CN115010823A - 一种调节肠道菌群的车前子多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种调节肠道菌群的车前子多糖及其制备方法与应用，属于中药技术领域。本发明首次以米泔水浸车前子为原料，采用微波协同高压复合酶解法和分级醇沉法得车前子多糖(PSP‑70)，分离纯化得PSP‑70‑Ⅰ～Ⅲ。所述PSP‑70提取率为9.57％、糖含量为87.54％、相对分子量为9.1×104～2.1×105Da，由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖6种单糖组成。本发明不仅操作方便、省时高效，还能提高车前子多糖的提取率和纯度；且本发明制备的车前子多糖可通过调节肠道菌群改善痛风性肾病大鼠的肾脏损伤情况，具有抗痛风性肾病的作用。

Description

一种调节肠道菌群的车前子多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种调节肠道菌群的车前子多糖及其制备方法与应用。
背景技术
肠道菌群作为人体的第二个大脑是人体不可分割的一部分，其主要是指栖息在肠道内并与宿主共生的微生物群组，包括细菌、病毒和真菌，它们影响着机体的新陈代谢和免疫调节。同时肠道菌群中含有的酶可以降解难以被人体直接消化吸收的多糖类化合物，并参与蛋白质和氨基酸等物质的代谢，其代谢产物可在生理、病理过程中发挥作用。研究发现肾脏疾病患者常常伴有肠道菌群紊乱现象，而肠道菌群紊乱也会加速肾脏疾病的发生与发展，因此维持肠道菌群稳态至关重要。痛风性肾病又称尿酸性肾病，其发病机制主要是由于嘌呤代谢紊乱或肾脏尿酸排泄减少导致尿酸过量的产生，使尿酸盐结晶沉积于肾脏内，最终导致痛风性肾病。
车前子为车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressaWilld.的干燥成熟种子。味甘，性寒，归肝、肾、肺、小肠经，始载于《神农本草经》。《中国药典》中记载车前子具有清热利尿通淋、渗湿止泻、明目、祛痰等功效，可用于治疗热淋涩痛、水肿胀满、暑湿泄泻、目赤肿痛、痰热咳嗽等症状，具有很大的发展前景，但目前对于车前子炮制品相关研究较少。明代《先醒斋医学广笔记》曾记载“入补益药中，用米泔淘净”的炮制方法，所谓“米泔”出自《本草纲目》，即是淘洗食米的水，主要用它来吸取药材所含的油脂，可以炮制药物。
车前子多糖为车前子主要活性成分之一，具有利尿，调节肠道菌群等活性，应进一步合理开发和利用车前子资源，但其具有提取率低以及纯度低等问题尚未解决。此外，虽然目前临床调节肠道菌群失衡主要采用益生菌等药物，但该方法主要通过对正常菌群进行抑制，来达到调节肠道菌群功能的目的，可能导致人体代谢紊乱并发生机会性感染；以及，虽然目前治疗痛风性肾病主要为降低尿酸的药物，但该类药物用药成本高且具有一定副作用如产生剥脱性皮炎等。现阶段并无能同时治疗痛风性肾病及肠道菌群紊乱的药物。
因此，如何提供一种提取率及纯度高，又同时具有调节肠道菌群和痛风性肾病功效的车前子多糖及其制备方法是本领域技术人员亟待解决的技术难题。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种车前子多糖的制备方法及其在调节肠道菌群和改善痛风性肾病中的应用。
本发明首次采用米泔水浸车前子为原料，对其化学成分及药理作用进行深入研究。本发明提供的车前子多糖首次采用微波协同高压复合酶解法进行提取，该方法具有操作方便、省时高效和无污染等优点，而且本发明车前子多糖具有调节肠道菌群紊乱以及改善并治疗痛风性肾病的作用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种车前子多糖的制备方法，包括以下步骤：首先取米泔水浸车前子加入缓冲液先进行微波提取，再进行高压加热浸提，过滤，取滤液加入复合酶进行酶解，离心抽滤、分级醇沉得车前子多糖(PSP-70)，经柱层析分离纯化得PSP-70-Ⅰ～Ⅲ。
具体的，所述车前子多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取车前子药材加入米泔水浸泡后，过滤、炒干加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液得混合液；
(2)对所述混合液先进行微波提取，再进行高压加热浸提，过滤得滤液；
(3)向所述滤液中加入由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成的复合酶进行酶解，随后灭酶，经离心抽滤，得酶解液；
(4)取所述酶解液加入无水乙醇进行第一醇沉，离心得上清液；
(5)向所述上清液中加入无水乙醇进行第二醇沉得醇溶液；
(6)取所述醇溶液离心得沉淀复溶，减压浓缩，冷冻干燥，得PSP-70；
(7)将所述PSP-70经DEAE-52纤维素离子交换树脂分离纯化得PSP-70-Ⅰ～Ⅲ。
优选的，步骤(1)所述米泔水浸提时间为12～24h，车前子与米泔水的体积比为1:(10～15)g·mL-1；所述缓冲液pH为3.0～5.0，车前子与缓冲液的体积比为1:(8～12)g·mL-1。
优选的，步骤(2)所述微波提取功率为700～900W，时间为5～15min；所述高压加热浸提温度为100～120℃，时间为60～90min。
优选的，步骤(3)所述复合酶中果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的质量比为2:2:1，复合酶与车前子的质量比为(0.1～0.3):1；所述酶解条件为在37℃下酶解1h，之后加热95℃灭酶；所述离心条件为3500～4000r·min-1离心10～15min。
优选的，步骤(4)和步骤(5)所述第一醇沉和第二醇沉的温度为4℃，时间为48h；及所述上清液的乙醇浓度为50％，所述醇溶液的乙醇浓度为70％。
本发明还请求保护上述技术方案中所述制备方法得到PSP-70和PSP-70-Ⅰ～Ⅲ，所述PSP-70提取率为9.57％、糖含量为87.54％、相对分子量分布于9.1×104～2.1×105Da之间；其中
所述PSP-70-Ⅰ～Ⅲ均呈现单一对称峰，分子量分别为211742Da、157581Da与91681Da，PSP-70-Ⅰ是由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成以及摩尔比为0.57:0.59:0.11:0.10:0.12，
PSP-70-Ⅱ是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖5种单糖组成以及摩尔比为0.18:0.60:0.53:0.14:0.17，
PSP-70-Ⅲ是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成以及摩尔比为0.33:0.38:0.36:0.24:0.18。
此外，本发明还请求保护所述车前子多糖在抗痛风性肾病中的应用。
本发明采用酵母联合腺嘌呤方法诱导的痛风性肾病大鼠模型，应用本发明制备的PSP-70灌胃给药，结果表明，本发明的PSP-70能够改善痛风性肾病大鼠的肾损伤，减轻炎症反应，而车前子多糖在此方面相关报道较少，说明车前子多糖在抗痛风性肾病的应用具有明显前景。
具体地，本发明还公开保护所述车前子多糖在通风肾病大鼠肠道菌群中的应用。
本发明制备的PSP-70可改善GN大鼠结肠组织的腺体缺失与损伤程度，提高肠道菌群的丰富度与多样性，并通过改变优势菌属与优势菌门的比例，加速UA排泄，恢复结肠组织黏膜屏障，改善由GN引起的肠道菌群紊乱现象。
综上所述，本发明公开提供的一种调节肠道菌群的车前子多糖及其制备方法与应用，具有如下优异效果：
1)本发明采用米泔水浸的炮制方法，不仅可除去车前子中油脂成分，提高车前子多糖的纯度，还能解决车前子多糖提取效率及纯度低等问题，并补充车前子炮制方法的相关研究。
2)本发明公开的制备方法具有操作方便、省时高效和无污染等优点。
3)本发明制备的车前子多糖具有同时治疗痛风性肾病和肠道菌群紊乱的功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明制备的PSP-70-Ⅰ～Ⅲ的HPGPC图谱。
图2为本发明制备的PSP-70-Ⅰ～Ⅲ的单糖组成分析及混合单糖标准品衍生物的GC-MS图谱。
图3为本发明PSP-70对痛风性肾病大鼠血清中UA、BUN、Cr含量的影响，注：与Con组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Mod组比较，*P<0.05，**P<0.01。
图4为本发明PSP-70对痛风性肾病大鼠肾组织病理学观察结果。
图5为本发明PSP-70对痛风性肾病大鼠结肠组织病理学观察的结果。
图6为本发明PSP-70对痛风性肾病大鼠肠道菌群中OTU变化的分析结果。
图7为本发明PSP-70对痛风性肾病大鼠肠道菌群Alpha分析的结果，其中A为Observed species指数、B为chao1指数、C为Simpson指数、D为Shannon指数。
图8为本发明PSP-70对痛风性肾病大鼠肠道菌群中群落组成中门水平组成分析结果。
图9为本发明PSP-70对痛风性肾病大鼠肠道菌群中群落组成中属水平组成分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种车前子多糖的制备方法，步骤包括：
称取车前子药材2kg浸泡于24L米泔水中24h后过滤、炒干，按1:10g·mL-1的料液比加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，在微波功率为800W时，微波提取10min，然后在115℃下高压浸提80min，过滤得滤液。向滤液中加入由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成的复合酶400g，搅拌均匀，在恒温37℃下酶解1h，然后加热至95℃灭酶，以4000r·min-1离心10min，得到酶解液。取酶解液加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达50％，搅匀，4℃静置48h，4000r·min-1离心10min，取上清液加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达70％，搅匀，4℃静置48h，4000r·min-1离心10min，取沉淀加入蒸馏水复溶，减压浓缩，冷冻干燥，得车前子多糖(PSP-70)。
所得PSP-70提取率为9.57％、糖含量为87.54％。
此外，为进一步说明本发明申请所公开的技术方案中工艺参数条件的非显而易见性，发明人分别针对车前子与米泔水的体积比、车前子与缓冲液的体积比及复合酶与车前子的质量比进行优选，具体内容如下：
实验1：
一种车前子多糖的制备方法，步骤包括：
分别称取车前子药材200g浸泡于2、2.4、2.8L米泔水中24h后过滤、炒干，按1:10g·mL-1的料液比加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，在微波功率为800W时，微波提取10min，然后在115℃下高压浸提80min，过滤得滤液。向滤液中加入由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成的复合酶40g，搅拌均匀，在恒温37℃下酶解1h，然后加热至95℃灭酶，以4000r·min-1离心10min，得到酶解液。取酶解液加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达50％，搅匀，4℃静置48h，4000r·min-1离心10min，取上清液加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达70％，搅匀，4℃静置48h，4000r·min-1离心10min，取沉淀加入蒸馏水复溶，减压浓缩，冷冻干燥，得车前子多糖1、车前子多糖2、车前子多糖3。
根据车前子与米泔水的体积比不同进行优化，所得车前子多糖1提取率为7.78％、糖含量为73.11％；车前子多糖2提取率为9.49％、糖含量为87.87％；车前子多糖3提取率为8.68％、糖含量为78.21％。因此，优选车前子与米泔水的体积比为1:12g·mL-1进行制备。
实验2：
一种车前子多糖的制备方法，步骤包括：
分别称取车前子药材200g浸泡于2.4L米泔水中24h后过滤、炒干，按1:8、1:10、1:12g·mL-1的料液比加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，在微波功率为800W时，微波提取10min，然后在115℃下高压浸提80min，过滤得滤液。向滤液中加入由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成的复合酶40g，搅拌均匀，在恒温37℃下酶解1h，然后加热至95℃灭酶，以4000r·min-1离心10min，得到酶解液。取酶解液加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达50％，搅匀，4℃静置48h，4000r·min-1离心10min，取上清液加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达70％，搅匀，4℃静置48h，4000r·min-1离心10min，取沉淀加入蒸馏水复溶，减压浓缩，冷冻干燥，得车前子多糖4、车前子多糖5、车前子多糖6。
根据车前子与缓冲液的体积比不同进行优化，所得车前子多糖4提取率为6.46％、糖含量为63.96％；车前子多糖5提取率为9.63％、糖含量为87.41％；车前子多糖6提取率为8.17％、糖含量为73.72％。因此，优选车前子与缓冲液的体积比为1:10g·mL-1进行制备。
实验3：
一种车前子多糖的制备方法，步骤包括：
分别称取车前子药材200g浸泡于2.4L米泔水中24h后过滤、炒干，按1:10g·mL-1的料液比加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，在微波功率为800W时，微波提取10min，然后在115℃下高压浸提80min，过滤得滤液。分别向滤液中加入由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成的复合酶20、40、60g，搅拌均匀，在恒温37℃下酶解1h，然后加热至95℃灭酶，以4000r·min-1离心10min，得到酶解液。取酶解液加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达50％，搅匀，4℃静置48h，4000r·min-1离心10min，取上清液加入无水乙醇至溶液乙醇浓度达70％，搅匀，4℃静置48h，4000r·min-1离心10min，取沉淀加入蒸馏水复溶，减压浓缩，冷冻干燥，得车前子多糖7、车前子多糖8、车前子多糖9。
根据复合酶与车前子的质量比不同进行优化，所得车前子多糖7提取率为7.31％、糖含量为69.87％；车前子多糖8提取率为9.47％、糖含量为87.65％；车前子多糖9提取率为8.72％、糖含量为76.14％。因此，优选复合酶与车前子的质量比为0.2:1进行制备。
以及，为突显本发明申请所公开技术方案相较现有技术的优异效果，进行了如下对比实验：
对比例1：
按照实施例1的方法制备车前子多糖，区别在于车前子进行提取前未经过米泔水浸提24h，其他步骤同实施例1，制备车前子多糖(PSP-70-A)。
采用该对比例1的方法，制备得PSP-70-A提取率为7.72％、糖含量为73.53％，由此看出，经过米泔水浸提过的车前子多糖的提取率及糖含量明显高于未经处理过的车前子多糖的提取率及糖含量，但应用米泔水浸提后车前子的炒干过程中温度及时间的掌握为此制备方法中的技术难点，不应过度炒干，采用文火炒至有爆声或微鼓起为宜，放凉备用。
对比例2：
按照实施例1的方法制备车前子多糖，区别在于进行酶解时，分别采用果胶酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶进行酶解，其他步骤同实施例1，制备车前子多糖(PSP-70-B～D)。
采用该对比例2的方法，结果如下表1。
表1 PSP-70和PSP-70-B～D提取率及糖含量
Figure BDA0003698611400000091
由于车前子中含有大量黏液质，加入果胶酶会造成提取液黏度增大，损失部分多糖成分，因此加入木瓜蛋白酶和纤维素酶联用，降低提取液黏度，并且利用复合酶酶解能够不破坏车前子多糖的成分结构，改变细胞壁的通透性，进而有效地软化和溶胀细胞壁，增加溶液中多糖溶出率，该提取工艺简单、效率高，复合酶酶解法明显高于单酶酶解法中多糖提取率及糖含量。
对比例3：
按照实施例1的方法制备车前子多糖，区别在于分别采用传统水提、微波提取以及高压浸提法进行提取制备，其他步骤同实施例1，制备车前子多糖(PSP-70-E～G)。
采用该对比例3的方法，结果如下表2。
表2 PSP-70和PSP-70-E～G提取率及糖含量
Figure BDA0003698611400000092
由此可以得出，微波协同高压浸提法中车前子多糖的提取率及糖含量明显高于传统水提、微波提取以及高压浸提法，证明微波协同高压浸提法能够结合两者的优势，加快多糖成分在细胞中的溶出速率，优化提取效果，达到协同增效的目的。
实验4：
将预处理后的DEAE-52纤维素离子交换树脂采用湿法装柱，配制50mg·mL-1由实施例1制备的PSP-70溶液，4000r·min-1离心10min后，取上清液上样，分别使用蒸馏水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol·L-1NaCl进行洗脱，流速为1mL·min-1，收集洗脱液，苯酚-硫酸法隔管检测吸光度，收集合并单峰洗脱组分，浓缩后选取截留分子量为3500Da的透析袋进行透析脱盐，冷冻干燥，得3个多糖，记为PSP-70-Ⅰ、PSP-70-Ⅱ、PSP-70-Ⅲ。
所得PSP-70相对分子量分布于9.1×104～2.1×105Da之间，PSP-70-Ⅰ～Ⅲ均呈现单一对称峰，分子量分别为211742Da、157581Da与91681Da，其单糖组成及摩尔比如下表3。
表3 PSP-70-Ⅰ～Ⅲ单糖组成的摩尔比
Figure BDA0003698611400000101
为了进一步阐述说明通过本发明制备的车前子多糖在抗痛风性肾病中应用及调节肠道菌群时具备的优异效果，发明人还进行如下实验，具体内容如下：
实验5：
SD大鼠，SPF级，雄性，200±20g，适应性饲养7d后，将32只大鼠随机分为4组，空白组(Con组)、模型组(Mod组)、阳性药物组(Pos组)、由实施例1制备的车前子多糖组(PSP-70组)，每组8只。
配制0.5％CMC-Na溶液和20mg·mL-1的腺嘌呤-0.5％CMC-Na混悬液。空白组每日上午给予0.5％CMC-Na 2mL，喂食普通饲料；其余各组大鼠给予100mg·kg-1·d-1腺嘌呤-0.5％CMC-Na混悬液，并饲喂酵母饲料，每日酵母粉摄入量控制为10g·kg-1d-1，连续28d。各组大鼠在实验结束前禁食24h，自由饮水，麻醉后取血，采集血清，检测UA、BUN、Cr含量。结果如下：
(1)对UA含量的影响：
与Con组比较，Mod组大鼠UA含量极显著升高(P<0.01)；与Mod组比较，Pos组、PSP-70组UA含量极显著降低(P<0.01)。结果说明，PSP-70可降低GN大鼠血清中UA的含量，减轻UA诱导的肾脏损伤，结果见图3。
(2)对BUN含量的影响：
与Con组比较，Mod组大鼠BUN含量极显著升高(P<0.01)；与Mod组比较，Pos组、PSP-70组BUN含量极显著降低(P<0.01)。实验结果说明，PSP-70可降低GN大鼠血清中BUN的含量，改善GN引起的肾功能减退。结果见图3。
(3)对Cr含量的影响：
与Con组比较，Mod组大鼠Cr含量显著升高(P<0.05)；与Mod组比较，Pos组、PSP-70组Cr含量显著降低(P<0.05)。实验结果说明，PSP-70可降低GN大鼠血清中Cr的含量，改善GN引起的肾小球滤过障碍。结果见图3。
实验6
以苏木精-伊红(HE)染色法评价肾组织病理学变化。结果如下：
Con组大鼠肾小球形态结构正常，无坏死、纤维化等现象，肾小管上皮细胞排列整齐，大小均一，无炎症细胞浸润；与Con组比较，Mod组大鼠肾小球结构损坏严重，肾小管上皮细胞出现明显水肿，坏死，肾间质伴有大量的炎性细胞浸润；与Mod组相比，Pos组、PSP-70组大鼠肾小球坏死程度改善显著，肾小管细胞水肿和炎性细胞浸润程度明显减轻。实验结果表明，PSP-70能改善GN大鼠肾脏组织的病变程度，结果见图4。
实验7：
以苏木精-伊红(HE)染色法评价结肠组织病理学变化。结果如下：
Con组大鼠结肠组织黏膜结构完整，腺体排列整齐，细胞形态结构正常；Mod组大鼠结肠组织黏膜出现损坏，腺体缺失，排列不规则；PSP-70组大鼠结肠组织黏膜基本恢复正常，腺体破坏较轻。实验结果表明，车前子多糖能减轻GN大鼠结肠组织的损伤程度，结果见图5。
实验8：
使用Vsearch软件对序列进行OTU聚类分析；利用Observed species、Chao1、Simpson和Shannon指数对样本的Alpha多样性进行估计。结果如下：
(1)OTU组成相似性分析结果
将各组提取的有效序列经97％相似性归并后得到OTUs。通过图6可知，各组公有112条OYU条目，PSP-70组与Con组重合OTU个数高于Mod组与Con组重合个数，说明PSP-70组与Con组OTU相似度高于Mod组。
(2)Alpha分析结果
肠道菌群的物种丰富度主要由Observed species指数、chao1指数反映，多样性主要由Simpson指数、Shannon指数反映。由图7-A、7-B可知，与Con组比较，Mod组Observedspecies、Chao1指数极显著降低(P＜0.01)，表明GN可使大鼠菌群丰富度降低；与Mod组比较，PSP-70组大鼠菌群丰富度极显著增加(P＜0.01)。由图7-C、7-D可知，与Con组比较，Mod组Simpson指数极显著升高(P＜0.01)，Shannon指数极显著降低(P＜0.01)，表明GN可使大鼠菌群多样性降低；与Mod组比较，PSP-70能够显著降低Simpson指数(P＜0.05)，显著增加Shannon指数(P＜0.05)，以上结果表明PSP-70可以调节GN大鼠肠道菌群的丰富度和多样性。
实验9：
进一步对大鼠肠道群落组成的门水平和属水平物种丰度进行分析，结果如下：
(1)门水平组成分析结果：
如图8所示，Firmicutes(厚壁菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Actinobacteria(放线菌门)为优势菌门，与Con比较，Mod组Firmicutes相对丰度极显著升高(P＜0.01)，而Bacteroidetes和Actinobacteria相对丰度极显著降低(P＜0.01)；与Mod组比较，PSP-70组Firmicutes相对丰度极显著降低(P＜0.01)，Actinobacteria相对丰度极显著升高(P＜0.01)。Firmicutes与Bacteroidetes相对丰度比值(F/B)在一定程度上可作为反映肠道菌群紊乱的重要指标，与Con组比较，Mod组F/B值极显著升高(P<0.01)，与Mod组比较，PSP-70组F/B值极显著降低(P<0.01)，其余组无显著差异。以上结果说明PSP-70可通过调节Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria的相对丰度来改善肠道菌群紊乱。
(2)属水平组成分析结果：
如图9所示，Peptostreptococcaceae(消化链菌属)、Turicibacter、Lactobacillus(乳酸菌)、Akkermansia(阿克曼菌)等为优势菌属。与Con组比较，Mod组Peptostreptococcaceae和Akkermansia、Lactobacillus极显著降低(P<0.01)，Turicibacter显著升高(P<0.05)；与Mod组比较，PSP-70组Peptostreptococcaceae和Akkermansia、Lactobacillus极显著升高(P<0.01)，Turicibacter显著降低(P<0.05)。以上结果说明PSP-70可通过调节Peptostreptococcaceae、Lactobacillus、Akkermansia等菌属来改善肠道菌群紊乱。
综上实验结果表明：本发明制备的车前子多糖提取率及糖含量高，并且能够通过改善由GN引起的肠道菌群紊乱，遏制GN的发展，起到治疗GN作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种车前子多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取车前子药材加入米泔水浸泡后，过滤、炒干加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液得混合液；
(2)对所述混合液先进行微波提取，再进行高压加热浸提，过滤得滤液；
(3)向所述滤液中加入由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成的复合酶进行酶解，随后灭酶，经离心抽滤，得酶解液；
(4)取所述酶解液加入无水乙醇进行第一醇沉，离心得上清液；
(5)向所述上清液中加入无水乙醇进行第二醇沉得醇溶液；
(6)取所述醇溶液离心得沉淀复溶，减压浓缩，冷冻干燥，得PSP-70；
(7)将所述PSP-70经DEAE-52纤维素离子交换树脂分离纯化得PSP-70-Ⅰ～Ⅲ。
2.根据权利要求1所述的一种车前子多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述米泔水浸提时间为12～24h，车前子与米泔水的体积比为1:(10～15)g·mL-1；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH为3.0～5.0，车前子与缓冲液的体积比为1:(8～12)g·mL-1。
3.根据权利要求1所述的一种车前子多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述微波提取功率为700～900W，时间为5～15min；所述高压加热浸提温度为100～120℃，时间为60～90min。
4.根据权利要求1所述的一种车前子多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述复合酶中果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的质量比为2:2:1，复合酶与车前子的质量比为(0.2～0.5):1。
5.根据权利要求1或4所述的一种车前子多糖的制备方法，其特征在于，所述酶解条件为在37℃下酶解1h，之后加热95℃灭酶；所述离心条件为3500～4000r·min-1离心10～15min。
6.根据权利要求1所述的一种车前子多糖的制备方法，其特征在于，所述第一醇沉和第二醇沉的温度为4℃，时间为48h；及所述上清液的乙醇浓度为50％，所述醇溶液的乙醇浓度为70％。
7.一种如权利要求1～6任一所述制备方法得到的车前子多糖，其特征在于，所述PSP-70提取率为9.57％、糖含量为87.54％、相对分子量分布于9.1×104～2.1×105Da之间；
所述PSP-70-Ⅰ～Ⅲ均呈现单一对称峰，分子量分别为211742Da、157581Da与91681Da；其中，
PSP-70-Ⅰ是由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成以及摩尔比为0.57:0.59:0.11:0.10:0.12，
PSP-70-Ⅱ是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖5种单糖组成以及摩尔比为0.18:0.60:0.53:0.14:0.17，
PSP-70-Ⅲ是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成以及摩尔比为0.33:0.38:0.36:0.24:0.18。
8.一种如权利要求1～6任一所述制备方法得到的车前子多糖或如权利要求7所述车前子多糖在抗痛风性肾病中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，还包括：所述车前子多糖在痛风性肾病大鼠肠道菌群中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116270952A (zh) * 2023-03-21 2023-06-23 佳木斯大学 一种用于缓解痛风的提取物及其提取方法和应用

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4511559A (en) * 1982-03-04 1985-04-16 Kozponti Valto-es Hitelbank Rt. InnovacioAlap Biologically active polysaccharide concentrates and process for production of preparates containing such substances
EP1585679A1 (de) * 2003-01-09 2005-10-19 Baxter Healthcare S.A. Sicherheitsbeh lter f r biologisch aktive substanzen un d verfahren zu deren herstellung
JP2012191875A (ja) * 2011-03-15 2012-10-11 Mitsubishi Rayon Co Ltd 低粘化サイリウム及びその製造方法
CN105037571A (zh) * 2015-06-30 2015-11-11 南昌大学 一种酶法制备低黏度车前子多糖的方法
CN105061626A (zh) * 2015-08-31 2015-11-18 桂林茗兴生物科技有限公司 车前子多糖的提取方法
CN105853835A (zh) * 2016-04-19 2016-08-17 王胜 一种具有抗衰老作用的碱性植物盐及其制备方法
CN106417772A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 东莞市哥布林文化传媒有限公司 一种车前草绿茶速溶茶的生产方法
CN106832031A (zh) * 2017-01-22 2017-06-13 嵊州市派特普科技开发有限公司 车前子多糖提取物的制备方法
CN106943423A (zh) * 2017-03-23 2017-07-14 江苏省中医药研究院 具有调节肠道菌群结构作用的多糖组合物及其应用
CN107998313A (zh) * 2018-01-10 2018-05-08 胡广 一种治疗痛风病的中药酵素及其制备方法
CN108260819A (zh) * 2018-01-15 2018-07-10 广州聚澜健康产业研究院有限公司 一种红豆千层糕及其制备方法
EP3582796A1 (en) * 2017-02-15 2019-12-25 Aboca S.p.A. Societa' Agricola Composition for cough
CN111513188A (zh) * 2020-05-01 2020-08-11 安徽晟之源实业有限公司 一种饲料添加剂及其制备方法
CN112690414A (zh) * 2020-07-23 2021-04-23 渤海大学 一种以全羊蹄皮囊为肠衣的功能性肉花肠及制备方法
CN112724270A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 盐城工学院 一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4511559A (en) * 1982-03-04 1985-04-16 Kozponti Valto-es Hitelbank Rt. InnovacioAlap Biologically active polysaccharide concentrates and process for production of preparates containing such substances
EP1585679A1 (de) * 2003-01-09 2005-10-19 Baxter Healthcare S.A. Sicherheitsbeh lter f r biologisch aktive substanzen un d verfahren zu deren herstellung
JP2012191875A (ja) * 2011-03-15 2012-10-11 Mitsubishi Rayon Co Ltd 低粘化サイリウム及びその製造方法
CN105037571A (zh) * 2015-06-30 2015-11-11 南昌大学 一种酶法制备低黏度车前子多糖的方法
CN105061626A (zh) * 2015-08-31 2015-11-18 桂林茗兴生物科技有限公司 车前子多糖的提取方法
CN105853835A (zh) * 2016-04-19 2016-08-17 王胜 一种具有抗衰老作用的碱性植物盐及其制备方法
CN106417772A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 东莞市哥布林文化传媒有限公司 一种车前草绿茶速溶茶的生产方法
CN106832031A (zh) * 2017-01-22 2017-06-13 嵊州市派特普科技开发有限公司 车前子多糖提取物的制备方法
US20190388448A1 (en) * 2017-02-15 2019-12-26 Aboca S.P.A. Società Agricola Composition for cough
EP3582796A1 (en) * 2017-02-15 2019-12-25 Aboca S.p.A. Societa' Agricola Composition for cough
CN106943423A (zh) * 2017-03-23 2017-07-14 江苏省中医药研究院 具有调节肠道菌群结构作用的多糖组合物及其应用
CN107998313A (zh) * 2018-01-10 2018-05-08 胡广 一种治疗痛风病的中药酵素及其制备方法
CN108260819A (zh) * 2018-01-15 2018-07-10 广州聚澜健康产业研究院有限公司 一种红豆千层糕及其制备方法
CN111513188A (zh) * 2020-05-01 2020-08-11 安徽晟之源实业有限公司 一种饲料添加剂及其制备方法
CN112690414A (zh) * 2020-07-23 2021-04-23 渤海大学 一种以全羊蹄皮囊为肠衣的功能性肉花肠及制备方法
CN112724270A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 盐城工学院 一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BINWU SHENG 等: "The protective effects of the traditional Chinese herbs against renal damage induced by extracorporealshock wave lithotrupsy: a clinic study", 《UROLOGICAL RESEARCH》 *
FENFEN LI 等: "Polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L. alleviates nonylphenol induced reproductive system injury of male rats via PI3K/Akt/mTOR pathway", 《JOURNAL OF FUNCTIONAL FOODS》 *
JIE-LUN HU 等: "Artificial simulated saliva, gastric and intestinal digestion of polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L.", 《CARBOHYDRATE POLYMERS》 *
曹阿芳: "车前子多糖防治大鼠高脂血症的实验研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊） 医药卫生科技辑》 *
李芬芬: "大粒车前子多糖抗炎与缓解壬基酚毒性作用及其机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊） 工程科技I辑》 *
赵宏 等: "车前子多糖PSP-B9的结构及抑制RAW 264.7产生NO活性研究", 《辽宁中医杂志》 *
赵宏 等: "车前子多糖对膜性肾病大鼠肾损伤和肠道菌群的影响", 《中国实验方剂学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116270952A (zh) * 2023-03-21 2023-06-23 佳木斯大学 一种用于缓解痛风的提取物及其提取方法和应用

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