CN115594775B - 一种银耳多糖的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种银耳多糖的制备方法及应用。其制备方法包括先将银耳用溶剂浸泡，过滤；然后向滤渣中加入含添加剂的水溶液混合，打浆，离心，取上清液；再将上清液酶解，醇沉，得多糖沉淀；最后将多糖沉淀复溶，加热除去有机溶剂，干燥，即得；其中，步骤(2)中所述添加剂包括抗坏血酸钠、抗坏血酸、酒石酸钠和山梨醇。本发明采用的方法药材利用率高，银耳多糖的得率和纯度较高，提取时间短，能耗低，更有利于工业化生产。

Description

一种银耳多糖的制备方法及应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种银耳多糖的制备方法及应用。

背景技术

银耳，又称白木耳、雪耳、银耳子，具有滋阴润肺、养胃生津的功效，是我国传统的真菌食药，大量研究表明银耳对于治疗肺热咳嗽、胃炎、面部面斑、癌症肿瘤等病症具有治疗作用，且大部分的生物活性均与银耳多糖成分相关，研究表明，银耳多糖具有调节免疫、降血糖、降血脂、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老和抗氧化等多种功效。

目前，银耳多糖的提取纯化工艺主要有热水浸提法，超声辅助提取法，醇沉法，大孔树脂吸附吸附法，阴离子交换树脂法，Sevage试剂去除蛋白质等等，但是目前银耳多糖的提取率和提取的银耳多糖的纯度仍然较低，要么提取率提高了，纯度不足，要么提高了纯度，收率下降了，很难两全其美，产业化体系也尚待完善。然而受提取效果的制约，目前应用开发较少，市场产品不足，在食品、医药、美容等各个领域，需要进一步开发其潜在价值。

如专利申请CN107586349A公开了中性缓冲溶液提取银耳多糖的方法，包括以下步骤：在加热条件下，采用中性缓冲溶液对银耳粉进行浸提，得到浸提料液；将所述浸提料液进行固液分离，得到液体组分，所述液体组分中含有银耳多糖；将所述液体组分进行醇沉，得到的沉淀为银耳多糖。该发明所述方法银耳多糖的提取率能到达29.69％，为传统水提法的2～3倍，提高了银耳多糖的提取率。

再如专利申请CN112029006A公开了一种银耳多糖及其制备方法和应用，所述制备方法包括:(1)采用中性缓冲溶液对银耳粉进行浸提,得到浸提料液；(2)向浸提料液中加入果胶纤维素复合酶,进行酶解,所述果胶纤维素复合酶中果胶酶和纤维素酶的质量,比为(1.5～2):1；(3)酶解后过滤,取滤液进行离心,静置取上清液；(4)对上清液进行醇沉,离心,得到的沉淀为银耳多糖。以上方法收率仍有待进一步提高。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种银耳多糖的制备方法及应用，该方法药材利用率高，银耳多糖的得率和纯度较高，提取时间短，能耗低，有利于工业化生产。

为了实现本发明目的，采用的技术方案如下：

一种银耳多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将银耳用溶剂浸泡，去除溶剂；

(2)然后加入含添加剂的水溶液中混合，打浆，离心，取上清液；

(3)将上清液酶解，醇沉，得多糖沉淀；

(4)将多糖沉淀复溶，加热除去有机溶剂，干燥，即得；

其中，步骤(2)中所述添加剂包括抗坏血酸钠、抗坏血酸、酒石酸钠和山梨醇。

优选地，步骤(1)中所述的溶剂为乙醇-乙酸水溶液；

优选地，所述乙醇与乙酸的质量浓度分别为45-55％，0.05-0.1％；所述银耳与溶剂的质量体积比为1g：1-3mL，浸泡的时间为20-40min。

优选地，步骤(2)中，所述含添加剂的水溶液的制备方法包括将水中依次加入抗坏血酸钠、抗坏血酸、酒石酸钠、山梨醇和水，制成水溶液即可。

优选地，步骤(2)中，所述水溶液中抗坏血酸钠的质量浓度为0.3-0.5％、抗坏血酸的质量浓度为0.1-0.3％、酒石酸钠的质量浓度为0.05-0.1％、山梨醇的质量浓度为0.01-0.05％。

优选地，步骤(2)中，所述银耳与水溶液的质量体积比为1:25-35g/mL；所述打浆为用匀浆机打浆5s停3s，累计打浆的时间为0.5-1min。

优选地，所述离心的转速为4000-6000r/min，所述离心的时间为20-40min。

优选地，步骤(3)中，所述酶解为将上清液中加入复合酶酶解，所述复合酶的质量为上清液体积的0.1-0.5％g/mL；所述复合酶为质量比为3-5：1的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物。

优选地，所述酶解温度为55-70℃，酶解的pH为6.0-7.5，酶解的时间为0.5-1h。

优选地，步骤(3)中所述醇沉为向上清液中加入95％乙醇至溶液中乙醇浓度为75-85％，静置12-15h。

优选地，步骤(4)中所述复溶为将多糖沉淀中加入45-55倍量的水溶解；所述除去有机溶剂为旋转蒸发除去乙醇，旋转蒸发的水温55-65℃，转速165-175rpm。

本发明还有一个目的是提供上述制备方法在提取银耳活性成分中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明对银耳进行前处理研究，发现采用酒精-乙酸进行提前浸泡，乙醇中加入少量的乙酸可以高效去除银耳中的色素等杂质，浸泡时间缩短。前期采用活性炭粉末对制得的浆液进行脱色，活性炭粉末在8000r、30min的离心条件下仍未能除去，采用滤纸抽滤也未能除去残留碳粉末，因此不建议使用碳粉末脱色。

(2)采用酒精-乙酸水溶液浸泡时，其中酒精浓度较低(＜40％乙醇)时，提取的多糖随着酒精浓度的增大，多糖粉增加，但是计算的提取率下降；浸泡过久，银耳多糖向浸泡液中分散，得率偏低，浸泡较短，其得率也不足，本发明研究发现，酒精浓度为50％、加入0.5-0.1％醋酸浸泡30min左右时，其收集的多糖得率最高，提取的多糖的颜色成色好，呈纯白色。

(3)本发明对银耳打浆时，采用特定浓度的抗坏血酸钠、抗坏血酸、酒石酸钠和山梨醇复配的水溶液，其组分协同作用，不仅可以改善打浆银耳粘度大、多糖向浆液中迁移慢的问题，而且对银耳细胞表面产生破坏，促进银耳多糖与其他组分的分离，提取更完全，显著提高了银耳多糖的提取率，且保持多糖的成色更佳。前期研究表明，单纯的抗坏血酸钠可有效提高银耳多糖粉的重量，但是通过紫外测定得到的提取率并不高，说明其会降低银耳多糖的纯度，经与抗坏血酸、酒石酸钠复配后，同等总浓度添加量下，复配协同打浆，银耳多糖的最终提取率显著提高。

(4)本发明加入酒石酸钠，与山梨醇等复配，相比加入氯化钠等其他添加剂，可以更好的协同降低银耳多糖的粘度，酒石酸钠不仅可阻断多糖分子交联，还能水解与氢离子结合减少多糖氢键的形成，提高银耳多糖的提取，并协同山梨醇有效提高浆液流动性，活化浆液，从而高效降低银耳浆液粘度，利于银耳多糖的提取。

(5)本发明通过特定复合酶有效对银耳浆液中的蛋白质进行分解，去除蛋白杂质完全且效率高。前期研究中，曾使用sevage法除蛋白(将提取液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇＝5：1(V/V)]5：1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处，收集水层多糖液体冻干)，结果发现，此步骤多糖损失率较大，得率约十分之一。

(6)本发明采用醇沉对银耳多糖进行纯化，使用较高浓度的乙醇醇沉，较为合适，但是更高的乙醇不仅纯度提高不明显，还会增加生产成本和时间，本发明发现其最佳的醇沉浓度为75-85％。

附图说明

图1为吸光值-葡萄糖含量标准曲线图；

图2为对比例7-10与实施例1醇沉工艺得到的银耳多糖图；从左至右依次为对比例7、对比例8、对比例9、对比例10、实施例1。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。

以下实施方式中银耳多糖的得率及纯度测定方法如下：

(一)多糖得率测定方法

采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，绘制的吸光值-葡萄糖含量曲线如图1所示，经计算可以得出，其线性回归方程为y＝8.4343x+0.0076，相关系数R²＝0.9982，呈良好线性关系。通过此曲线换算冻干粉的多糖含量。按照以下公式计算提取液中的银耳多糖得率：

式中：

m——称取干银耳的质量(g)；

m₁——根据线性回归方程计算所得到的待测提取液中葡萄糖质量(mg)；

V₁——定容后的银耳多糖上清液体积(mL)；

V₂——提取液稀释50倍后取出的用于比色法测定的体积(mL)。

实施例1

一种银耳多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将银耳用3倍量的含0.05％乙酸的50％乙醇水溶液浸泡30min，过滤弃去溶液；

(2)然后向滤渣中加入30倍量含添加剂的水溶液混合，用匀浆机打浆，打浆5s停3s，累计打浆的时间为0.5min；然后以转速为5000r/min的速度离心30min，取上清液；

其中含添加剂的水溶液中抗坏血酸钠的质量浓度为0.4％、抗坏血酸的质量浓度为0.2％、酒石酸钠的质量浓度为0.06％、山梨醇的质量浓度为0.03％。

(3)将上清液中加入0.3％的复合酶，调pH至6.0，于60℃下酶解0.5h，然后煮沸5min灭活酶，再加入95％乙醇至体系中乙醇浓度为80％，静置12h，过300目筛得筛上絮状物，即为多糖沉淀；

其中复合酶为质量比为4：1的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物。

(4)将多糖沉淀中加50倍量水复溶，旋转蒸发仪除去乙醇等残留有机溶剂，浓缩，旋蒸条件水温55℃，转速150rpm，真空冷冻干燥，即得。

经计算，本实施例方法制得的银耳多糖的得率为48.60％，银耳多糖成色为纯白色。

得率是通过紫外分光光度仪测定粗品中的多糖含量与银耳药材的质量比，其得率即可反映提取的银耳多糖的提取率及纯度。

实施例2

一种银耳多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将银耳用2倍量的含0.1％乙酸的55％乙醇水溶液浸泡20min，过滤弃去溶液；

(2)然后向滤渣中加入35倍量含添加剂的水溶液混合，用匀浆机打浆，打浆5s停3s，累计打浆的时间为1min；然后以转速为4000r/min的速度离心40min，取上清液；

其中含添加剂的水溶液中抗坏血酸钠的质量浓度为0.5％、抗坏血酸的质量浓度为0.1％、酒石酸钠的质量浓度为0.1％、山梨醇的质量浓度为0.05％。

(4)将上清液中加入0.1％的复合酶，调pH至6.0，于55℃下酶解0.5h，然后煮沸5min灭活酶，再加入95％乙醇至体系中乙醇浓度为80％，静置15h，过300目筛得筛上絮状物，得多糖沉淀；

其中复合酶为质量比为3：1的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物。

(4)将多糖沉淀中加50倍量水复溶，旋转蒸发仪除去乙醇等有机溶剂，浓缩，旋蒸条件水温55℃，转速150rpm，真空冷冻干燥，即得。

经计算，本实施例方法制得的银耳多糖的得率为47.26％，银耳多糖成色为纯白色。

实施例3

一种银耳多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将银耳用3倍量的含0.08％乙酸的45％乙醇水溶液浸泡40min，过滤弃去溶液；

(2)然后向滤渣中加入25倍量含添加剂的水溶液混合，用匀浆机打浆，打浆5s停3s，累计打浆的时间为1min；然后以转速为6000r/min的速度离心20min，取上清液；

其中含添加剂的水溶液中抗坏血酸钠的质量浓度为0.3％、抗坏血酸的质量浓度为0.3％、酒石酸钠的质量浓度为0.05％、山梨醇的质量浓度为0.01％。

(3)将上清液中加入0.5％的复合酶，调pH至7.5，于70℃下酶解0.5h，然后煮沸5min灭活酶，再加入95％乙醇至体系中乙醇浓度为75％，静置15h，过300目筛得筛上絮状物，得多糖沉淀；

其中复合酶为质量比为5：1的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物。

(4)将多糖沉淀中加50倍量水复溶，旋转蒸发仪除去乙醇等有机溶剂，旋蒸条件水温55℃，转速150rpm，真空冷冻干燥，即得。

经计算，本实施例方法制得的银耳多糖的得率为48.39％，银耳多糖成色为纯白色。

对比例1-5

制备方法与实施例1步骤(1)采用的溶剂及浓度不同，具体参数如下表1，其余步骤按照实施例1方法提取纯化。

表1

前处理浸泡液酒精浓度为50％，并加入0.05-0.1％的醋酸时，收集的多糖得率较高；浸泡处理对于保护多糖的后续颜色也有较大帮助。浸泡时间过久多糖得率过低，表明多糖随时间延长不断往浸泡液迁移，虽然多糖粉脱色效果有提高，但提取得率损失非常大，因此不宜浸泡过久。

对比例6-9

制备方法与实施例1不同的是步骤(2)采用不同添加剂，具体种类及用量如下表2，其余步骤按照实施例1方法提取纯化。结果见图2和表2。

表2

本发明尝试单用抗坏血酸钠或抗坏血酸，发现相同浓度的抗坏血酸钠虽然可以有效提高多糖粉的质量，但是会其中的多糖含量(即纯度)降低，最终计算的提取率并不高，同时生产出的银耳多糖粉呈现绿色，使用抗坏血酸、抗坏血酸钠与酒石酸钠、山梨醇配伍提取，不仅解决了纯度及提取率的问题，还提高了多糖的成色，是一种最佳的选择。

对比例10

本对比例与实施例1的区别在于，复合酶不同，复合酶为质量比为4：1的木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的混合物，其余步骤按照实施例1方法提取纯化。经计算，本方法制得的银耳多糖的得率为41.16％，银耳多糖成色为纯白色。

对比例11-13

制备方法与实施例1步骤(3)加入95％乙醇后体系中乙醇浓度不同，具体醇沉时浓度如下表3，其余步骤按照实施例1方法提取纯化。

表3

各组	加至乙醇浓度	得率/％	成色
				对比例11	50％	36.50	纯白
对比例12	67％	39.43	纯白
				对比例13	89％	46.25	纯白

实验结果显示添加3-5倍乙醇进行醇析较为合适，但过多乙醇添加会增加生产成本和时间，本发明优选醇沉浓度为80％乙醇。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种银耳多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将银耳用溶剂浸泡，过滤；

(2)然后向滤渣中加入含添加剂的水溶液混合，打浆，离心，取上清液；

(3)将上清液酶解，醇沉，得多糖沉淀；

(4)将多糖沉淀复溶，加热除去有机溶剂，干燥，即得；

其中，步骤(2)中所述添加剂包括抗坏血酸钠、抗坏血酸、酒石酸钠和山梨醇；

步骤(1)中所述的溶剂为乙醇-乙酸水溶液；

步骤(3)中，所述酶解为将上清液中加入复合酶酶解，所述复合酶为质量比为3-5：1的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物；

步骤(3)中所述醇沉为向上清液中加入95％乙醇至溶液中乙醇浓度为75-85％。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙醇与乙酸的质量浓度分别为45-55％，0.05-1％；所述银耳与溶剂的质量体积比为1g：1-3mL，浸泡的时间为20-40min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含添加剂的水溶液的制备方法包括将水中依次加入抗坏血酸钠、抗坏血酸、酒石酸钠、山梨醇和水，制成水溶液即可。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述水溶液中抗坏血酸钠的质量浓度为0.3-0.5％、抗坏血酸的质量浓度为0.1-0.3％、酒石酸钠的质量浓度为0.05-0.1％、山梨醇的质量浓度为0.01-0.05％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述银耳与水溶液的质量体积比为1:25-35g/mL；所述打浆为用匀浆机打浆5s停3s，累计打浆的时间为0.5-1min；所述离心的转速为4000-6000r/min，所述离心的时间为20-40min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述复合酶的质量为上清液体积的0.1-0.5％。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶解温度为55-70℃，酶解的pH为6.0-7.5，酶解的时间为0.5-1h。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述醇沉时静置12-15h。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述复溶为将多糖沉淀中加入45-55倍量的水溶解；所述除去有机溶剂为旋转蒸发除去乙醇，旋转蒸发的水温为55-65℃，转速165-175rpm。

10.一种权利要求1-9任意一项所述的制备方法在提取银耳活性成分中的应用。