CN116731220B - 茶藨子叶状层菌多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于多糖提取领域，涉及茶藨子叶状层菌中多糖制备方法。本发明所提供的茶藨子叶状层菌多糖的制备方法，包含挥发油提取、酶解、去杂等步骤。本发明茶藨子叶状层菌多糖制备工艺可实现茶藨子叶状层菌中多糖的高效提取，多糖粗品的收率高，多糖含量可达85％以上，效果明显优于传统的提取方式。

Description

茶藨子叶状层菌多糖的制备方法

技术领域

本发明属于多糖提取领域，涉及茶藨子叶状层菌中多糖制备方法。

背景技术

茶藨子叶状层菌隶属担子菌门、层菌纲、非褶菌目、锈革孔菌科、叶状层菌属，是一种重要的药食两用的真菌。该菌常寄生于生长年限较长的忍冬藤植株上，其民间药用历史悠久，分部区域广泛，临床多用于治疗急性上呼吸道感染、咽炎、喉咙肿痛等病症，疗效显著。

已有相关文献报道，茶藨子叶状层菌中含有甾体、有机酸类、萜类、多糖类等多种生物活性物质。经药理实验证明，茶藨子叶状层菌具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抑菌、消炎、促进免疫、止痛等作用。由于其营养成分高、食用性强、安全评价高，对治疗肿瘤、糖尿病、病毒感染和抑制细菌等具有潜在的开发利用价值。

食药用菌的特殊成分食用菌多糖是人体不能合成的特殊分子结构，食用菌多糖的特殊分子结构与人的细胞膜多糖体结构相似，具有活性，能够修复人体细胞膜的多糖体，可从源头上防治人体疾病。很多研究表明，存在于食用或药用真菌中的某些多糖组分，具有通过活化巨噬细胞刺激抗体产生，从而达到提高人体免疫能力的生理功能。

“茶藨子木层孔菌多糖的体内抗肿瘤作用研究(刘玉红等，山东中医杂志)”一文中公开了，茶藨子木层孔菌对荷瘤小鼠无生长不良影响，且可以提高小鼠的免疫功能，表现为脾脏指数和胸腺指数增加。

在真菌多糖的提取方面，目前国内外主要采用热水浸提法和溶剂提取法。热水浸提法是一种常规的提取方法，其优点是提取条件温和，操作简单、方便；但存在的缺点是多糖得率不高。本领域目前一般仍采用传统的热水浸提法。溶剂提取法主要采用低浓度的草酸、草酸铵、盐酸、氢氧化钠等溶剂提取。有资料表明，酸、碱在多糖提取率方面均高于常规热水提取。然而，酸对多糖有水解作用，且操作比较繁杂，故多不采用酸提法。而盐对多糖的提取率提高不大。碱法的多糖得率比水提取及酸提取高，但要注意碱浓度不能太高，以免多糖变性；而且碱法提取条件剧烈，容易引起多糖变性，对多糖也有降解作用，且提取液粘稠，不易过滤。

“不用年份茶藨子叶状层菌多糖含量及抗氧化性比较研究(刘志庆等，山东农业科学)”一文中公开了茶藨子叶状层菌多糖的最佳提取工艺条件为料液比(g/mL)1:30、提取时间为2h、提取3次。

“正交试验设计优化茶藨子木层孔菌总多糖的提取条件(刘玉红等，食品与药品)”一文中对茶藨子木层孔菌多糖的提取条件进行了优化，最终得出加15倍量水，90℃提取4h，提取3次的提取条件，可提高多糖的收率。

中国专利201410484913.5，发明名称“一种茶藨子木层孔菌多糖及其制备方法和应用”中公开了一种茶藨子木层孔菌多糖的制备方法包括以下步骤：水提，茶藨子木层孔菌子实体粗粉加20-40倍量的水，90-100℃提取4次，每次4-6h，滤过，滤液加乙醇，静置，得多糖粗品；将多糖粗品溶于水中，蛋白酶酶解，灭活并除去变性蛋白酶，离心得上清液加入有机溶剂，除去下层有机相和中间蛋白层，得多糖水提液；水提液浓缩，加乙醇，离心，得沉淀，依次用乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得多糖粗品；将多糖粗品溶解后经DEAE-纤维素柱层析，第二洗脱峰的洗脱液再层析，收集主峰的洗脱液，经浓缩、透析和冻干后，得茶藨子木层孔菌多糖。

鉴于目前对茶藨子叶状层菌多糖成分制备的研究较少，制备方法采用传统的水提方式，多糖提取率低或多糖易水解等的技术缺陷，本领域迫切需要改进多糖的制备方法，以进一步提高茶藨子叶状层菌多糖的提取率。

发明内容

为进一步提高茶藨子叶状层菌多糖的提取率，本发明对茶藨子叶状层菌多糖制备的技术进行了进一步的开发与研究，主要是依据以下技术方案实现：

本发明所提供的茶藨子叶状层菌多糖的制备方法主要含有以下步骤：

步骤A，挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌加水蒸馏，蒸馏后的忍冬茶藨子叶状层菌备用；其中水与忍冬茶藨子叶状层菌的液料比为10-30mL/g；

步骤B，酶解，步骤A所得蒸馏后的忍冬茶藨子叶状层菌加水、复合酶Ⅰ，在45-55℃温度条件下酶解1-3小时，酶解后加热灭活；混合液冷却，加复合酶Ⅱ，在50-60℃温度条件下酶解2-4小时，酶解后加热灭活，酶解液备用；其中，水与忍冬茶藨子叶状层菌的液料比为10-50mL/g、复合酶Ⅰ的加入量为2-8g/L、复合酶Ⅱ的加入量为2-10g/L；

步骤C，去杂，步骤B所得酶解液，加入澄清剂，静置3-6小时，取澄清液体浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖提取物；其中澄清剂的加入量为0.1-2g/L。

进一步的，本发明所提供的制备方法含有以下步骤：

步骤A，挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌加水蒸馏，蒸馏后的忍冬茶藨子叶状层菌备用；其中水与忍冬茶藨子叶状层菌的液料比为10-30mL/g；

步骤B，酶解，步骤A所得蒸馏后的忍冬茶藨子叶状层菌加水、复合酶Ⅰ，在50℃温度条件下酶解2小时，酶解后加热灭活；混合液冷却，加复合酶Ⅱ，在55℃温度条件下酶解3小时，酶解后加热灭活，酶解液备用；其中，水与忍冬茶藨子叶状层菌的液料比为10-50mL/g、复合酶Ⅰ的加入量为4-6g/L、复合酶Ⅱ的加入量为3-6g/L；

步骤C，去杂，步骤B所得酶解液，加入澄清剂，静置3-6小时，取澄清液体浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖提取物；其中澄清剂的加入量为0.5-1.5g/L。

具体的，上述制备方法步骤B中复合酶Ⅰ为胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶中的一种或多种的组合；复合酶Ⅱ为淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶中的一种或多种的组合。

进一步的，所述的复合酶Ⅰ为木瓜蛋白酶与纤维素酶的组合；所述的复合酶Ⅱ为淀粉酶与果胶酶的组合。

更进一步的，所述的木瓜蛋白酶与纤维素酶的质量比例为(0.5-2):1；所述的淀粉酶和果胶酶的质量比例为(1-5):1。

具体的，上述制备方法步骤C中澄清剂为明胶、聚乙烯吡络烷酮、明矾、壳聚糖、β-环糊精、海藻酸钠和单宁中的一种或多种的组合。

进一步的，所述的澄清剂为壳聚糖、β-环糊精和海藻酸钠的组合。

更进一步的，所述的壳聚糖、β-环糊精和海藻酸钠的质量比例为(0.5-1):(2-5):(1.5-3)。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明在忍冬茶藨子叶状层菌制备过程中，首先采用了去除挥发油等挥发性成分的方式。忍冬茶藨子叶状层菌中含有少量挥发性成分，挥发性成分的存在，会在一定程度上影响多糖成分的提取，去除挥发性成分，可明显提高多糖的提取率。

2.本发明采用了双重酶解的方式，对忍冬茶藨子叶状层菌进行有效分解，并进一步的，对所用的分解酶进行了进一步的优化，实现了忍冬茶藨子叶状层菌多糖成分的高效提取。两种复合酶的使用可不同程度的改变忍冬茶藨子叶状层菌的细胞结构，使得多糖成分更容易溶出，提高提取效率。但复合酶的使用并非越多越好，复合酶的加入量过多，反而会引起多糖成分的分解，使最终多糖粗品的收率降低，其多糖含量降低，本发明对复合酶的种类及使用量进行了进一步的优化，实现多糖粗品的高收率。

3.本发明采用澄清剂对提取液进行除杂，澄清剂的使用可明显对提取液中黄酮类等其他成分进行沉降，可明显提高多糖粗品中的多糖纯度；效果要明显优于传统的醇沉方式对多糖进行沉降获得多糖成分；同时本发明对澄清剂的种类及使用量进行了进一步的优化与筛选，避免了澄清剂的过多使用造成的提取液中多糖的沉降，提高了多糖的收率。

综上，本发明采用的去除挥发油等挥发油性成分后采用双重酶解的方式破坏忍冬茶藨子叶状层菌细胞结构，促进多糖成分溶出，并采用特定澄清剂进行除杂的多糖提取方式，可实现忍冬茶藨子叶状层菌中多糖的高效提取，其多糖粗品的收率最高可至11.32％，多糖粗品中多糖含量最高可至93.54％，提取率及多糖纯度均明显优于其他提取方式。

具体实施例

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域的技术人员在不脱离本发明技术方案范围的情况下，都可利用所揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以下实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明权利要求保护的范围。

实施例1茶藨子叶状层菌中多糖的制备

步骤A：挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌子实体50g，粉碎成细粉，加蒸馏水1000mL，混匀后，连接装置，进行水蒸气蒸馏，蒸馏至挥发油量不再增加，挥发油弃之，蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，干燥，备用；

步骤B：酶解，步骤A所得蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，按照质量-体积比为1:30加入1500mL温度为50℃蒸馏水、加入7.5g复合酶Ⅰ(含木瓜蛋白酶4.5g、纤维素酶3g)，混匀，置于50℃恒温水浴锅，酶解2小时，酶解完成后加热煮沸灭活；混合液冷却至55℃，加入6g复合酶Ⅱ(含淀粉酶4.5g、果胶酶1.5g)，混匀，置于55℃恒温水浴锅，酶解3小时，酶解完成后加热灭活，过滤，酶解液备用；

步骤C：去杂，步骤B所得酶解液，加入1.5g澄清剂(含壳聚糖0.24g、β-环糊精0.66g、海藻酸钠0.6g)，静置4小时，过滤，得澄清液体，浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖粗品。

实施例2茶藨子叶状层菌中多糖的制备

步骤A：挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌子实体50g，粉碎成细粉，加蒸馏水500mL，混匀后，连接装置，进行水蒸气蒸馏，蒸馏至挥发油量不再增加，挥发油弃之，蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，干燥，备用；

步骤B：酶解，步骤A所得蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，按照加入2500mL温度为45℃蒸馏水、加入15g复合酶Ⅰ(含木瓜蛋白酶10g、纤维素酶5g)，混匀，置于45℃恒温水浴锅，酶解3小时，酶解完成后加热煮沸灭活；混合液冷却至55℃，加入4.5g复合酶Ⅱ(含淀粉酶3g、果胶酶1.5g)，混匀，置于55℃恒温水浴锅，酶解3小时，酶解完成后加热灭活，过滤，酶解液备用；

步骤C：去杂，步骤B所得酶解液，加入2.25g澄清剂(含壳聚糖0.5g、β-环糊精1g、海藻酸钠0.75g)，静置6小时，过滤，得澄清液体，浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖粗品。

实施例3茶藨子叶状层菌中多糖的制备

步骤A：挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌子实体50g，粉碎成细粉，加蒸馏水1500mL，混匀后，连接装置，进行水蒸气蒸馏，蒸馏至挥发油量不再增加，挥发油弃之，蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，干燥，备用；

步骤B：酶解，步骤A所得蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，按照加入500mL温度为45℃蒸馏水、加入2g复合酶Ⅰ(含木瓜蛋白酶1g、纤维素酶1g)，混匀，置于45℃恒温水浴锅，酶解3小时，酶解完成后加热煮沸灭活；混合液冷却至50℃，加入9g复合酶Ⅱ(含淀粉酶4.5g、果胶酶4.5g)，混匀，置于50℃恒温水浴锅，酶解2小时，酶解完成后加热灭活，过滤，酶解液备用；

步骤C：去杂，步骤B所得酶解液，加入0.75g澄清剂(含壳聚糖0.075g、β-环糊精0.45g、海藻酸钠0.225g)，静置3小时，过滤，得澄清液体，浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖粗品。

实施例4茶藨子叶状层菌中多糖的制备

步骤A：挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌子实体50g，粉碎成细粉，加蒸馏水1000mL，混匀后，连接装置，进行水蒸气蒸馏，蒸馏至挥发油量不再增加，挥发油弃之，蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，干燥，备用；

步骤B：酶解，步骤A所得蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，按照加入1500mL温度为50℃蒸馏水、加入12g复合酶Ⅰ(含木瓜蛋白酶8g、纤维素酶4g)，混匀，置于50℃恒温水浴锅，酶解2小时，酶解完成后加热煮沸灭活；混合液冷却至50℃，加入3g复合酶Ⅱ(含淀粉酶2.5g、果胶酶0.5g)，混匀，置于50℃恒温水浴锅，酶解4小时，酶解完成后加热灭活，过滤，酶解液备用；

步骤C：去杂，步骤B所得酶解液，加入3g澄清剂(含壳聚糖0.5g、β-环糊精1g、海藻酸钠1.5g)，静置4小时，过滤，得澄清液体，浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖粗品。

实施例5茶藨子叶状层菌中多糖的制备

步骤A：挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌子实体50g，粉碎成细粉，加蒸馏水1000mL，混匀后，连接装置，进行水蒸气蒸馏，蒸馏至挥发油量不再增加，挥发油弃之，蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，干燥，备用；

步骤B：酶解，步骤A所得蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，按照加入1500mL温度为55℃蒸馏水、加入13g复合酶Ⅰ(含组织蛋白酶1g、淀粉酶2g)，混匀，置于55℃恒温水浴锅，酶解1小时，酶解完成后加热煮沸灭活；混合液冷却至60℃，加入15g复合酶Ⅱ(含纤维素酶12g、半纤维素酶3g)，混匀，置于60℃恒温水浴锅，酶解2小时，酶解完成后加热灭活，过滤，酶解液备用；

步骤C：去杂，步骤B所得酶解液，加入0.15g澄清剂(含壳聚糖0.02g、明胶0.1g、明矾0.03g)，静置4小时，过滤，得澄清液体，浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖粗品。

对比实施例1茶藨子叶状层菌中多糖的制备

取忍冬茶藨子叶状层菌子实体50g，粉碎成细粉，加1500mL蒸馏水，煮沸0.5小时，浸泡过夜；后置于90℃恒温水浴锅中，提取4小时，重复提取3次，提取液合并，过滤，减压浓缩，离心，上清液加4倍量无水乙醇，沉淀过夜，离心，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，沉淀真空干燥，得茶藨子叶状层菌多糖粗品。

对比实施例2茶藨子叶状层菌中多糖的制备

步骤A：酶解，取忍冬茶藨子叶状层菌子实体50g，粉碎成细粉，加入1500mL温度为50℃蒸馏水、加入7.5g复合酶Ⅰ(含木瓜蛋白酶4.5g、纤维素酶3g)，混匀，置于50℃恒温水浴锅，酶解2小时，酶解完成后加热煮沸灭活；混合液冷却至55℃，加入6g复合酶Ⅱ(含淀粉酶4.5g、果胶酶1.5g)，混匀，置于55℃恒温水浴锅，酶解3小时，酶解完成后加热灭活，过滤，酶解液备用；

步骤B：去杂，步骤B所得酶解液，加入1.5g澄清剂(含壳聚糖0.24g、β-环糊精0.66g、海藻酸钠0.6g)，静置4小时，过滤，得澄清液体，浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖粗品。

对比实施例3茶藨子叶状层菌中多糖的制备

步骤A：挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌子实体50g，粉碎成细粉，加蒸馏水1000mL，混匀后，连接装置，进行水蒸气蒸馏，蒸馏至挥发油量不再增加，挥发油弃之，蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，干燥，备用；

步骤B：浸提，步骤A所得蒸馏后的茶藨子叶状层菌子粉末，加1500mL蒸馏水，置于90℃恒温水浴锅中，重复提取3次，每次2小时提取液合并，过滤，减压浓缩，离心，上清液备用；

步骤C：去杂，步骤B所得上清液，加4倍量无水乙醇，沉淀过夜，离心，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，沉淀真空干燥，得茶藨子叶状层菌多糖粗品。

多糖含量的测定

采用蒽酮-硫酸法，测定实施例1-5、对比实施例1-3中多糖含量。

蒽酮-硫酸法原理：糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。测试结果如下表1所示。

表1各实施例所得茶藨子叶状层菌多糖含量

自表1中结果可知，相对于传统的水提醇沉方式(对比实施例1)，本发明所提供的忍冬茶藨子叶状层菌多糖的制备方法，其多糖粗品的收率明显提高，多糖粗品中多糖纯度较高。对比实施例2中未对忍冬茶藨子叶状层菌子实体提取挥发油，未采用澄清剂对提取液进行纯化，其多糖粗品的收率为2.73％，多糖含量为58.59％，虽优于对比实施例1，但较其他实施例，其提取较差，可见忍冬茶藨子叶状层菌实体中挥发油的存在会影响其多糖的提取；对比实施例3未采用酶解的方式且采用传统醇沉的方式沉降多糖，得到多糖粗品，其多糖粗品的收率为2.61％，多糖含量为46.58％，其多糖粗品的收率偏低，可见复合酶的使用可在一定程度上改变忍冬茶藨子叶状层菌细胞结构，使其中多糖成分在提取时更易溶出，提高多糖粗品的收率，且澄清剂的使用可明显降低粗品中杂质含量，提高多糖纯度。

Claims (10)

1.一种茶藨子叶状层菌多糖的制备方法，包含以下步骤：

步骤A，挥发油提取，取忍冬茶藨子叶状层菌加水蒸馏，蒸馏后的忍冬茶藨子叶状层菌备用；其中水与忍冬茶藨子叶状层菌的液料比为10-30mL/g；

步骤B，酶解，步骤A所得蒸馏后的忍冬茶藨子叶状层菌加水、复合酶Ⅰ，在45℃-55℃温度条件下酶解1-3小时，酶解后加热灭活；混合液冷却，加复合酶Ⅱ，在50℃-60℃温度条件下酶解2-4小时，酶解后加热灭活，酶解液备用；其中，水与忍冬茶藨子叶状层菌的液料比为10-50mL/g、复合酶Ⅰ的加入量为2-8g/L、复合酶Ⅱ的加入量为2-10g/L；

步骤C，去杂，步骤B所得酶解液，加入澄清剂，静置3-6小时，取澄清液体浓缩，干燥，即得忍冬茶藨子叶状层菌多糖提取物；其中澄清剂的加入量为0.1-2g/L。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B中复合酶Ⅰ为胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶中的一种或多种的组合。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的复合酶Ⅰ为木瓜蛋白酶与纤维素酶的组合。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶与纤维素酶的质量比例为（0.5-2）:1。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的复合酶Ⅱ为淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶中的一种或多种的组合。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中复合酶Ⅱ为淀粉酶与果胶酶的组合。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的淀粉酶和果胶酶的质量比例为（1-5）:1。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中澄清剂为明胶、聚乙烯吡咯烷酮、明矾、壳聚糖、β-环糊精、海藻酸钠和单宁中的一种或多种的组合。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的澄清剂为壳聚糖、β-环糊精和海藻酸钠的组合。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖、β-环糊精和海藻酸钠的质量比例为（0.5-1）:（2-5）:（1.5-3）。