CN113694152A - 一种高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法。提取方法包括如下步骤：将薏苡仁浸泡，加热糊化，得浆液；然后降温，加入复合酶酶解，再将浓缩液中加入壳聚糖溶液和ZTC天然澄清剂B组分溶液的混合溶液，然后加入高岭土、白土和皂土的混合物，搅拌，静置反应，再加入ZTC天然澄清剂A组分，反应离心取上清液；将上清液用滤膜过滤，煮沸，灭菌即得。本发明工艺条件温和，易于工业化大生产，无需使用特殊设备，制备得到的薏苡仁提取液稳定性高，活性成分含量高。

Description

一种高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法。
背景技术
薏苡仁是单子叶禾本科植物薏苡干燥成熟的种子。薏米性凉，味甘淡、无毒，在中国古代就作为草本药物加以利用，《本草纲目》中记载，薏仁健脾益胃，补肺清热，去风渗湿。炊饭食，治冷气。煎饮，利小便淋。薏苡仁中含淀粉、多糖、蛋白质、油脂、甾醇类、生物碱和薏苡仁酯等多种活性成分，其中不乏热敏性成分。此外，还含丰富的B族维生素和磷、铁、钙、锌、钾等多种矿物质。
薏苡仁作为食药两用的粮药之一，被列入第一批药食兼用名单，现代研究表明，薏苡仁具有抗癌、抗肿瘤、降血糖、抗炎、抗氧化、抑菌及改善肠道菌群等功效，有重要的开发利用价值。现阶段对薏苡的研究大多还停留在实验理论阶段，薏仁加工产品单一，活性成分的提取率低，造成了资源一定程度的浪费。因此，加强薏苡仁资源的综合开发利用，重点进行薏苡仁提取工艺及关键技术参数的研究，活性成分的高效提取及利用，提高薏苡仁提取物的功效，对推动意苡产业的健康发展具有重要的意义。
中国发明专利CN105037576B公开了一种薏苡仁多种活性成分的提取分离方法，具体为将意苡仁粉碎制粒干燥后，通过超临界CO2萃取技术提取得到薏苡仁酯、薏苡仁油和脱脂；然后将脱脂后的薏苡仁颗粒用高温淀粉酶辅助水提，得到水提液和薏苡仁蛋白；水提液用糖化酶酶解，得到酶解液；酶解液用膜分离技术分离，得到截留液和滤过液。该发明提取薏苡仁方法中含有大量的蛋白质，提取液不稳定，且活性成分的提取率有待提高。
中国发明专利申请CN108783461A公开了超声辅助-复合酶法同步提取薏苡仁活性成分的方法及其微乳液的制备方法和应用，取脱脂薏苡粉干燥粉碎，过筛，加入蒸馏水混匀，加入淀粉酶，超声波辅助萃取，加入碱性蛋白酶，超声波辅助萃取，灭酶，迅速冷却至室温后进行离心分离，得到薏苡仁活性蛋白，醇沉、凝胶层析柱处理，洗脱经超滤膜膜分离，得到薏苡仁活性多糖提取浓缩液。申请人通过该工艺制备薏苡仁活性多糖提取浓缩液，其同样存在稳定性不足的问题，且提取物中薏苡仁酯的含量较低，工艺有待进一步改善。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法，方法简单，易于工业化大生产，且工艺条件温和，无需使用特殊设备。运用该方法制备得到的薏苡仁提取液稳定性高，长期贮存溶液澄清度高，且提取物中薏苡仁多糖和薏苡仁酯等含量高，具有较好的降血糖和降血压作用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将薏苡仁粉碎、过筛，加水浸泡，再加热糊化，得浆液；
(2)降温，加入复合酶酶解，过滤，浓缩得浓缩液；
(3)将浓缩液中加入壳聚糖和ZTC天然澄清剂B组分的混合溶液，然后加入高岭土、白土和皂土的混合物，搅拌，静置、反应；
(4)然后加入ZTC天然澄清剂A组分，搅拌，进行二次反应；放冷，离心，取上清液；
(5)将上清液用滤膜过滤，煮沸，灭菌即得。
优选地，步骤(1)中所述过筛为过65-100目筛；所述加水的质量与薏苡仁的质量的比为12-18:1；所述浸泡的时间为20-40min；所述加热糊化为加热至85-95℃后保温20-40min。
优选地，步骤(2)中所述降温为降至55-65℃，所述复合酶的质量为浆液体积的1-5％；所述复合酶为质量比1：1-3：5-10的糖化酶、菠萝蛋白酶和淀粉酶的混合物。
优选地，所述复合酶的制备方法为将糖化酶、菠萝蛋白酶和淀粉酶混合，加入0.5-1倍量的水溶解分散，然后加入0.2-0.5倍量的浆液在35-40℃下进行酶复活20-30min，即得。
优选地，步骤(2)中所述酶解温度为55-70℃，酶解的pH为5.0-7.5，酶解的时间为2-4h；所述浓缩为减压浓缩至相对密度为0.90-1.10的浓缩液。
优选地，步骤(3)中所述高岭土、白土和皂土的总质量为混合溶液的0.5-2％，所述高岭土、白土和皂土的质量比为1：2-5：2-5，所述静置反应的时间为在65-75℃下反应20-40min。
优选地，步骤(3)中所述混合溶液的加入量为浓缩液质量的2-6％，所述壳聚糖溶液的浓度为0.05-0.1％，所述ZTC天然澄清剂B组分溶液的浓度为0.5-0.8％。
优选地，步骤(4)中所述ZTC天然澄清剂A组分溶液的浓度为0.1-0.5％；所述ZTC天然澄清剂A组分溶液的加入量为步骤(3)混合体系溶液的2-6％；
优选地，所述ZTC天然澄清剂为ZTC天然澄清剂1+1Ⅱ型；所述二次反应为在60-70℃下反应30-50min；所述离心为在3500-4000r/min离心5-10min。
本发明的再一目的是提供上述高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法在制备薏苡仁提取物中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用特定的提取、纯化工艺，制备得到了活性成分浓度高、杂质少、稳定性好的薏苡仁提取液，其治疗高血糖疗效确切。
(2)本发明制备工艺简单，便于工业化大生产，提取条件温和，不采用有机试剂，安全无毒副作用。
(3)本发明将薏苡仁加入预先加热糊化的工艺，对薏苡仁的酶解效果具有显著的增强作用，酶解更完全，提取率更高；
(4)本发明采用特定的复合酶对薏苡仁活性成分进行提取，并加入特定的高岭土、白土和皂土复配，不仅达到了有效去除薏苡仁杂质的作用，且对本发明复合酶吸附较为完全，有效地去除了复合酶，减少了采用高温灭活复合酶的工艺，对提取液中的活性成分起到了最大的保护作用。
(5)本发明加入壳聚糖和ZTC天然澄清剂，用以联合高岭土、白土和皂土协同快速沉降前期絮凝的悬浮物，在最大限度保留活性成分的同时，快速高效地去除鞣质、蛋白质等杂质，进一步提高提取物的纯度，可以保证提取率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述。
实施例1
(1)将薏苡仁粉碎、过100目筛，加12倍量水浸泡20min，再加热至85℃后保温20min糊化，得浆液；
(2)降温至55℃，加入5％复合酶酶解2h，酶解温度为55℃，酶解pH为5.0；过滤，减压浓缩至浓缩液的相对密度为0.9，得浓缩液；
复合酶的制备方法为将1份糖化酶、1份菠萝蛋白酶和5份淀粉酶混合，加入0.5倍量的水溶解分散，然后加入0.2倍量的浆液在35℃下进行酶复活30min，即得。
(3)将上述浓缩液体系中加入3％的浓度为0.05％壳聚糖溶液和浓度为0.5％ZTC天然澄清剂B组分的混合溶液，混合，再加入2％的的高岭土、白土和皂土的混合物，搅拌，在65℃下静置反应20min；其中高岭土、白土和皂土的质量比为1：2：5。
(4)然后加入5％的浓度为0.1％ZTC天然澄清剂A组分，搅拌，在60℃下二次反应50min；放冷，4000r/min离心10min，取上清液；
(5)将上清液过滤得到薏苡仁提取液。
实施例2
(1)将薏苡仁粉碎、过100目筛，加18倍量水浸泡40min，再加热至95℃后保温40min，得浆液；
(2)然后降温至65℃，加入1％复合酶酶解，酶解温度为70℃，酶解的pH为7.0，酶解的时间为4h；过滤，减压浓缩至浓缩液的相对密度为0.95，得浓缩液；
复合酶的制备方法为将1份糖化酶、3份菠萝蛋白酶和10份淀粉酶混合，加入1倍量的水溶解分散，然后加入0.5倍量的浆液在40℃下进行酶复活20min，即得。
(3)将上述浓缩液体系中加入2％的浓度为0.1％壳聚糖溶液和1份浓度为0.8％ZTC天然澄清剂B组分的混合溶液，混合，再加入0.5％的的高岭土、白土和皂土的混合物，搅拌，在75℃下静置反应40min；其中高岭土、白土和皂土的质量比为1：5：3。
(4)然后加入3％的浓度为0.1％ZTC天然澄清剂A组分，搅拌，在70℃下二次反应50min；放冷，3500r/min离心5min，取上清液；
(5)将上清液过滤得到薏苡仁提取液即得。
实施例3
(1)将薏苡仁粉碎过65目筛，加15倍量水浸泡30min，再加热至90℃后保温20min，得浆液；
(2)降温至55℃，加入3％复合酶酶解，酶解温度为65℃，酶解的pH为6.0，酶解的时间为3h；过滤，于50℃下减压浓缩至浓缩液的相对密度为1.10，得浓缩液；
复合酶的制备方法为将1份糖化酶、3份菠萝蛋白酶和2份淀粉酶混合，加入0.5倍量的水溶解分散，然后加入0.2倍量的浆液在35℃下进行酶复活30min，即得。
(3)将上述浓缩液体系中加入5％的浓度为0.05％壳聚糖溶液和浓度为0.5％ZTC天然澄清剂B组分的混合溶液，混合，再加入1.5％的高岭土、白土和皂土的混合物，搅拌，在65℃下静置反应20min；其中高岭土、白土和皂土的质量比为1：3：2。
(4)然后加入2％的浓度为0.1％ZTC天然澄清剂A组分，搅拌，在60℃下二次反应50min；放冷，4000r/min离心10min，取上清液；
(5)将上清液过滤得到薏苡仁提取液即得。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于复合酶的种类及配比不同，具体复合酶将1份糖化酶、3份纤维素酶和2份淀粉酶混合，加入0.5倍量的水溶解分散，然后加入0.2倍量的浆液在35℃下进行酶复活30min，即得。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，步骤(3)中加入的高岭土、白土和皂土的质量比为1:1:1。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于提取方法不同，具体为：
(1)将薏苡仁粉碎过65目筛，加15倍量水浸泡30min，再加热至90℃后保温20min，得浆液；
(2)降温至55℃，加入3％复合酶酶解，酶解温度为65℃，酶解的pH为6.0，酶解的时间为3h；过滤，于50℃下减压浓缩至浓缩液的相对密度为1.10，然后100℃加热酶灭活10分钟，得浓缩液；
复合酶的制备方法为将1份糖化酶、3份菠萝蛋白酶和2份淀粉酶混合，加入0.5倍量的水溶解分散，然后加入0.2倍量的浆液在35℃下进行酶复活30min，即得。
(3)将上述浓缩液中加入5％的浓度为0.05％壳聚糖溶液和浓度为0.5％ZTC天然澄清剂B组分的混合溶液，混合，在65℃下静置反应20min；然后加入2％的浓度为0.1％ZTC天然澄清剂A组分，搅拌，在60℃下二次反应50min；
(4)再加入1.5％的高岭土、白土和皂土的混合物，搅拌10min，放冷，4000r/min离心10min，取上清液；
其中高岭土、白土和皂土的质量比为1：3：2。
(5)将上清液过滤得到薏苡仁提取液，煮沸20min，灭菌即得。
对比例4
本对比例与实施例3的区别在于薏苡仁酶解前，不进行加热糊化。具体步骤如下：
(1)将薏苡仁粉碎过65目筛，加15倍量水浸泡50min；
(2)然后加入3％复合酶酶解，酶解温度为65℃，酶解的pH为6.0，酶解的时间为3h；过滤，于50℃下减压浓缩至浓缩液的相对密度为1.10，得浓缩液；
复合酶的制备方法为将1份糖化酶、3份菠萝蛋白酶和2份淀粉酶混合，加入0.5倍量的水溶解分散，然后加入0.2倍量的浆液在35℃下进行酶复活30min，即得。
(3)将上述浓缩液体系中加入5％的浓度为0.05％壳聚糖溶液和浓度为0.5％ZTC天然澄清剂B组分的混合溶液，混合，再加入1.5％的高岭土、白土和皂土的混合物，搅拌，在65℃下静置反应20min；其中高岭土、白土和皂土的质量比为1：3：2。
(4)然后加入2％的浓度为0.1％ZTC天然澄清剂A组分，搅拌，在60℃下二次反应50min；放冷，4000r/min离心10min，取上清液；
(5)将上清液过滤得到薏苡仁提取液即得。
试验例1稳定性实验
将实施例1-3和对比例1-4的薏苡仁溶液常温放置1个月，观察溶液在0天、15天、1个月的澄明状态，结果见表1。
表1薏苡仁溶液的稳定性测试
分组 0天 15天 1个月
实施例1 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一
实施例2 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一
实施例3 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一
对比例1 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一
对比例2 溶液澄明，均一 溶液浑浊，有絮状物 溶液絮凝，有沉淀
对比例3 溶液澄明，均一 溶液轻微浑浊 溶液浑浊，产生絮凝
对比例4 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一 溶液澄明，均一
试验例2薏苡仁活性成分的提取率
(1)按照2020版中国药典中薏苡仁项下的含量测定方法测定薏苡仁提取液中指标性成分甘油三油酸酯的含量；甘油三油酸酯的百分含量％＝甘油三油酸酯的含量/薏苡仁原料的质量*100％；
(2)用硫酸-苯酚比色法测定薏苡仁多糖的提取率；多糖提取率％＝多糖的含量/薏苡仁原料的质量*100％。
结果如下表2。
表2薏苡仁提取液活性成分含量
Figure BDA0003238220010000061
试验例3薏苡仁提取液的药效学实验
3.1目的：探讨本发明薏苡仁提取液对高血糖小鼠的降血糖作用。
3.2药物：实施例3与对比例3制备得到的薏苡仁提取液，将上述薏苡仁提取液浓缩至浓度为含有2g薏苡仁生药量/mL的薏苡仁药液。
3.3动物分组
健康雄性昆明小鼠，清洁级，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体重20±5g。
按照随机数表法随机分组，分别为空白组、模型组、阳性组、实施例3组、对比例3组。每组10只。
3.4糖尿病小鼠动物模型的制备
对除空白组以外的各组小鼠腹腔注射150mg/kg四氧嘧啶，制备Ⅰ型糖尿病小鼠模型，注射72h后剪尾取血测定血糖，当测定值≥16.0mmol/L时，造模成功。
3.5试验方法
对造模成功的实施例3组、对比例3组小鼠进行灌胃给药，给予相应组薏苡仁药液，给药体积为0.1mL/10g，一天一次；空白组和模型组给予同等剂量的生理盐水，阳性组给予盐酸二甲双胍片混悬液200mg/kg，连续给药3周。末次给药后24h，剪尾取血测定血糖值。
3.6结果分析：
采用SPSS13.0对各组血糖数据进行统计学分析，组间分析采用t检验。统计结果如下表3。
表3薏苡仁提取液降血糖效果
组别 小鼠数量(只) 给药前(mmol/L) 给药后(mmol/L)
空白组 10 9.36±1.21<sup>a</sup> 9.55±2.38<sup>a</sup>
模型组 10 36.16±5.83<sup>b</sup> 33.92±4.29<sup>b</sup>
阳性组 10 36.09±4.76<sup>b</sup> 10.71±2.63<sup>c</sup>
实施例3 10 36.27±1.22<sup>b</sup> 16.34±3.18<sup>d</sup>
对比例3 10 36.19±5.75<sup>b</sup> 20.15±2.32<sup>e</sup>
注：同一列不同字母表示相应组之间具有统计学差异，P＜0.05。
结果分析：由表1可知，本发明提取方法得到的薏苡仁提取液常温放置一个月，溶液无絮凝现象，去除蛋白等杂质的效果好；由表2指标性成分和多糖的含量结果可知，本发明提取方法提取出薏苡仁活性成分提取率高，可以更充分利用原料资源；由结果3可以看出，本发明提取得到的薏苡仁提取液对糖尿病小鼠具有较好的降血糖效果。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将薏苡仁粉碎、过筛，加水浸泡，再加热糊化，得浆液；
(2)降温，加入复合酶酶解，过滤，浓缩得浓缩液；
(3)将浓缩液中加入壳聚糖溶液和ZTC天然澄清剂B组分溶液的混合溶液，然后加入高岭土、白土和皂土的混合物，搅拌，静置反应；
(4)然后加入ZTC天然澄清剂A组分，搅拌，进行二次反应；放冷，离心，取上清液；
(5)将上清液用滤膜过滤即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述过筛为过65-100目筛；所述加水的质量与薏苡仁的质量的比为12-18:1；所述浸泡的时间为20-40min；所述加热糊化为加热至85-95℃后保温20-40min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述降温为降至55-65℃，所述复合酶的质量为浆液体积的1-5％；所述复合酶为质量比为1：1-3：5-10的糖化酶、菠萝蛋白酶和淀粉酶的混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述复合酶的制备方法为将糖化酶、菠萝蛋白酶和淀粉酶混合，加入0.5-1倍量的水溶解分散，然后加入0.2-0.5倍量的浆液在35-40℃下进行酶复活20-30min，即得。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述酶解温度为55-70℃，酶解的pH为5.0-7.5，酶解的时间为2-4h；所述浓缩为减压浓缩至相对密度为0.90-1.10的浓缩液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述高岭土、白土和皂土的总质量为混合溶液的0.5-2％，所述高岭土、白土和皂土的质量比为1：2-5：2-5，所述静置反应的时间为在65-75℃下反应20-40min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述混合溶液的加入量为浓缩液质量的2-6％，所述壳聚糖溶液的浓度为0.05-0.1％，所述ZTC天然澄清剂B组分溶液的浓度为0.5-0.8％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述ZTC天然澄清剂A组分溶液的浓度为0.1-0.5％；所述ZTC天然澄清剂A组分溶液的加入量为步骤(3)混合体系溶液的2-6％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述ZTC天然澄清剂为ZTC天然澄清剂1+1Ⅱ型；所述二次反应为在60-70℃下反应30-50min；所述离心为在3500-4000r/min离心5-10min。
10.一种权利要求1-9任意一项所述的高稳定性酶解法获取薏苡仁提取液的方法在制备薏苡仁提取物中的应用。
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