CN111196865B - 一种铁皮石斛活性成分的提取方法 - Google Patents

一种铁皮石斛活性成分的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛活性物质的提取方法,包括酶‑溶剂提取、酶‑Sevag试剂脱蛋白、活性炭脱色、透析、干燥步骤。本发明在常规水提取之前进行乙酸乙酯脱脂和酶解,并在Sevag试剂脱蛋白前先酶解,有效地增加了铁皮石斛多糖的释放、减少了铁皮石斛多糖的损失、降低了脂溶性成分和醇溶性糖的含量,同时保证了石斛多糖较高的提取率和较高的活性。本方法避免了单一成分提取对名贵药材的浪费,在获得石斛多糖的同时获得石斛碱,不仅保持了多糖的高收率,且具有较高的经济效益。

Description

一种铁皮石斛活性成分的提取方法
【技术领域】
本发明属于植物多糖领域,具体涉及一种铁皮石斛活性成分的提取方法。
【背景技术】
铁皮石斛是属兰科石斛多年附生的草本植物,俗称黑节草、铁吊兰,是中国传统的名贵药材,享有“救命仙草”、“中华仙草”等美誉。铁皮石斛已被《中华人民共和国药典(2015版)》收载。
铁皮石斛中含有多糖、生物碱、菲类和微量元素等,其中铁皮石斛多糖是最主要的活性成分,具有的抗氧化、抗衰老和治疗某些疾病等作用,因此作为功效原料广泛应用于药品、保健食品和化妆品。铁皮石斛提取物已作为化妆品原料收录于《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》中,同时《中华人民共和国药典》也将铁皮石斛多糖的含量作为评价铁皮石斛质量的重要指标。
石斛多糖的提取多采用传统的水提醇沉方法,原理是基于多糖易溶于水、不溶或微容于有机溶剂的性质,用高浓度乙醇(80%左右)将其从水中沉淀析出,再用适量无水乙醇或丙酮洗涤,经冷冻干燥后获得粗多糖,其基本流程是:样品→脱脂→70%~80%乙醇除杂→蒸馏水浸提→醇沉过夜→离心→冷冻干燥→粗多糖。超声波辅助提取法是基于超声波的机械效应、热效应和空化效应作用,从而增大物质分子运动的频率和速度,提高溶剂穿击力,加快有效物质溶出,从而缩短提取时间。
近年来,又有若干制备工艺在石斛多糖的提取中获得应用。微波辅助提取法是基于微波穿透能力强的特点,利用物质在微波场中吸收微波能力的差异,使物质的某些区域或某些组分被选择性溶出。闪式提取法是一种用于植物软硬组织破碎的新型提取技术,依靠高速机械剪切力和超动分子渗滤技术,在室温及溶剂存在下数秒内把物料粉碎至细微颗粒,并使有效成分迅速达到组织内外平衡,通过过滤达到提取的目的,具有溶剂用量少、提取时间短、效率高等优点。酶解提取法是指利用酶促反应,加速植物细胞壁结构的破坏,从而有利于有效成分从细胞中释放出来,缩短提取时间,同时酶促反应是在较温和的条件下进行,可以有效降低生物活性物质的失活率。
【发明内容】
本发明提供一种铁皮石斛活性成分的提取方法,能够高效地提取出石斛多糖和铁皮石斛总生物碱,提高石斛多糖提取率同时较大限度保持多糖的活性。
本发明的技术解决方案如下:
一种铁皮石斛活性成分的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)酶解提取:以80目以上的干铁皮石斛粗粉为原料,加入乙酸乙酯脱脂,过滤,得到的滤渣Ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂,在40~70℃进行酶解,酶解pH为3.0~6.0;升温使酶灭活,过滤,得到的滤渣Ⅱ干燥后加入酸性乙醇加热回流进行醇提,过滤得到滤液①和滤渣Ⅲ,在干燥的滤渣Ⅲ中加水进行水提,过滤得到滤液②和滤渣Ⅳ;将滤液②浓缩至适量,加入乙醇醇沉,在2~5℃下醇沉过夜;过滤,得到的滤渣Ⅴ干燥后得到粗多糖;
2)脱蛋白:取粗多糖复溶,加入蛋白酶30~50℃进行恒温处理,离心,取上清液,加入由氯仿:正丁醇(vol)=4.0:1~4.5:1形成的Sevag试剂,剧烈震荡,离心取上清液,重复上述步骤至无变性蛋白析出;
3)脱色:向步骤2)中脱蛋白后的溶液加入活性炭或大孔吸附树脂进行脱色,抽滤,得到溶液A;
4)透析:将步骤3)中脱色后的溶液A进行透析除去水溶性小分子杂质,得到溶液B;
5)干燥:将步骤4)处理后的溶液B冷冻干燥,得到铁皮石斛多糖。
进一步的,上述步骤1)还包括:滤液①经过减压蒸干、1~2%盐酸水溶液溶解、二氯甲烷萃取、氨水调节pH=8~12、氯仿萃取、减压蒸干,可以得到铁皮石斛总生物碱提取物。可以得到铁皮石斛总生物碱。
进一步的,上述步骤1)的酶试剂为纤维素酶和/或果胶酶,添加量为0.5~2.0%。
进一步的,上述步骤1)中的乙酸乙酯的加入量为10~30倍量,温度为50~90℃。
进一步的,上述步骤1)中的醇提为加入10~30倍量70~95%酸性乙醇(pH=3~5)、40~70℃回流提取1.5~2.5h,重复1~4次。
进一步的,上述步骤1)中的水提为加入10~30倍量水提取1~4h,重复1~4次。
进一步的,上述步骤1)中的醇沉的含醇量为65~85%,醇沉时间为12~24h。
进一步的,上述步骤2)中的蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的一种或多种。
进一步的,上述步骤2)中的Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比为1∶3~1∶5。进一步的,上述步骤3)中的活性炭的加入量为0.5~1.5%,水浴时间为0.5~2h;
或加入4~7%预处理后的大孔树脂于200r/min摇床震荡吸附2h。
进一步的,上述步骤4)为:将步骤3)中脱色后的溶液装入已处理好的透析袋中,置于容器中通自来水,使水流自下而上;之后,按上述过程通纯净水透析,其中自来水透析24~48h、纯净水透析12~24h。
本发明的有益效果:本发明以干铁皮石斛粗粉为原料,通过溶剂提取法除去脂溶性成分和醇溶性糖,保证粗多糖有较高的纯度,同时结合酶法在较温和的条件下分解植物组织,加快多糖的释放,较大限度保持多糖的活性,同时还可获得铁皮石斛总生物碱,在提纯多糖的同时,减少名贵药材资源的浪费也可获得较高的经济效益;在粗多糖溶液中含有大量蛋白质,这些蛋白质会结合多糖形成糖蛋白,对后续的多糖分离造成很大的影响,本发明通过Sevag-酶联合脱蛋白法除去粗多糖溶液中蛋白质,在传统的Sevag法上结合酶法,以温和的条件使蛋白质变性,增加了蛋白脱除率,降低了多糖的损失;此外,本发明在特定步骤结合了酶法,进一步降低了有机溶剂的使用量和工艺条件,提高了产品的纯度和质量。
与现有技术相比,本发明所述的一种铁皮石斛多糖的提取及精制方法,根据副产物和杂质的特性,改变提取和萃取溶剂,适当引入生物酶,将铁皮石斛粗多糖提取率由原来20%提高到30%以上,将副产物铁皮石斛总生物碱的提取率由原来的0.6%提高到3%以上;在联合脱蛋白中采用Sevag试剂,避免了三氯乙酸法处理后多糖发黄和盐酸法分解多糖的缺点,使得到的多糖色泽洁白且含量高,经蛋白酶处理后,显著的减少了Sevag试剂使用次数,减少了有机溶剂的污染;经过本发明得到的多糖具有更优越的抗氧化性,其自由基清除率高于常规产品。
【附图说明】
图1为本发明的步骤流程示意图;
图2为本发明多糖脱色前后效果对比结果;
图3为本发明多糖部分理化性质检测结果。
【具体实施方式】
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明,但本发明不仅局限于以下具体实施例。
本发明公开了一种铁皮石斛活性成分的提取方法,主要步骤,如图1所示,具体包括:
1)酶解提取:以80目以上的干铁皮石斛粗粉为原料,加入乙酸乙酯脱脂,过滤,得到的滤渣Ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂,在40~70℃进行酶解,酶解pH为3.0~6.0;升温使酶灭活,过滤,得到的滤渣Ⅱ干燥后加入酸性乙醇加热回流进行醇提,过滤得到滤液①和滤渣Ⅲ,在干燥的滤渣Ⅲ中加水进行水提,过滤得到滤液②和滤渣Ⅳ;将滤液②浓缩至适量,加入乙醇醇沉,在2~5℃下醇沉过夜;过滤,得到的滤渣Ⅴ干燥后得到粗多糖;滤液①经过减压蒸干、1~2%盐酸水溶液溶解、二氯甲烷萃取、氨水调节pH=8~12、氯仿萃取、减压蒸干可以得到铁皮石斛总生物碱提取物。
酶试剂优选纤维素酶和/或果胶酶,添加量为0.5~2.0%;乙酸乙酯优选加入量为10~30倍量,温度为50~90℃;醇提优选加入10~30倍量70~95%酸性乙醇、40~70℃回流提取1.5~2.5h,重复1~4次;水提优选加入10~30倍量水提取1~4h,重复1~4次;醇沉优选含醇量为65~85%,醇沉时间为12~24h。
2)脱蛋白:取粗多糖复溶,加入蛋白酶30~50℃进行恒温处理,离心,取上清液,加入由氯仿:正丁醇(vol)=4.0:1~4.5:1形成的Sevag试剂,剧烈震荡,离心取上清液,重复上述步骤至无变性蛋白析出;蛋白酶优选胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的一种或多种,以除去粗多糖溶液中蛋白质;Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比优选为1∶3~1∶5。
3)脱色:向步骤2)中脱蛋白后的溶液加入0.5~1.5%活性炭,进行水浴脱色,水浴时间优选为0.5~2h(或加入4~7%预处理后的大孔树脂于200r/min摇床震荡吸附2h),得到溶液A;
4)透析:将步骤3)中脱色后的溶液A装入已处理好的透析袋中,置于容器中通自来水,使水流自下而上;之后,按上述过程通纯净水透析,其中自来水透析24~48h、纯净水透析12~24h,得到溶液B;
5)干燥:将步骤4)处理后的溶液B冷冻干燥,得到铁皮石斛多糖。
以下实例中,检测铁皮石斛多糖含量均采用苯酚-硫酸比色法,通过紫外分光光度法测定波长在488nm处的吸光度OD484,标准曲线为OD484=83.254C+0.1073(R2=0.9993);检测蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法,通过紫外分光光度法测定波长在595nm处的吸光度OD595;检测色素通过紫外分光光度法测定波长在450nm处的吸光度OD450。
铁皮石斛多糖提取率按照以下公式计算:
Figure BDA0002404077100000051
每次操作均各取0.1mL用于检测多糖及蛋白质。按下式计算蛋白脱除率及多糖保存率:
Figure BDA0002404077100000052
Figure BDA0002404077100000053
脱色率按下式计算:
Figure BDA0002404077100000054
以下实例中,检测铁皮石斛总生物碱含量采用酸性染料比色法,通过紫外分光光度法测定波长在620nm处的吸光度OD620,标准曲线为OD620=0.1370C-0.1110(R2=0.9997)。
Figure BDA0002404077100000055
以下实例中,检测铁皮石斛多糖抗氧化能力采用1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)法,通过紫外分光光度法测定波长在517nm处的吸光度OD517,标准曲线为OD517=0.1706C+0.1865(R2=0.9937)。
Figure BDA0002404077100000056
本发明所述的一种铁皮石斛多糖的提取及精制方法,根据副产物和杂质的特性,改变提取和萃取溶剂,适当引入生物酶,将铁皮石斛粗多糖提取率由原来20%提高到30.50%,将副产物铁皮石斛总生物碱的提取率由原来的0.6%提高到3.62%。在联合脱蛋白中采用Sevag试剂,避免了三氯乙酸法处理后多糖发黄和盐酸法分解多糖的缺点,使得到的多糖色泽洁白且含量高,经蛋白酶处理后,显著的减少了Sevag试剂使用次数,减少了有机溶剂的污染。经过本发明得到的多糖具有更优越的抗氧化性,其自由基清除率达到了53.21%。
以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围,所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序,所描述的方向仅限于附图。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进,亦落入本发明要求的保护范围之内。
实施例一
干铁皮石斛经粉碎过80目筛,得到铁皮石斛粗粉原料。
分别取1.0g粗粉3份。
3份均按照以下方法处理:
粗粉加入10~30倍量乙酸乙酯加热1~2h,温度为50~90℃,过滤,滤渣I干燥后加入加适量水,调pH至3.0~6.0,加入0.5~2.0%纤维素酶和/或果胶酶,40~70℃恒温酶解1.5~2.5h;迅速升温至90℃酶灭活10min,过滤,滤渣Ⅱ干燥;加入10~30倍量75~95%酸性乙醇(pH=3~5)、40~70℃回流提取1.5~2.5h进行醇提,重复两次,过滤合并滤液,得到滤液①和滤渣Ⅲ;滤渣Ⅲ干燥,加水提取两次,过滤合并滤液,得到滤液②和滤渣Ⅳ;将滤液②减压浓缩至适量,加入乙醇醇沉,在2~5℃下醇沉过夜;过滤,得到的滤渣Ⅴ干燥后得到粗多糖。
经过计算,本实施例粗多糖的平均提取率为(30.50±1.80)%。
对比例一
取与实施例一相同的1.0g干铁皮石斛粗粉3份,采用常规水提醇沉法按筛选出较佳的提取条件进行提取:用30倍量水70℃提取2h,重复提取两次。经过计算,本实施例粗多糖的平均提取率(15.01±0.64)%。
实施例二
称取3份3.0g上述实施例一所得的粗多糖,分别加100mL水溶解,按照如下酶-Sevag联合脱蛋白法进行脱蛋白:
加入胰蛋白酶30~50℃进行恒温处理,离心,取上清液,加入Sevag试剂(Sevag试剂:氯仿:正丁醇(vol)=4.0:1~4.5:1;Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比优选为1∶3~1∶5),剧烈震荡,离心取上清液,重复上述步骤至无变性蛋白析出。结果发现,重复3次操作后无明显变性蛋白沉淀。
每次操作均各取0.1mL用于检测多糖及蛋白质,检测结果如表1所示,结果以(x±s)表示。仅使用蛋白酶脱蛋白多糖保存率和蛋白脱除率分别为(97.65±1.21)%、(60.11±2.31)%;使用胰蛋白酶-Sevag联用法脱蛋白多糖保存率和蛋白脱除率分别为(84.32±1.53)%、(78.70±2.08)%。
对比例二
称取3份3.0g与实施例二相同的粗多糖,分别加100mL水溶解,按照如下Sevag剂脱蛋白法进行脱蛋白:
加入Sevag试剂(Sevag试剂:氯仿:正丁醇(vol)=4.0:1~4.5:1;Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比优选为1∶3~1∶5),剧烈震荡,离心取上清液,重复上述步骤至无变性蛋白析出。使用Sevag试剂法脱蛋白发现至少需要7次才无明显变性蛋白沉淀。
每次操作均各取0.1mL用于检测多糖及蛋白质,检测结果如表1所示,结果以(x±s)表示,最终多糖保存率和蛋白脱除率分别为(78.59±2.76)%、(73.69±2.11)%。
表1 Sevag试剂法及胰蛋白酶-Sevag联用法蛋白脱除率及多糖保存率结果
Figure BDA0002404077100000071
注:表1中每组方法三个样品,结果用平均数±方差表示;第一栏是使用蛋白酶脱蛋白,所以Sevag试剂法第一栏无数据。
实施例三
分别取3份上述实施例二中脱蛋白后的多糖溶液,分别加入0.5~1.5%活性炭,进行水浴脱色0.5~2h,抽滤后测定脱色前后的脱色率及多糖保存率,分别为(82.68±0.82)%、(86.43±0.45)%。脱色前后见图2。
对比例三
取与实施例三相同的3份脱蛋白后的多糖溶液,加入4~7%预处理后的大孔树脂于200r/min摇床震荡吸附2h,抽滤后测定脱色前后的脱色率及多糖保存率,分别为(65.52±0.99)%、(86.74±0.78)%。
实施例四
取2.0g干铁皮石斛粗粉按实施例一操作得到滤液①,减压蒸干,8mL 1~2%盐酸溶液溶解,等体积加入二氯甲烷萃取1次,氨水调水相pH=8~12,用等体积氯仿萃取5次,合并氯仿层(减压蒸干后,得到铁皮石斛总生物碱)并定容于100mL,取5mL总生物碱溶液用于检测含量并计算提取率。平行实验三次,结果以(x±s)表示,铁皮石斛总生物碱提取率为(3.62±0.20)%。
实施例五
1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)是一种稳定的自由基(易溶于乙醇,且在517nm处有最大吸光度)。当加入自由基清除剂后,DPPH吸光度会减弱或消失(DPPH吸光度减小程度与自由基清除程度呈线性关系)。因此可以利用DPPH测定铁皮石斛多糖清除自由基的能力,用来代表铁皮石斛多糖的抗氧化能力(即清除率越大,则表明物质清除能力越强,抗氧化能力越强)。
按本发明方法制得铁皮石斛多糖冻干粉,加水配置成浓度为1.0mg/mL的铁皮石斛多糖溶液;用无水乙醇配制浓度为4mg/mL的DPPH溶液。分别将3.0mL DPPH溶液加入到1.0mL铁皮石斛多糖溶液与1.0mL蒸馏水中,混匀,室温避光30min,于517nm波长处测量OD517(DPPH+铁皮石斛多糖)和OD517(DPPH+水)。将3.0mL无水乙醇加入1.0mL铁皮石斛多糖溶液,于517nm波长处测量OD517(乙醇+铁皮石斛多糖)。根据DPPH标准曲线回归方程计算出DPPH质量浓度,计算DPPH自由基清除率。平行实验三次,结果以(x±s)表示,铁皮石斛多糖的DPPH自由基清除率为(53.21±1.15)%。
对比例五
按对比例一中所述提取方法,减压浓缩,冻干后,制得铁皮石斛多糖冻干粉,加水配置成浓度为1.0mg/mL的铁皮石斛多糖溶液。按照实施例五的方法,计算DPPH自由基清除率。平行实验三次,结果以(x±s)表示,铁皮石斛多糖的DPPH自由基清除率为(42.66±1.00)%。
实施例六
平行取按本发明方法制得铁皮石斛多糖冻干粉(精多糖)和对比例五中所制得铁皮石斛多糖冻干粉(粗多糖)各4份,分别加入茚三酮试剂、碘化钾试剂、双缩脲试剂、菲林试剂,观察性状。结果见图3和表2。由此说明,经过分离纯化后,可去除大量铁皮石斛多糖里的水溶性杂质,从而提高铁皮石斛多糖的纯度。
表2精多糖和粗多糖理化性质检查结果
编号 检测试剂/反应 检测杂质 精多糖检测结果 粗多糖检测结果
1 茚三酮反应 氨基酸 阴性 阳性(黄色絮状沉淀)
2 碘化钾反应 淀粉 阴性 阳性(溶液变黑)
3 双缩脲反应 蛋白质 阴性 阳性(絮状沉淀)
4 菲林试剂 还原性糖 阴性 阴性

Claims (1)

1.一种铁皮石斛活性成分的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)酶解提取:以80目以上的干铁皮石斛粗粉为原料,加入乙酸乙酯脱脂,乙酸乙酯的加入量为10~30倍量,温度为50~90℃,过滤,得到的滤渣Ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂,在40~70℃进行酶解,酶解pH为3.0~6.0;升温使酶灭活,过滤,得到的滤渣Ⅱ干燥后加入酸性乙醇加热回流进行醇提,过滤得到滤液①和滤渣Ⅲ,在干燥的滤渣Ⅲ中加水进行水提,过滤得到滤液②和滤渣Ⅳ;将滤液②浓缩至适量,加入乙醇醇沉,在2~5℃下醇沉过夜;过滤,得到的滤渣Ⅴ干燥后得到粗多糖;滤液①经过减压蒸干、1~2%盐酸水溶液溶解、二氯甲烷萃取、氨水调节pH=8~12、氯仿萃取、减压蒸干可以得到铁皮石斛总生物碱提取物;
2)脱蛋白:取粗多糖复溶,加入胰蛋白酶30~50℃进行恒温处理,离心,取上清液,加入由氯仿:正丁醇(vol)=4.0:1~4.5:1形成的Sevag试剂,Sevag试剂与粗多糖溶液的体积比为1∶3~1∶5,剧烈震荡,离心取上清液,重复上述步骤3次可至无变性蛋白析出;
3)脱色:向步骤2)中脱蛋白后的上清液加入活性炭脱色,抽滤,得到溶液A;活性炭的加入量为每100mL溶液加入活性炭0.5~1.5g,水浴时间为0.5~2h;
4)透析:将步骤3)中脱色后的溶液A装入已处理好的透析袋中,进行透析除去水溶性小分子杂质,置于容器中通自来水,使水流自下而上,之后再通纯净水透析,其中自来水透析24~48h、纯净水透析12~24h,得到溶液B;
5)干燥:将步骤4)处理后的溶液B冷冻干燥,得到铁皮石斛多糖;
其中,所述步骤1)中,酶试剂为纤维素酶和/或果胶酶,每100mL溶液添加酶试剂0.5~2.0g;醇提为加入10~30倍量、pH=3~5的70~95%酸性乙醇在40~70℃回流提取1.5~2.5h,重复1~4次;醇沉的含醇量为65~85%,醇沉时间为12~24h;水提为加入10~30倍量水提取1~4h,重复1~4次。
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