CN115404252B - 一种黑木耳多糖及其应用和制备方法 - Google Patents

一种黑木耳多糖及其应用和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种黑木耳多糖及其应用和制备方法，属于多糖技术领域。将黑木耳经过脱脂后，在蜗牛酶作用下初步酶解，进一步通过H2O2协同超声波降解提取，在复合酶的作用下深度酶解，经保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的混合发酵，得到的发酵黑木耳多糖在磷酸化试剂作用下发生磷酸化反应，进一步脱蛋白、脱色后，与锌盐螯合后，得到多糖‑锌复合物，即得黑木耳多糖。本发明制得的黑木耳多糖制备方法简单，提取效率高，制得的黑木耳多糖纯度高，溶解性好，易于吸收，具有很好的生理活性，包括很好的抗炎、抗衰老、降血糖等效果，提高免疫力、促进智力发育，降血脂、调节总胆固醇、有效提高良性胆固醇的功效，具有广阔的应用前景。

Description

一种黑木耳多糖及其应用和制备方法
技术领域
本发明涉及多糖技术领域，具体涉及一种黑木耳多糖及其应用和制备方法。
背景技术
黑木耳(Auriculariaauricular)，属于担子菌纲，木耳目、木耳科、木耳属。黑木耳是我国珍贵的药用和食用的胶质真菌，味道鲜美，营养丰富，养血驻颜，祛病延年。传统中医认为，黑木耳性味甘平，具有清肺润肠、滋阴补血、活血化瘀、明目养胃等功效，对崩漏、痔疮、血痢、贫血及便秘等症状有效。现代药理学研究表明，黑木耳的生物活性主要来自其多糖成分，黑木耳多糖作为“生物应答效应物”，具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎症等细胞保护作用，还具有降低血脂、血糖、血液粘度、胆固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗辐射等多种生物功能。
黑木耳多糖作为一种天然保健品也为大家所接受。传统提取技术包括热水浸提法、稀碱液浸提法。其中，热水浸提法是一种国内外常用的比较传统的提取真菌类多糖成份的方法。但是此法所需提取剂蒸馏水经济易得，但是需经多次浸提，得率仍然很低，且费时费料。稀碱液浸提法，分别以蒸馏水和1mol/L NaOH溶液作提取剂，80℃提取3h，发现用蒸馏水作提取剂的多糖含量为1.28％，而用1mol/L NaOH溶液作提取剂的多糖含量为3.52％，后者的多糖含量比前者高出近3倍，且能节省时间和减少原材料及试剂的消耗。但是仍然存在提取效率低的缺陷。
近年来，人们采用酶解提取法、超声波提取法、微波辅助提取法来实现对黑木耳多糖的提取。
酶解提取法即采用酶与热水浸提法相结合的方法，酶多采用一定量的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶，此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。如专利CN107177007B所公开的一种木耳多糖的制备方法。
超声波提取法利用超声波产生的高频震荡、高的加速度和强烈的“空化效应”及搅拌作用，可加速有效生物活性成份进入溶剂，从而提高提取率，缩短提取时间、节约溶剂、并可在低温提取，有利于有效成份的保护。如专利申请CN106496344A所公开的有机黑木耳多糖及其颗粒制备方法。
微波辅助提取具有设备简单、适用范围广、提取率高、节省溶剂、节省时间、节能、不产生噪音和污染等众多优点，利用微波强化固液浸取过程是一种颇具发展潜力的新型辅助提取技术。如专利申请CN105367680A所公开的一种微波辅助提取黑木耳多糖的方法。
然而，上述黑木耳多糖的提取方法，虽然能够有效地提高多糖的提取率，但要么耗时长，要么产量低，要么成本高，无法满足市场需求。另外，黑木耳中性多糖由于其溶解性差，极大的限制了其进一步的研究和在食品、药品开发中的应用，同时，在黑木耳多糖提取与应用过程中如何确保其活性最大程度的保留也是应该考虑的主要因素。
发明内容
本发明的目的在于提出一种黑木耳多糖及其应用和制备方法，制备方法简单，提取效率高，制得的黑木耳多糖纯度高，溶解性好，易于吸收，具有很好的生理活性，不仅具有很好的抗氧化、抗炎、抗衰老、降血糖等效果，同时，还具有提高免疫力、促进智力发育，以及降血脂、调节总胆固醇、有效提高良性胆固醇的功效，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种黑木耳多糖的制备方法，将黑木耳经过脱脂后，在蜗牛酶作用下初步酶解，进一步通过H2O2协同超声波降解提取，在复合酶的作用下深度酶解，然后经过保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的混合发酵，得到的发酵黑木耳多糖在磷酸化试剂作用下发生磷酸化反应，进一步脱蛋白、脱色后，与锌盐螯合后，得到多糖-锌复合物，即得黑木耳多糖。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.脱脂：将黑木耳干燥，粉碎后，经过超临界流体萃取技术脱脂，得到脱脂黑木耳；
S2.初步酶解：将步骤S1脱脂黑木耳加入水中，加入蜗牛酶，酶解，灭酶，浓缩，干燥，得到初步酶解产物；
S3.H2O2协同超声波提取：将步骤S2制得的初步酶解产物加入H2O2溶液中，超声波处理，加入亚硫酸氢钠除去H2O2，醇沉，离心，干燥，得到黑木耳粗糖提取物；
S4.深度酶解：将步骤S3制得的粗糖提取物溶于水中，加入复合酶酶解，灭酶，得到深度酶解提取液；
S5.菌种的活化：将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌分别在高氏培养基中划线，活化培养，得到菌种种子液；
S6.发酵：将步骤S5制得的菌种种子液接种至步骤S4制得的深度酶解提取液中，发酵培养，浓缩，醇沉，离心，得到发酵黑木耳多糖；
S7.磷酸化：将步骤S6制得的发酵多糖加入水中，加入硫酸钠和磷酸化试剂，调节pH值为8.8-9.2，加热反应，透析，浓缩，得到磷酸化黑木耳多糖液；
S8.脱蛋白：将步骤S7得到的磷酸化黑木耳多糖液加入Sevage试剂中，搅拌反应，离心除去变性蛋白沉淀，重复1-3次，合并液体，减压除去溶剂，得到脱蛋白黑木耳多糖；
S9.脱色：将活性炭和步骤S8制得的脱蛋白黑木耳多糖液加入水中，搅拌吸附，过滤，醇沉，离心，得到精制黑木耳多糖；
S10.螯合锌：将步骤S9制得的精制黑木耳多糖和柠檬酸三钠溶于水中，加入锌盐，调节溶液pH值为7.2-7.5，加热搅拌反应，过滤，醇沉，离心，收集固体，冷冻干燥，得到黑木耳多糖。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述超临界流体萃取技术的条件为CO2流量为7-12L/h，萃取釜压力为12-25MPa，温度为45-60℃，提取时间为1-2h；所述脱脂黑木耳、蜗牛酶的质量比为100∶3-5，所述酶解温度为40-50℃，时间为1-2h；步骤S3中所述H2O2溶液中H2O2浓度为2-5wt％；所述超声波处理的功率为1500-2000W，处理时间为30-50min；步骤S4中所述复合酶选自β-葡聚糖酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶中的至少两种；所述粗糖提取物和复合酶的质量比为100∶5-7，所述酶解温度为40-45℃，时间为3-5h。
作为本发明的进一步改进，所述复合酶为β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的复配混合物，质量比为3-5∶1。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述活化培养的条件为微缺氧条件下，温度为40-45℃，时间为18-24h，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL；步骤S6中保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为3-5％、1-3％、1-2％；所述发酵培养的条件为微缺氧条件下，温度为40-45℃，时间为36-48h；所述微缺氧条件为O2含量为5-7％，CO2含量为5-10％，余量为氮气，此中％为体积百分比含量。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述磷酸化试剂选自多聚磷酸、三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸、五氧化二磷中的至少两种；所述发酵多糖、硫酸钠、磷酸化试剂和水的质量比为10∶30-50∶2-4∶100；所述加热反应的温度为70-90℃，时间为3-5h，所述透析的透析袋孔径为5000-15000D，时间为24-48h；步骤S8中所述磷酸化黑木耳多糖液和Sevage试剂的质量比为1∶3-7；所述搅拌反应的时间为20-30min；步骤S9中所述脱蛋白黑木耳多糖和活性炭的质量比为100∶12-15；所述搅拌吸附的时间为30-50min；步骤S10中所述黑木耳多糖、柠檬酸三钠、锌盐的质量比为100∶5-12∶22-27；所述加热搅拌反应的温度为45-55℃，时间为1-2h，搅拌转速为300-500r/min；所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌、硝酸锌中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸的混合物，质量比为3-7∶2∶0.2-0.4。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.脱脂：将黑木耳干燥，粉碎后，经过超临界流体萃取技术脱脂，得到脱脂黑木耳；
所述超临界流体萃取技术的条件为CO2流量为7-12L/h，萃取釜压力为12-25MPa，温度为45-60℃，提取时间为1-2h；
S2.初步酶解：将100重量份步骤S1脱脂黑木耳加入200重量份水中，加入3-5重量份蜗牛酶，40-50℃酶解1-2h，100-110℃灭酶10-15min，有机膜浓缩至原体积的1/3-1/4，干燥，得到初步酶解产物；
S3.H2O2协同超声波提取：将100重量份步骤S2制得的初步酶解产物加入100重量份2-5wt％的H2O2溶液中，1500-2000W超声波处理30-50min，加入7-12重量份亚硫酸氢钠除去H2O2，醇沉，离心，干燥，得到黑木耳粗糖提取物；
S4.深度酶解：将100重量份步骤S3制得的粗糖提取物溶于100重量份水中，加入5-7重量份复合酶，40-45℃酶解3-5h，100-110℃灭酶10-15min，得到深度酶解提取液；
所述复合酶为β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的复配混合物，质量比为3-5∶1；
S5.菌种的活化：将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，40-45℃活化培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为108-109cfu/mL；
S6.发酵：将步骤S5制得的菌种种子液接种至步骤S4制得的深度酶解提取液中，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为3-5％、1-3％、1-2％，微缺氧条件下，40-45℃发酵培养36-48h，浓缩，醇沉，离心，得到发酵黑木耳多糖；
微缺氧条件为O2含量为5-7％，CO2含量为5-10％，余量为氮气，此中％为体积百分比含量；
S7.磷酸化：将10重量份步骤S6制得的发酵多糖加入100重量份水中，加入30-50重量份硫酸钠和2-4重量份磷酸化试剂，调节pH值为8.8-9.2，70-90℃加热反应3-5h，用袋孔径为5000-15000D透析袋透析24-48h，有机膜浓缩至原体积的1/3-1/4，得到磷酸化黑木耳多糖液；
所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸的混合物，质量比为3-7∶2∶0.2-0.4；
S8.脱蛋白：将10重量份步骤S7得到的磷酸化黑木耳多糖液加入30-70重量份Sevage试剂中，搅拌反应20-30min，离心除去变性蛋白沉淀，重复1-3次，合并液体，减压除去溶剂，得到脱蛋白黑木耳多糖；
S9.脱色：将12-15重量份活性炭和100重量份步骤S8制得的脱蛋白黑木耳多糖加入200重量份水中，搅拌吸附30-50min，过滤，醇沉，离心，得到精制黑木耳多糖；
S10.螯合锌：将100重量份步骤S9制得的精制黑木耳多糖和5-12重量份柠檬酸三钠溶于200重量份水中，加入22-27重量份锌盐，调节溶液pH值为7.2-7.5，加热至45-55℃，300-500r/min搅拌反应1-2h，过滤，醇沉，离心，收集固体，冷冻干燥，得到黑木耳多糖；
所述醇沉的方法为加入无水乙醇至体系中乙醇含量为75-85％，沉淀12-24h。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的黑木耳多糖。
本发明进一步保护一种上述黑木耳多糖在制备降血脂、调节总胆固醇、有效提高良性胆固醇的产品中的应用。
本发明具有如下有益效果：本发明将经过脱脂处理后的脱脂黑木耳用蜗牛酶酶解，其含有大量的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、阿尔法淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸转移酶等多种具有生物活性的混合酶，在蜗牛酶酶解作用下，有助于真菌黑木耳细胞的破壁，能使其细胞内的活性物质多糖更好地释放出来。
进一步，将经过蜗牛酶酶解的初步酶解产物经过H2O2协同超声波提取，初步酶解产物此时大量的细胞壁已经破裂，胞内多糖溶出，而H2O2是一种强氧化剂，可以作为一种氧化剂使有机化合物发生氧化降解反应，但是单独的H2O2氧化降解效率低，经过超声波辅助处理后，能够产生较高的量子产率羟基。超声波能降低该反应的活化能，从而显著增加降解速率，缩短反应时间。超声波能促进H2O2的解离，而H2O2作为协同措施，可以有效提高降解率。超声波产生高频物理振动、降低提取体系内部压强引起空化效应，迅速进一步破坏提取物细胞壁，从而使得90％以上的细胞破壁，致使提取物活性物质的的粒子扩散强度增大，促进粒子间摩擦碰撞迅速产热，破坏细胞壁，显著降低提取时长，提高提取效率。
多糖酶解主要是通过改变多糖的分子质量、分子结构、溶解度及取代基，酶解主要是将多糖的种类、数量以及理化性质进行改变、生物活性的增强。黑木耳多糖主要由水溶性β-D-葡聚糖、水不溶性β-D-葡聚糖和两种酸性杂多糖构成，且水溶性β-D-葡聚糖、水不溶性β-D-葡聚糖都是由β-1，3-糖苷键连接而成。β-葡聚糖酶可高效降解β-1，3-糖苷键、β-1，4-糖苷键，使多糖改性增溶。α-葡萄糖苷酶具有水解和转糖苷的双重作用，水解作用是可以使α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非还原性末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖；转糖苷作用可以将游离出的葡萄糖残基以α-1，6糖苷键转移到另一个葡萄糖或麦芽糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖，提高多糖产物的消化吸收性能，同时降低甜度；β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶两者的协同作用下，可以使黑木耳多糖从高分子量降低成低分子量，可以提高其生物活性，并且低分子多糖更易被人体吸收。
保加利亚乳杆菌，兼性厌氧，能发酵葡萄糖、果糖和乳糖，但不能利用蔗糖。嗜热链球菌，兼性厌氧，发酵乳糖，不发酵菊糖、甘露醇。长双歧杆菌，兼性厌氧，可利用乳糖，核糖，棉子糖，木糖，甘露糖，果糖，半乳糖，蔗糖，麦芽糖，蜜二糖等。将嗜热链球菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌混合发酵培养，比各自单独发酵培养更好，这是因为保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌分解提供乳酸、氨基酸等，为嗜热链球菌的生长提供了营养物质，而嗜热链球菌产生的甲酸、短链脂肪酸、叶酸等，能促进保加利亚乳杆菌和长双歧杆菌的生长，嗜热链球菌发酵初期，产酸快，pH降至6.2-6.7左右时，促进长双歧杆菌大量增殖，进一步产生大量的小分子酸，pH继续降低至4左右时，保加利亚乳杆菌大量增殖，产生大量的乳酸及氨基酸，反过来促进嗜酸链球菌和长双歧杆菌的生长，三者相辅相成，互相促进，能起到很好的降解粗多糖的效果。
本发明在微缺氧条件发酵提取，一方面有助于兼性厌氧菌的增殖和生长，同时，微缺氧条件的提取可有效防止物质氧化，使生成的生物活性物质发挥出更好的功效。
多糖的生物活性取决于聚合物的分子性质，包括单糖的分子量，多糖链的构象，支链聚合的程度和糖苷键的类型等。本发明通过将发酵黑木耳多糖经磷酸化修饰，化学基团取代多糖上的羟基后，结构发生变化，从而使得更多的羟基被暴露，不仅抗氧化活性增强，还提高了多糖的抗炎、抗衰老、降血糖等效果，同时，进一步提高了多糖的溶解性，使得多糖更容易被吸收。
经过脱蛋白、脱色后的精制黑木耳多糖进一步与锌盐反应，表面的羟基等螯合基团通过络合作用与Zn离子配位，形成稳定的多糖-锌复合物，制得的多糖-锌复合物不仅具有很好的抗氧化、抗炎、抗衰老、降血糖等效果，同时，还具有提高免疫力、促进智力发育，以及降血脂、调节总胆固醇、有效提高良性胆固醇的功效。
本发明制得的黑木耳多糖制备方法简单，提取效率高，制得的黑木耳多糖本纯度高，溶解性好，易于吸收，具有很好的生理活性，通过美国FDA标准第二期临床试验证明，不仅具有很好的抗氧化、抗炎、抗衰老、降血糖等效果，同时，还具有提高免疫力、促进智力发育，以及降血脂、调节总胆固醇、有效提高良性胆固醇的功效，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例4中各组小鼠肝指数的对比图；
图2为本发明测试例4中各组小鼠体重的对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
蜗牛酶，破壁率80％-90％、最适pH为5.8-7.2，购于中国生物技术有限公司。β-葡聚糖酶，20000U/g，购于河南万邦实业有限公司。α-葡萄糖苷酶，20000U/g，购于上海源叶生物科技有限公司。
保加利亚乳杆菌，菌株编号为保加利亚乳杆菌LB-Z16，嗜热链球菌，菌株编号为嗜热链球菌STN26，长双歧杆菌，菌株编号为长双歧杆菌BLG-19，均购于山东中科嘉亿生物工程有限公司。
Sevage试剂现配现用，为氯仿与正丁醇按照体积比5∶1混合均匀得到。
实施例1
本实施例提供一种黑木耳多糖包括以下步骤：
S1.脱脂：将黑木耳干燥，粉碎后，经过超临界流体萃取技术脱脂，得到脱脂黑木耳；
所述超临界流体萃取技术的条件为CO2流量为7L/h，萃取釜压力为12MPa，温度为45℃，提取时间为1h；
S2.初步酶解：将100重量份步骤S1脱脂黑木耳加入200重量份水中，加入3重量份蜗牛酶，40℃酶解1h，100℃灭酶10min，有机膜浓缩至原体积的1/3，70℃干燥2h，得到初步酶解产物；
S3.H2O2协同超声波提取：将100重量份步骤S2制得的初步酶解产物加入100重量份2wt％的H2O2溶液中，1500W超声波处理30min，加入7重量份亚硫酸氢钠除去H2O2，醇沉，3000r/min离心15min，70℃干燥2h，得到黑木耳粗糖提取物；
S4.深度酶解：将100重量份步骤S3制得的粗糖提取物溶于100重量份水中，加入5重量份复合酶，40℃酶解3h，100℃灭酶10min，得到深度酶解提取液；
所述复合酶为β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的复配混合物，质量比为3∶1；
S5.菌种的活化：将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，40℃活化培养18h，得到菌种种子液，含菌量为108cfu/mL；
S6.发酵：将步骤S5制得的菌种种子液接种至步骤S4制得的深度酶解提取液中，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为3％、1％、1％，微缺氧条件下，40℃发酵培养36h，浓缩，醇沉，3000r/min离心15min，得到发酵黑木耳多糖；
微缺氧条件为O2含量为5％，CO2含量为5％，余量为氮气，此中％为体积百分比含量；
S7.磷酸化：将10重量份步骤S6制得的发酵多糖加入100重量份水中，加入30重量份硫酸钠和2重量份磷酸化试剂，调节pH值为8.8，70℃加热反应3h，用袋孔径为5000D透析袋透析24h，有机膜浓缩至原体积的1/3，得到磷酸化黑木耳多糖液；
所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸的混合物，质量比为3∶2∶0.2；
将经过磷酸化后的磷酸化黑木耳多糖液进一步醇沉，3000r/min离心15min，固体冷冻干燥后的样品进行红外光谱扫描，在3340cm-1处为-OH的吸收峰，2911cm-1处为CH2不对称伸缩振动峰，1612cm-1处为C＝O振动峰，1201cm-1处为P＝O的伸缩振动峰，887cm-1处为P-O-C的特征吸收峰，可见，磷酸基团成功连接到多糖分子链上。
S8.脱蛋白：将10重量份步骤S7得到的磷酸化黑木耳多糖液加入30重量份Sevage试剂中，搅拌反应20min，离心除去变性蛋白沉淀，重复1次，合并液体，减压除去溶剂，得到脱蛋白黑木耳多糖液；
S9.脱色：将12重量份活性炭和100重量份步骤S8制得的脱蛋白黑木耳多糖加入200重量份水中，搅拌吸附30min，过滤，醇沉，3000r/min离心15min，得到精制黑木耳多糖；
S10.螯合锌：将100重量份步骤S9制得的精制黑木耳多糖和5重量份柠檬酸三钠溶于200重量份水中，加入22重量份氯化锌，调节溶液pH值为7.2，加热至45℃，300r/min搅拌反应1h，过滤，醇沉，3000r/min离心15min，收集固体，冷冻干燥，得到黑木耳多糖；
本实施例中的醇沉的方法为加入无水乙醇至体系中乙醇含量为75％，沉淀12h。
实施例2
本实施例提供一种黑木耳多糖包括以下步骤：
S1.脱脂：将黑木耳干燥，粉碎后，经过超临界流体萃取技术脱脂，得到脱脂黑木耳；
所述超临界流体萃取技术的条件为CO2流量为12L/h，萃取釜压力为25MPa，温度为60℃，提取时间为2h；
S2.初步酶解：将100重量份步骤S1脱脂黑木耳加入200重量份水中，加入5重量份蜗牛酶，50℃酶解2h，110℃灭酶15min，有机膜浓缩至原体积的1/4，70℃干燥2h，得到初步酶解产物；
S3.H2O2协同超声波提取：将100重量份步骤S2制得的初步酶解产物加入100重量份5wt％的H2O2溶液中，2000W超声波处理50min，加入12重量份亚硫酸氢钠除去H2O2，醇沉，3000r/min离心15min，70℃干燥2h，得到黑木耳粗糖提取物；
S4.深度酶解：将100重量份步骤S3制得的粗糖提取物溶于100重量份水中，加入7重量份复合酶，45℃酶解5h，110℃灭酶15min，得到深度酶解提取液；
所述复合酶为β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的复配混合物，质量比为5∶1；
S5.菌种的活化：将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，45℃活化培养24h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S6.发酵：将步骤S5制得的菌种种子液接种至步骤S4制得的深度酶解提取液中，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为5％、3％、2％，微缺氧条件下，45℃发酵培养48h，浓缩，醇沉，3000r/min离心15min，得到发酵黑木耳多糖；
微缺氧条件为O2含量为7％，CO2含量为10％，余量为氮气，此中％为体积百分比含量；
S7.磷酸化：将10重量份步骤S6制得的发酵多糖加入100重量份水中，加入50重量份硫酸钠和4重量份磷酸化试剂，调节pH值为9.2，90℃加热反应5h，用袋孔径为15000D透析袋透析48h，有机膜浓缩至原体积的1/4，得到磷酸化黑木耳多糖液；
所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸的混合物，质量比为7∶2∶0.4；
S8.脱蛋白：将10重量份步骤S7得到的磷酸化黑木耳多糖液加入70重量份Sevage试剂中，搅拌反应30min，离心除去变性蛋白沉淀，重复3次，合并液体，减压除去溶剂，得到脱蛋白黑木耳多糖液；
S9.脱色：将15重量份活性炭和100重量份步骤S8制得的脱蛋白黑木耳多糖加入200重量份水中，搅拌吸附50min，过滤，醇沉，3000r/min离心15min，得到精制黑木耳多糖；
S10.螯合锌：将100重量份步骤S9制得的精制黑木耳多糖和12重量份柠檬酸三钠溶于200重量份水中，加入27重量份硫酸锌，调节溶液pH值为7.5，加热至55℃，500r/min搅拌反应2h，过滤，醇沉，3000r/min离心15min，收集固体，冷冻干燥，得到黑木耳多糖；
本实施例中的醇沉的方法为加入无水乙醇至体系中乙醇含量为85％，沉淀24h。
实施例3
本实施例提供一种黑木耳多糖包括以下步骤：
S1.脱脂：将黑木耳干燥，粉碎后，经过超临界流体萃取技术脱脂，得到脱脂黑木耳；
所述超临界流体萃取技术的条件为CO2流量为10L/h，萃取釜压力为17MPa，温度为52℃，提取时间为1.5h；
S2.初步酶解：将100重量份步骤S1脱脂黑木耳加入200重量份水中，加入4重量份蜗牛酶，45℃酶解1.5h，105℃灭酶12min，有机膜浓缩至原体积的1/4，70℃干燥2h，得到初步酶解产物；
S3.H2O2协同超声波提取：将100重量份步骤S2制得的初步酶解产物加入100重量份3.5wt％的H2O2溶液中，1700W超声波处理40min，加入10重量份亚硫酸氢钠除去H2O2，醇沉，3000r/min离心15min，70℃干燥2h，得到黑木耳粗糖提取物；
S4.深度酶解：将100重量份步骤S3制得的粗糖提取物溶于100重量份水中，加入6重量份复合酶，42℃酶解4h，105℃灭酶12min，得到深度酶解提取液；
所述复合酶为β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的复配混合物，质量比为4∶1；
S5.菌种的活化：将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，42℃活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S6.发酵：将步骤S5制得的菌种种子液接种至步骤S4制得的深度酶解提取液中，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为4％、2％、1.5％，微缺氧条件下，42℃发酵培养42h，浓缩，醇沉，3000r/min离心15min，得到发酵黑木耳多糖；
微缺氧条件为O2含量为6％，CO2含量为7％，余量为氮气，此中％为体积百分比含量；
S7.磷酸化：将10重量份步骤S6制得的发酵多糖加入100重量份水中，加入40重量份硫酸钠和3重量份磷酸化试剂，调节pH值为9，80℃加热反应4h，用袋孔径为10000D透析袋透析36h，有机膜浓缩至原体积的1/4，得到磷酸化黑木耳多糖液；
所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸的混合物，质量比为5∶2∶0.3；
S8.脱蛋白：将10重量份步骤S7得到的磷酸化黑木耳多糖液加入50重量份Sevage试剂中，搅拌反应25min，离心除去变性蛋白沉淀，重复2次，合并液体，减压除去溶剂，得到脱蛋白黑木耳多糖液；
S9.脱色：将13重量份活性炭和100重量份步骤S8制得的脱蛋白黑木耳多糖加入200重量份水中，搅拌吸附40min，过滤，醇沉，3000r/min离心15min，得到精制黑木耳多糖；
S10.螯合锌：将100重量份步骤S9制得的精制黑木耳多糖和9重量份柠檬酸三钠溶于200重量份水中，加入25重量份硝酸锌，调节溶液pH值为7.3，加热至50℃，400r/min搅拌反应1.5h，过滤，醇沉，3000r/min离心15min，收集固体，冷冻干燥，得到黑木耳多糖；
本实施例中的醇沉的方法为加入无水乙醇至体系中乙醇含量为80％，沉淀18h。
实施例4
与实施例3相比，复合酶为单一的β-葡聚糖酶，其他条件均不改变。
实施例5
与实施例3相比，复合酶为单一的α-葡萄糖苷酶，其他条件均不改变。
对比例1
与实施例3相比，未经过步骤S2初步酶解，其他条件均不改变。
对比例2
与实施例3相比，步骤S3中3.5wt％的H2O2溶液替换为等量的水，其他条件均不改变。
对比例3
与实施例3相比，步骤S3中未进行超声波处理，其他条件均不改变。
对比例4
与实施例3相比，未经过步骤S3 H2O2协同超声波提取，去条件均不改变。
对比例5
与实施例3相比，未经过步骤S4深度酶解，其他条件均不改变。
对比例6
与实施例3相比，步骤S6中未接种保加利亚乳杆菌，其他条件均不改变。
嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为6％、1.5％。
对比例7
与实施例3相比，步骤S6中未接种嗜热链球菌，其他条件均不改变。
保加利亚乳杆菌和长双歧杆菌的接种量分别为6％、1.5％。
对比例8
与实施例3相比，步骤S6中未接种长双歧杆菌，其他条件均不改变。
保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为4％、3.5％。
对比例9
与实施例3相比，未进行步骤S5、S6，其他条件均不改变。
对比例10
与实施例3相比，未进行步骤S7磷酸化，其他条件均不改变。
对比例11
与实施例3相比，未进行步骤S8脱蛋白，其他条件均不改变。
对比例12
与实施例3相比，未进行步骤S10螯合锌，其他条件均不改变。
测试例1多糖提取率的测定
采用苯酚硫酸法测试，分别取实施例1-5和对比例1-11步骤S9制得的精制黑木耳多糖样品100mg左右于试管中，加水补至2.0mL，然后分别加入6％苯酚1.0mL，摇匀，10s内滴加98wt％的浓硫酸5.0mL，迅速摇匀，静置15min，摇匀，室温放置30min，测定其490nm的吸光度，以2.0mL水按同样操作为空白对照。根据样品的OD值，用不同浓度的葡萄糖采用同样方法绘制标准曲线，回归方程为y＝12.974x+0.0125，R2＝0.9991，根据标准曲线得到各组多糖样品中多糖的含量C，计算各组黑木耳多糖的得率(％)。
黑木耳多糖的得率(％)＝CVM1/M2M0×100％
式中：C-多糖样品中多糖的含量(mg/mL)；M1-多糖样品的重量(g)；M0-步骤S1中黑木耳的重量(g)；V为溶液的总体积(mL)，即为2mL；M2为精制黑木耳多糖样品的重量(mg)。
结果见表1。
组别 提取率(％)
实施例1 7.56
实施例2 7.62
实施例3 7.70
实施例4 7.22
实施例5 7.18
对比例1 7.31
对比例2 7.04
对比例3 6.98
对比例4 6.52
对比例5 7.07
对比例6 7.34
对比例7 7.28
对比例8 7.32
对比例9 7.25
对比例10 7.39
对比例11 7.19
由上表可知，本发明实施例1-3中多糖的提取率较大，明显优于实施例4-5以及对比例1-11。
测试例2溶解度的测定
根据2005版药典方法测定实施例1-5和对比例1-12制得的黑木耳多糖以及市售黑木耳多糖(含量大于99％，购于兰州沃特莱斯生物科技有限公司)的溶解度，结果见表2。
表2
Figure BDA0003825832140000191
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Figure BDA0003825832140000201
由上表可知，采用本发明实施例1-3所述的方法制得的黑木耳多糖明显提高了黑木耳多糖的溶解度。
测试例3
将实施例1-5和对比例1-12制得的黑木耳多糖进行抗氧化试验研究。
1、DPPH自由基清除能力
依次向比色管中添加3mL的10mmol/L DPPH-乙醇溶液，1mL的1mg/mL实施例1-5或对比例1-12制得的黑木耳多糖用水配制成的多糖样液或1mg/mL的维生素C溶液，摇匀后，在黑暗中静置30min。于517nm处测定吸光值，记为A1；
向比色管中添加3mL的5mmol/L DPPH-乙醇溶液，1mL无水乙醇，摇匀后，在黑暗中静置30min。于517nm处测定吸光值，记为A0；
依次向比色管中添加3mL蒸馏水，1mL的1mg/mL实施例1-5或对比例1-12制得的黑木耳多糖用水配制成的多糖样液，摇匀后，在黑暗中静置30min。于517nm处吸光值分别记为A2。
DPPH自由基的清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
2、羟基自由基清除能力
依次向比色管中加入1mL的10mmol/L FeSO4，1mL的20mmol/La-脱氧核糖溶液，1mL的1mg/mL实施例1-5或对比例1-12制得的黑木耳多糖用水配制成的多糖样液或1mg/mL的维生素C溶液，加入1mL 10mmol/L H2O2后摇匀，在37℃下反应30min，于510nm处测定样液的吸光值，记为A1。
向比色管中加入1mL的9mmol/L FeSO4，1mL的9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1mL蒸馏水，加入1mL 8.8mmol/L H2O2后摇匀，在37℃下反应30min，于510nm处测定样液的吸光值，记为A0；
依次向比色管中加入1mL的9mmol/L FeSO4，1mL的9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1mL的1mg/mL实施例1-5或对比例1-12制得的黑木耳多糖用水配制成的多糖样液或1mg/mL的维生素C溶液，加入1mL蒸馏水后摇匀，在37℃下反应30min，于510nm处测定样液的吸光值，记为A2。
羟基自由基的清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
3、超氧阴离子自由基清除能力
依次向比色管中加入3mL的0.05mol/L，pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液，1mL的1mg/mL实施例1-5或对比例1-12制得的黑木耳多糖用水配制成的多糖样液或1mg/mL的维生素C溶液，2mL的60mmol/L邻苯三酚溶液，10s内混合，每隔30s测定325nm处吸光值，直至300s，A0＝A300s-A30s；
以1mL蒸馏水替代样液，325nm处吸光值，A1＝A300s-A30s。
超氧阴离子自由基的清除率(％)＝(A0-A1)/A1×100％
结果见表3。
表3
Figure BDA0003825832140000221
由上表可知，本发明实施例1-3制得的黑木耳多糖具有良好的抗氧化活性，对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基均有较高的清除率。
测试例3降血脂试验
选择7周龄健康雄性SD大鼠，在温度为22±3℃，相对湿度为60±10％进行1周的适应性饲养。1周后，将大鼠随机平均分为19组，分别为正常组、模型组、实施例1-5组和对比例1-12组，每组6只，进行6周的干预性饲养。正常组饲喂常规饲料，其他组饲喂高脂饲料。实施例1-5组和对比例1-12组大鼠每天分别灌胃相应制得的黑木耳多糖200mg/kg 1次，每次2mL，模型组灌胃等量的生理盐水。试验过程中大鼠均自由进食和饮水，每隔5d称重。
分别于干预初始时(0week)对各组大鼠称重。试验结束时(6week)，将大鼠隔夜禁食12h后于次日尾尖取血1mL，离心后，取上清液作为血清样品。并随后每组随机解剖大鼠，分离肝脏组织并称重。大鼠血清样品采用试剂盒法检测大鼠血浆中血清总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度，计算HDL-C/TC的比值。
结果见表4。
Figure BDA0003825832140000231
Figure BDA0003825832140000241
注释：#为与正常组相比，P＜0.05；*为与模型组相比，P＜0.05。
TG和TC是评价胆固醇代谢的重要指标之一，HDL-C的作用之一是将肝脏外组织的胆固醇逆向转运回肝脏。由上表可知，本发明实施例1-3制得的黑木耳多糖能明显降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C的含量，提高HDL-C含量。同时，能显著提高HDL-C/TC的比值，从而起到稳定的降血脂、调节总胆固醇、有效提高良性胆固醇的效果。
解剖大鼠、分离其肝脏并称重，计算肝指数。
肝指数＝肝脏鲜重(g)/体重(g)
肝指数结果见图1。肝脏是脂质代谢的重要场所，过量脂肪的摄入在肝内会堆积从而引起肝脏脂质代谢障碍，导致肝脏负担加重，肝脏重量提高，肝指数的增加说明高脂饮食造成了大鼠的肝脏损伤。由图可知，本发明实施例1-3制得的黑木耳多糖能显著降低大鼠的肝指数，与正常组大鼠水平相当。
体重结果见图2。由图可知，本发明实施例1-3制得的黑木耳多糖能显著抑制高脂饮食大鼠体重的增长，预防大鼠肥胖。
实施例4、5与实施例3相比，复合酶为单一的β-葡聚糖酶或α-葡萄糖苷酶，制得的黑木耳多糖的溶解度下降，提取率下降，抗氧化效果下降，TC、TG、LDL-C的含量升高。对比例5与实施例3相比，未经过步骤S4深度酶解，制得的黑木耳多糖的溶解度明显下降，提取率下降，抗氧化效果明显下降，TC、TG、LDL-C的含量明显升高。多糖酶解主要是通过改变多糖的分子质量、分子结构、溶解度及取代基，酶解主要是将多糖的种类、数量以及理化性质进行改变、生物活性的增强。黑木耳多糖主要由水溶性β-D-葡聚糖、水不溶性β-D-葡聚糖和两种酸性杂多糖构成，且水溶性β-D-葡聚糖、水不溶性β-D-葡聚糖都是由β-1，3-糖苷键连接而成。β-葡聚糖酶可高效降解β-1，3-糖苷键、β-1，4-糖苷键，使多糖改性增溶。α-葡萄糖苷酶具有水解和转糖苷的双重作用，水解作用是可以使α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非还原性末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖；转糖苷作用可以将游离出的葡萄糖残基以α-1，6糖苷键转移到另一个葡萄糖或麦芽糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖，提高多糖产物的消化吸收性能，同时降低甜度；β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶两者的协同作用下，可以使黑木耳多糖从高分子量降低成低分子量，可以提高其生物活性，并且低分子多糖更易被人体吸收。
对比例1与实施例3相比，未经过步骤S2初步酶解，制得的黑木耳多糖的溶解度下降，提取率下降，抗氧化效果下降，TC、TG、LDL-C的含量升高，HDL-C含量下降。本发明将经过脱脂处理后的脱脂黑木耳用蜗牛酶酶解，其含有大量的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、阿尔法淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸转移酶等多种具有生物活性的混合酶，在蜗牛酶酶解作用下，有助于真菌黑木耳细胞的破壁，能使其细胞内的活性物质多糖更好地释放出来。
对比例2与实施例3相比，步骤S3中3.5wt％的H2O2溶液替换为等量的水。对比例3与实施例3相比，步骤S3中未进行超声波处理，制得的黑木耳多糖的溶解度下降，提取率下降，抗氧化效果下降。对比例4与实施例3相比，未经过步骤S3 H2O2协同超声波提取，制得的黑木耳多糖的溶解度明显下降，提取率下降，抗氧化效果明显下降，TC、TG、LDL-C的含量明显升高，HDL-C含量下降，体重增加，肝指数增加。将经过蜗牛酶酶解的初步酶解产物经过H2O2协同超声波提取，初步酶解产物此时大量的细胞壁已经破裂，胞内多糖溶出，而H2O2是一种强氧化剂，可以作为一种氧化剂使有机化合物发生氧化降解反应，但是单独的H2O2氧化降解效率低，经过超声波辅助处理后，能够产生较高的量子产率羟基。超声波能降低该反应的活化能，从而显著增加降解速率，缩短反应时间。超声波能促进H2O2的解离，而H2O2作为协同措施，可以有效提高降解率。超声波产生高频物理振动、降低提取体系内部压强引起空化效应，迅速进一步破坏提取物细胞壁，从而使得90％以上的细胞破壁，致使提取物活性物质的的粒子扩散强度增大，促进粒子间摩擦碰撞迅速产热，破坏细胞壁，显著降低提取时长，提高提取效率。
对比例6、7、8与实施例3相比，步骤S6中未接种保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌或长双歧杆菌，制得的黑木耳多糖的溶解度下降，抗氧化效果下降，TC、TG、LDL-C的含量升高，HDL-C含量下降，体重增加，肝指数增加。对比例9与实施例3相比，未进行步骤S5、S6，制得的黑木耳多糖的溶解度明显下降，抗氧化效果明显下降，TC、TG、LDL-C的含量明显升高，HDL-C含量下降，体重明显增加，肝指数明显增加。保加利亚乳杆菌，兼性厌氧，能发酵葡萄糖、果糖和乳糖，但不能利用蔗糖。嗜热链球菌，兼性厌氧，发酵乳糖，不发酵菊糖、甘露醇。长双歧杆菌，兼性厌氧，可利用乳糖，核糖，棉子糖，木糖，甘露糖，果糖，半乳糖，蔗糖，麦芽糖，蜜二糖等。将嗜热链球菌、长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌混合发酵培养，比各自单独发酵培养更好，这是因为保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌分解提供乳酸、氨基酸等，为嗜热链球菌的生长提供了营养物质，而嗜热链球菌产生的甲酸、短链脂肪酸、叶酸等，能促进保加利亚乳杆菌和长双歧杆菌的生长，嗜热链球菌发酵初期，产酸快，pH降至6.2-6.7左右时，促进长双歧杆菌大量增殖，进一步产生大量的小分子酸，pH继续降低至4左右时，保加利亚乳杆菌大量增殖，产生大量的乳酸及氨基酸，反过来促进嗜酸链球菌和长双歧杆菌的生长，三者相辅相成，互相促进，能起到很好的降解粗多糖的效果。另外，本发明在微缺氧条件发酵提取，一方面有助于兼性厌氧菌的增殖和生长，同时，微缺氧条件的提取可有效防止物质氧化，使生成的生物活性物质发挥出更好的功效。
对比例10与实施例3相比，未进行步骤S7磷酸化，制得的黑木耳多糖的溶解度明显下降，抗氧化效果明显下降，TC、TG、LDL-C的含量明显升高，HDL-C含量下降，体重明显增加，肝指数明显增加。多糖的生物活性取决于聚合物的分子性质，包括单糖的分子量，多糖链的构象，支链聚合的程度和糖苷键的类型等。本发明通过将发酵黑木耳多糖经磷酸化修饰，化学基团取代多糖上的羟基后，结构发生变化，从而使得更多的羟基被暴露，不仅抗氧化活性增强，还提高了多糖的抗炎、抗衰老、降血糖等效果，同时，进一步提高了多糖的溶解性，使得多糖更容易被吸收。
对比例11与实施例3相比，未进行步骤S8脱蛋白，制得的黑木耳多糖的溶解度下降，提取率下降。经过蛋白脱除后得到的多糖纯度更高，溶解度更高，活性更高。
对比例12与实施例3相比，未进行步骤S10螯合锌，制得的黑木耳多糖抗氧化效果明显下降，TC、TG、LDL-C的含量明显升高，HDL-C含量下降，体重明显增加，肝指数明显增加。经过脱蛋白、脱色后的精制黑木耳多糖进一步与锌盐反应，表面的羟基等螯合基团通过络合作用与Zn离子配位，形成稳定的多糖-锌复合物，制得的多糖-锌复合物不仅具有很好的抗氧化、抗炎、抗衰老、降血糖等效果，同时，还具有提高免疫力、促进智力发育，以及降血脂、调节总胆固醇、有效提高良性胆固醇的功效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种黑木耳多糖的制备方法，其特征在于，将黑木耳经过脱脂后，在蜗牛酶作用下初步酶解，进一步通过H2O2协同超声波降解提取，在复合酶的作用下深度酶解，然后经过保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的混合发酵，得到的发酵黑木耳多糖在磷酸化试剂作用下发生磷酸化反应，进一步脱蛋白、脱色后，与锌盐螯合后，得到多糖-锌复合物，即得黑木耳多糖；所述复合酶为β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的复配混合物，质量比为3-5:1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.脱脂：将黑木耳干燥，粉碎后，经过超临界流体萃取技术脱脂，得到脱脂黑木耳；
S2.初步酶解：将步骤S1脱脂黑木耳加入水中，加入蜗牛酶，酶解，灭酶，浓缩，干燥，得到初步酶解产物；
S3.H2O2协同超声波提取：将步骤S2制得的初步酶解产物加入H2O2溶液中，超声波处理，加入亚硫酸氢钠，醇沉，离心，干燥，得到黑木耳粗糖提取物；
S4.深度酶解：将步骤S3制得的粗糖提取物溶于水中，加入复合酶酶解，灭酶，得到深度酶解提取液；
S5.菌种的活化：将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌分别在高氏培养基中划线，活化培养，得到菌种种子液；
S6.发酵：将步骤S5制得的菌种种子液接种至步骤S4制得的深度酶解提取液中，发酵培养，浓缩，醇沉，离心，得到发酵黑木耳多糖；
S7.磷酸化：将步骤S6制得的发酵多糖加入水中，加入硫酸钠和磷酸化试剂，调节pH值为8.8-9.2，加热反应，透析，浓缩，得到磷酸化黑木耳多糖液；
S8.脱蛋白：将步骤S7得到的磷酸化黑木耳多糖液加入Sevage试剂中，搅拌反应，离心，重复1-3次，合并液体，减压除去溶剂，得到脱蛋白黑木耳多糖；
S9.脱色：将活性炭和步骤S8制得的脱蛋白黑木耳多糖加入水中，搅拌吸附，过滤，醇沉，离心，得到精制黑木耳多糖；
S10.螯合锌：将步骤S9制得的精制黑木耳多糖和柠檬酸三钠溶于水中，加入锌盐，调节溶液pH值为7.2-7.5，加热搅拌反应，过滤，醇沉，离心，收集固体，冷冻干燥，得到黑木耳多糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述超临界流体萃取技术的条件为CO2流量为7-12L/h，萃取釜压力为12-25MPa，温度为45-60℃，提取时间为1-2h；所述脱脂黑木耳、蜗牛酶的质量比为100：3-5，所述酶解温度为40-50℃，时间为1-2h；步骤S3中所述H2O2溶液中H2O2浓度为2-5wt％；所述超声波处理的功率为1500-2000W，处理时间为30-50min；步骤S4中所述粗糖提取物和复合酶的质量比为100:5-7，所述酶解温度为40-45℃，时间为3-5h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述活化培养的条件为微缺氧条件下，温度为40-45℃，时间为18-24h，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL；步骤S6中保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为3-5％、1-3％、1-2％；所述发酵培养的条件为微缺氧条件下，温度为40-45℃，时间为36-48h；所述微缺氧条件为O2含量为5-7％，CO2含量为5-10％，余量为氮气，此中％为体积百分比含量。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述磷酸化试剂选自多聚磷酸、三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸、五氧化二磷中的至少两种；所述发酵多糖、硫酸钠、磷酸化试剂和水的质量比为10：30-50：2-4：100；所述加热反应的温度为70-90℃，时间为3-5h，所述透析的透析袋孔径为5000-15000D，时间为24-48h；步骤S8中所述磷酸化黑木耳多糖液和Sevage试剂的质量比为1：3-7；所述搅拌反应的时间为20-30min；步骤S9中所述脱蛋白黑木耳多糖和活性炭的质量比为100:12-15；所述搅拌吸附的时间为30-50min；步骤S10中所述黑木耳多糖、柠檬酸三钠、锌盐的质量比为100:5-12:22-27；所述加热搅拌反应的温度为45-55℃，时间为1-2h，搅拌转速为300-500r/min；所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌、硝酸锌中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸的混合物，质量比为3-7:2:0.2-0.4。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.脱脂：将黑木耳干燥，粉碎后，经过超临界流体萃取技术脱脂，得到脱脂黑木耳；
所述超临界流体萃取技术的条件为CO2流量为7-12L/h，萃取釜压力为12-25MPa，温度为45-60℃，提取时间为1-2h；
S2.初步酶解：将100重量份步骤S1脱脂黑木耳加入200重量份水中，加入3-5重量份蜗牛酶，40-50℃酶解1-2h，100-110℃灭酶10-15min，有机膜浓缩至原体积的1/3-1/4，干燥，得到初步酶解产物；
S3.H2O2协同超声波提取：将100重量份步骤S2制得的初步酶解产物加入100重量份2-5wt％的H2O2溶液中，1500-2000W超声波处理30-50min，加入7-12重量份亚硫酸氢钠，醇沉，离心，干燥，得到黑木耳粗糖提取物；
S4.深度酶解：将100重量份步骤S3制得的粗糖提取物溶于100重量份水中，加入5-7重量份复合酶，40-45℃酶解3-5h，100-110℃灭酶10-15min，得到深度酶解提取液；
所述复合酶为β-葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的复配混合物，质量比为3-5:1；
S5.菌种的活化：将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，40-45℃活化培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为108-109cfu/mL；
S6.发酵：将步骤S5制得的菌种种子液接种至步骤S4制得的深度酶解提取液中，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和长双歧杆菌的接种量分别为3-5％、1-3％、1-2％，微缺氧条件下，40-45℃发酵培养36-48h，浓缩，醇沉，离心，得到发酵黑木耳多糖；
微缺氧条件为O2含量为5-7％，CO2含量为5-10％，余量为氮气，此中％为体积百分比含量；
S7.磷酸化：将10重量份步骤S6制得的发酵多糖加入100重量份水中，加入30-50重量份硫酸钠和2-4重量份磷酸化试剂，调节pH值为8.8-9.2，70-90℃加热反应3-5h，用袋孔径为5000-15000D透析袋透析24-48h，有机膜浓缩至原体积的1/3-1/4，得到磷酸化黑木耳多糖液；
所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、焦磷酸的混合物，质量比为3-7:2:0.2-0.4；
S8.脱蛋白：将10重量份步骤S7得到的磷酸化黑木耳多糖液加入30-70重量份Sevage试剂中，搅拌反应20-30min，离心，重复1-3次，合并液体，减压除去溶剂，得到脱蛋白黑木耳多糖；
S9.脱色：将12-15重量份活性炭和100重量份步骤S8制得的脱蛋白黑木耳多糖加入200重量份水中，搅拌吸附30-50min，过滤，醇沉，离心，得到精制黑木耳多糖；
S10.螯合锌：将100重量份步骤S9制得的精制黑木耳多糖和5-12重量份柠檬酸三钠溶于200重量份水中，加入22-27重量份锌盐，调节溶液pH值为7.2-7.5，加热至45-55℃，300-500r/min搅拌反应1-2h，过滤，醇沉，离心，收集固体，冷冻干燥，得到黑木耳多糖；
所述醇沉的方法为加入无水乙醇至体系中乙醇含量为75-85％，沉淀12-24h。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的黑木耳多糖。
9.一种如权利要求8所述黑木耳多糖在制备降血脂的产品中的应用。
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