CN115611993B - 一种枸杞多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枸杞多糖的提取方法，属于天然植物有效成分提取技术领域。所述提取方法的步骤包括：枸杞加水浸泡，均质；加入木瓜蛋白酶，木质素酶和纤维素酶、酶解，酶灭活；灭活后加入酵母菌和氯化胆碱，发酵，酵母菌灭活，过滤，滤液中加入无水乙醇，过滤，沉淀物为粗多糖，纯化，得到枸杞多糖。本发明提供的枸杞多糖提取方法不仅提取率高，提取所得的枸杞多糖纯度也高，具有较大的应用推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及天然植物有效成分提取技术领域，特别涉及一种枸杞多糖的提取方法。
背景技术
枸杞(学名：Lycium chinenseMiller)是茄科枸杞属植物。枸杞是商品枸杞子、植物宁夏枸杞、中华枸杞等枸杞属物种的统称。枸杞具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗福射损伤、降血脂、降血糖、降血压、保肝、健脑、补肾、排毒、养颜和保护生殖系统等多项功能。现代中药学研究表明：枸杞的主要有效成份有多糖、色素、黄酮、蛋白质、甜菜碱、氨基酸和类胡萝卜素等。其中，枸杞多糖是枸杞主要活性成份之一，有多种药理作用和生物活性，如提高人体免疫力、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤及降血糖、降血脂等。
枸杞多糖是从枸杞中提取而得的一种水溶性多糖。常规提取方法包括水提醇沉法、微波提取法、酸碱分解提取法等，但是这些方法往往存在步骤复杂、能耗高、效率低、耗费大量资源的问题，限制了枸杞多糖的利用；如水提醇沉法提取枸杞多糖存在提取时间长、温度高等问题，对多糖的生物活性有不利影响。同时，为了提高枸杞多糖的提取效率，往往需要对其进行粉碎，而由于枸杞中的含糖量非常高，如果对枸杞进行单独粉碎的话，很容易发生粘连，难以粉碎成超细粉末，枸杞粉碎难的问题也限制了枸杞多糖的提取效率。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种枸杞多糖的提取方法。通过温水浸泡后高压均质的方式，使枸杞充分解离，再通过酶的作用，分离出枸杞中的糖，酶灭活后继续加入酵母菌发酵，同时添加氯化胆碱，使枸杞多糖充分溶解，然后通过醇沉的方法，得到粗多糖，纯化，得到枸杞多糖。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种枸杞多糖的提取方法，包括以下步骤：
枸杞加水浸泡，均质；加入木瓜蛋白酶、木质素酶和纤维素酶，酶解，酶灭活；灭活后加入酵母菌和氯化胆碱，发酵，酵母菌灭活，过滤，滤液中加入无水乙醇，过滤，沉淀物为粗多糖，纯化，得到枸杞多糖。
优选地，所述枸杞加水浸泡的料液比为1g:25～30mL，水的温度为45～50℃，浸泡时间为50～60min。
优选地，所述均质的压力为20～30MPa，时间为20～30min。
优选地，所述木瓜蛋白酶的加入量为枸杞干重的0.1～0.15％；所述木质素酶的加入量为枸杞干重的0.3～0.5％；所述纤维素酶的加入量为枸杞干重的1～1.5％。
优选地，所述酶解的温度为40～45℃，pH值为4.5～5.0，时间为45～60min。
优选地，所述酵母菌和酶灭活均为高温灭活，温度为100～120℃，时间为2～3min。
优选地，所述酵母菌的加入量为枸杞干重的1～2％，所述发酵的温度为40～45℃，时间为2～3h。
优选地，所述氯化胆碱与水的质量体积比为8.5g:25～30mL。
优选地，所述滤液与所述无水乙醇的体积比为30:60～70。
优选地，所述纯化为柱层析纯化，填充物为SephadexG-75，洗脱液为0.05moL/L的NaCl溶液。
本发明的有益技术效果如下：
本发明通过温水浸泡后高压均质的方式，使枸杞充分解离，再通过酶的作用，分离出枸杞中的糖，酶灭活后继续加入酵母菌发酵，同时添加氯化胆碱，使枸杞多糖充分溶解，然后通过醇沉的方法，得到粗多糖，进一步纯化，得到枸杞多糖，所提供的枸杞多糖提取方法不仅提取率高，提取所得的枸杞多糖纯度也高，具有较大的应用推广价值。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明提供了一种枸杞多糖的提取方法，包括以下步骤：
枸杞加水浸泡，均质，得到充分解离的枸杞和水的混合物；加入木瓜蛋白酶、木质素酶和纤维素酶，酶解，酶灭活；灭活后加入酵母菌和氯化胆碱，发酵，酵母菌灭活，过滤，滤液中加入无水乙醇，过滤，沉淀物为粗多糖，纯化，得到枸杞多糖，为淡黄色。
枸杞多糖由于其分子内或分子间的氢键作用，使其在各类溶剂中溶解难度大，因此限制枸了杞多糖的高效衍生化。本发明通过加入的氯化胆碱与发酵生成的乙醇共同作用，破坏枸杞多糖分子中原有的氢键而形成新的分子间氢键来促进枸杞多糖的溶解。通过加入木瓜蛋白酶，木质素酶和纤维素酶将枸杞中的蛋白质、木质素和纤维素分解，从而降低枸杞多糖溶出的难度，同时，纤维素分解产生的单糖、二糖能够为酵母菌提供碳源，因此发酵过程无需额外加入碳源。另外，枸杞本身含有的单糖、二糖同样作为酵母菌优先消耗的碳源，使得提取得到的枸杞多糖纯度更高。
本发明通过加入酵母菌进行发酵的步骤，使得枸杞发酵液中的单糖被更充分地消耗，进一步通过控制酵母菌加入量及发酵时间，控制体系产生乙醇的量，避免酶解液中乙醇浓度过低导致多糖不能溶解或乙醇浓度过高导致溶解的枸杞多糖再次析出的现象。
本发明提供方法中没有长时间的高温处理步骤，能够避免高温破坏枸杞多糖的生物活性，避免枸杞多糖褐变。
进一步地，所述枸杞加水浸泡的料液比为1g:25～30mL，水的温度为45～50℃，浸泡时间为50～60min。
本发明提供的提取方法同样适用于鲜枸杞，提取过程中可按照鲜枸杞的含水量减少水的加入比例即可。
进一步地，所述均质的压力为20～30MPa，时间为20～30min。
进一步地，所述木瓜蛋白酶的加入量为枸杞干重的0.1～0.15％；所述木质素酶的加入量为枸杞干重的0.3～0.5％；所述纤维素酶的加入量为枸杞干重的1～1.5％。
进一步地，所述酶解的温度为40～45℃，pH值为4.5～5.0，时间为45～60min。
本发明选用的发酵温度及pH值适用于所加入的各种酶，能够使体系保持较高的活性，加速枸杞的酶解。
进一步地，所述酵母菌和酶灭活均高温灭活，温度为100～120℃，时间为2～3min。
进一步地，所述酵母菌的加入量为枸杞干重的1～2％，所述发酵的温度为40～45℃，时间为2～3h。
进一步地，所述氯化胆碱与水的质量体积比为8.5g:25～30mL。
进一步地，所述滤液与所述无水乙醇的体积比为30:60～70。
进一步地，所述纯化为柱层析纯化，填充物为SephadexG-75，洗脱液为0.05moL/L的NaCl溶液。
本发明所用木瓜蛋白酶的酶活为10万U/g；
本发明所用木质素酶的酶活为380U/g；
本发明所用纤维素酶的酶活为2万U/g；
本发明实施例及对比例所用枸杞为市场购买的同批次产品(枸杞多糖含量为3.43g/100g)，枸杞多糖提取具体提取实验如下：
实施例1
枸杞多糖的提取：
(1)取干燥的枸杞100g，加水3L，加热至50℃浸泡50min，然后倒入高压均质机中，在25MPa的压力下均质30min，得到枸杞水分散体系；
(2)将步骤(1)所得的枸杞水分散体系转移至发酵罐中，加入0.1g木瓜蛋白酶、0.3g木质素酶和1.5g纤维素酶，用盐酸调节体系的pH值为4.5，45℃酶解50min，然后在120℃的条件下高温处理2min，进行灭活；
(3)灭活后再加入2g酵母菌和8.5g氯化胆碱，45℃发酵2h，在120℃的条件下高温处理2min，进行灭活，过滤，滤液中加入7L乙醇，静置12h，移除上层澄清溶液，剩余体系过滤，沉淀冷冻干燥，得到枸杞粗多糖；
(4)将枸杞粗多糖加水复溶，装入经0.05moL/L的NaCl溶液平衡后的SephadexG-75层析柱中，以0.05moL/L的NaCl溶液为洗脱液(流速30mL/h)，用自动收集器收集洗脱液，每管4mL，用苯酚-硫酸法测定各管洗脱液490nm处吸光度，合并在490nm处有吸收度的各管洗脱液，透析除去NaCl，冷冻干燥，得到纯化枸杞多糖3.93g，颜色呈淡黄色。
实施例2
枸杞多糖的提取：
(1)取干燥的枸杞100g，加水3L，加热至50℃浸泡50min，然后倒入高压均质机中，在25MPa的压力下均质30min，得到枸杞水分散体系；
(2)将步骤(1)所得的枸杞水分散体系转移至发酵罐中，加入0.1g木瓜蛋白酶、0.3g木质素酶和1.5g纤维素酶，用盐酸调节体系的pH值为5.0，45℃酶解50min，然后在120℃的条件下高温处理2min，进行灭活；
(3)灭活后再加入2g酵母菌和8.5g氯化胆碱，50℃发酵2h，在120℃的条件下高温处理2min，进行灭活，过滤，滤液中加入7L乙醇，静置12h，移除上层澄清溶液，剩余体系过滤，沉淀冷冻干燥，得到枸杞粗多糖；
(4)将枸杞粗多糖加水复溶，装入经0.05moL/L的NaCl溶液平衡后的SephadexG-75层析柱中，以0.05moL/L的NaCl溶液为洗脱液(流速30mL/h)，用自动收集器收集洗脱液，每管4mL，用苯酚-硫酸法测定各管洗脱液490nm处吸光度，合并在490nm处有吸收度的各管洗脱液，透析除去NaCl，冷冻干燥，得到纯化枸杞多糖3.87g，颜色呈淡黄色。
实施例3
枸杞多糖的提取：
(1)取干燥的枸杞100g，加水3L，加热至50℃浸泡50min，然后倒入高压均质机中，在30MPa的压力下均质20min，得到枸杞水分散体系；
(2)将步骤(1)所得的枸杞水分散体系转移至发酵罐中，加入0.1g木瓜蛋白酶、0.3g木质素酶和1.5g纤维素酶，用盐酸调节体系的pH值为4.5，45℃酶解60min，然后在100℃的条件下高温处理3min，进行灭活；
(3)灭活后再加入1.5g酵母菌和8.5g氯化胆碱，45℃发酵3h，在100℃的条件下高温处理3min，进行灭活，过滤，滤液中加入7L无水乙醇，静置12h，移除上层澄清溶液，剩余体系过滤，沉淀冷冻干燥，得到枸杞粗多糖；
(4)将枸杞粗多糖加水复溶，装入经0.05moL/L的NaCl溶液平衡后的SephadexG-75层析柱中，以0.05moL/L的NaCl溶液为洗脱液(流速30mL/h)，用自动收集器收集洗脱液，每管4mL，用苯酚-硫酸法测定各管洗脱液490nm处吸光度，合并在490nm处有吸收度的各管洗脱液，透析除去NaCl，冷冻干燥，得到纯化枸杞多糖3.79g，颜色呈淡黄色。
对比例1
与实施例1相比，区别在于，省略加入酵母菌进行发酵的步骤，得到的纯化枸杞多糖(2.98g)颜色呈淡黄色。
对比例2
采用传统的水提醇沉法提取枸杞多糖：
(1)取干燥的枸杞100g，加水3L，100℃回流提取1h；冷却，过滤，滤液中加入7L无水乙醇，静置12h，移除上层澄清溶液，剩余体系过滤，沉淀冷冻干燥，得到枸杞粗多糖；
(2)枸杞粗多糖的纯化过程同实施例1步骤(4)，得到的纯化枸杞多糖(2.93g)颜色呈褐黄色，明显深于实施例1～3所制得纯化枸杞多糖，原因可能为高温破坏了枸杞多糖，使其褐变以及还有较多色素杂质。
对实施例1～3及对比例1～2的提取方法进行比较：
以葡聚糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定各实施例和对比例制得的纯化枸杞多糖中枸杞多糖的纯度，进一步计算出各组枸杞多糖的提取率(枸杞多糖提取率(％)＝纯化枸杞多糖纯度*纯化枸杞多糖质量/3.43)，计算结果见表1。
表1
从表1中能够看出，相较于传统方法，采用本发明的提取方法，枸杞多糖的提取率及纯度都很高，明显优于传统方法。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种枸杞多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
枸杞加水浸泡，均质；加入木瓜蛋白酶、木质素酶和纤维素酶，酶解，酶灭活；灭活后加入酵母菌和氯化胆碱，发酵，酵母菌灭活，过滤，滤液中加入无水乙醇，过滤，沉淀物为粗多糖，纯化，得到枸杞多糖；
所述木瓜蛋白酶的加入量为枸杞干重的0.1～0.15％；所述木质素酶的加入量为枸杞干重的0.3～0.5％；所述纤维素酶的加入量为枸杞干重的1～1.5％；
所述酵母菌的加入量为枸杞干重的1～2％；所述发酵的温度为40～45℃，时间为2～3h；
所述氯化胆碱与水的质量体积比为8.5g:25～30mL；
所述纯化为柱层析纯化，填充物为SephadexG-75，洗脱液为0.05moL/L的NaCl溶液。
2.根据权利要求1所述的枸杞多糖的提取方法，其特征在于，所述枸杞加水浸泡的料液比为1g:25～30mL，水的温度为45～50℃，浸泡时间为50～60min。
3.根据权利要求1所述的枸杞多糖的提取方法，其特征在于，所述均质的压力为20～30MPa，时间为20～30min。
4.根据权利要求1所述的枸杞多糖的提取方法，其特征在于，所述酶解的温度为40～45℃，pH值为4.5～5.0，时间为45～60min。
5.根据权利要求1所述的枸杞多糖的提取方法，其特征在于，所述酵母菌和酶灭活均为高温灭活，温度为100～120℃，时间为2～3min。
6.根据权利要求1所述的枸杞多糖的提取方法，其特征在于，所述滤液与所述无水乙醇的体积比为30:60～70。
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