长处测量OD517(DPPH+铁皮石斛多糖)和OD517(DPPH+水)。将3.0mL无水乙醇加入1.0mL铁皮石斛多糖溶液，于517nm波长处测量OD517(乙醇+铁皮石斛多糖)。根据DPPH标准曲线回归方程计算出DPPH质量浓度，计算DPPH自由基清除率。平行实验三次，结果以(x±s)表示，铁皮石斛多糖的DPPH自由基清除率为(53.21±1.15)％。

对比例五

按对比例一中所述提取方法，减压浓缩，冻干后，制得铁皮石斛多糖冻干粉，加水配置成浓度为1.0mg/mL的铁皮石斛多糖溶液。按照实施例五的方法，计算DPPH自由基清除率。平行实验三次，结果以(x±s)表示，铁皮石斛多糖的DPPH自由基清除率为(42.66±1.00)％。

实施例六

平行取按本发明方法制得铁皮石斛多糖冻干粉(精多糖)和对比例五中所制得铁皮石斛多糖冻干粉(粗多糖)各4份，分别加入茚三酮试剂、碘化钾试剂、双缩脲试剂、菲林试剂，观察性状。结果见图3和表2。由此说明，经过分离纯化后，可去除大量铁皮石斛多糖里的水溶性杂质，从而提高铁皮石斛多糖的纯度。

表2精多糖和粗多糖理化性质检查结果

编号	检测试剂/反应	检测杂质	精多糖检测结果	粗多糖检测结果
					1	茚三酮反应	氨基酸	阴性	阳性(黄色絮状沉淀)
2	碘化钾反应	淀粉	阴性	阳性(溶液变黑)
					3	双缩脲反应	蛋白质	阴性	阳性(絮状沉淀)
4	菲林试剂	还原性糖	阴性	阴性

Claims (11)

1.一种铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)酶解提取：以80目以上的干铁皮石斛粗粉为原料，加入乙酸乙酯脱脂，过滤，得到的滤渣Ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂，在40～70℃进行酶解，酶解pH为3.0～6.0；升温使酶灭活，过滤，得到的滤渣Ⅱ干燥后加入酸性乙醇加热回流进行醇提，过滤得到滤液①和滤渣Ⅲ，在干燥的滤渣Ⅲ中加水进行水提，过滤得到滤液②和滤渣Ⅳ；将滤液②浓缩至适量，加入乙醇醇沉，在2～5℃下醇沉过夜；过滤，得到的滤渣Ⅴ干燥后得到粗多糖；

2)脱蛋白：取粗多糖复溶，加入蛋白酶30～50℃进行恒温处理，离心，取上清液，加入由氯仿：正丁醇(vol)＝4.0:1～4.5:1形成的Sevag试剂，剧烈震荡，离心取上清液，重复上述步骤至无变性蛋白析出；

3)脱色：向步骤2)中脱蛋白后的上清液加入活性炭或大孔吸附树脂脱色，抽滤，得到溶液A；

4)透析：将步骤3)中脱色后的溶液A进行透析除去水溶性小分子杂质，得到溶液B；

5)干燥：将步骤4)处理后的溶液B冷冻干燥，得到铁皮石斛多糖。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤1)还包括：滤液①经过减压蒸干、1～2％盐酸水溶液溶解、二氯甲烷萃取、氨水调节pH＝8～12、氯仿萃取、减压蒸干可以得到铁皮石斛总生物碱提取物。

3.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤1)的酶试剂为纤维素酶和/或果胶酶，每100mL溶液添加酶试剂0.5～2.0g。

4.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤1)中的乙酸乙酯的加入量为10～30倍量，温度为50～90℃。

5.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤1)中的醇提为加入10～30倍量、pH＝3～5的70～95％酸性乙醇在40～70℃回流提取1.5～2.5h，重复1～4次。

6.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤1)中的水提为加入10～30倍量水提取1～4h，重复1～4次。

7.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤1)中的醇沉的含醇量为65～85％，醇沉时间为12～24h。

8.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤2)中的蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤2)中的Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比为1∶3～1∶5。

10.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤3)中的活性炭的加入量为每100mL溶液加入活性炭0.5～1.5g，水浴时间为0.5～2h；所述大孔吸附树脂的加入量为每100mL溶液4～7g，脱色过程为200r/min摇床震荡吸附2h。

11.根据权利要求1所述的铁皮石斛活性成分的提取方法，其特征在于，所述步骤4)为：将步骤3)中脱色后的溶液装入已处理好的透析袋中，置于容器中通自来水，使水流自下而上，之后再通纯净水透析，其中自来水透析24～48h、纯净水透析12～24h。

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