CN114773496B - 一种高效提取香菇多糖同步脱色的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效提取香菇多糖同步脱色的方法。所述方法将脱脂香菇粉与低共熔溶剂混合后，在亚临界水亚临界水反应釜中提取，提取液再经后续处理，得到香菇多糖。本发明采用低共熔溶剂辅助亚临界水提取香菇多糖，进行提取的同时对多糖进行脱色，保证多糖得率的同时，脱色效果不弱于传统脱色方式，且多糖具有100％的保留率。

Description

一种高效提取香菇多糖同步脱色的方法
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，涉及一种高效提取香菇多糖同步脱色的方法。
背景技术
香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗感染等生物活性。香菇多糖具有较高的药用价值和营养价值，在保健品或医药制备等方面展现出良好的应用前景。传统提取多糖的方法主要为热水提取法，该方法操作简单，但存在提取效率低、过长加热时间会对多糖分子结构及生物活性产生较大影响等缺陷。为克服上述缺点，一些新型物理提取技术，包括微波辅助提取、超声辅助提取、酶法辅助提取、亚临界水辅助提取等也被应用到多糖的提取中。其中，亚临界水又称超高温水或高压热水，指在一定压力下将水加热到100～374℃时，仍保持液体状态的水。亚临界水较好的传质传热效果可以促进多糖溶出，极大的提高多糖的提取效率。
除了采用物理辅助提取多糖的方式外，溶剂提取方法如酸提法、酶提法等也被应用于多糖提取中。低共熔溶剂(Deep eutectic solvents，DESs)是一种由氢键供体(多元醇，尿素和羧酸)和氢键受体(季铵盐类，如氯化胆碱等)组成的二元或三元体系的有机溶剂，在环境中可自然降解，是一种环境友好型的化学试剂。由于低共熔溶剂本身的极性以及对物质的萃取能力，近年来被广泛应用于多糖、黄酮、多酚等物质的提取。Periaswamy等采用低共熔溶剂辅助亚临界水提取褐藻多糖，多糖得率为14.93％，其通过低共熔溶剂和亚临界水提取方式的联用，进一步提高多糖得率(P.S.Saravana,Y.-N.Cho,H.-C.Woo,B.-S.Chun,Green and efficient extraction of polysaccharides from brown seaweedby adding deep eutectic solvent in subcritical water hydrolysis,Journal ofCleaner Production 198(2018)1474-1484.)。
传统方法提取香菇多糖时会将色素一起提取出来，色素的存在导致多糖纯度降低，因此后续需要附加脱色步骤。常用的脱色方法有活性炭吸附法、过氧化氢法、大孔树脂法等，然而现有的多糖脱色方式均存在一定的缺陷，例如：采用活性炭脱色时，存在脱色时间长和多次脱色重复等问题，且活性炭的使用易造成样品的二次污染；采用双氧水脱色时，双氧水具有强烈的氧化能力，导致多糖活性受到影响，继而影响最终产品品质；采用大孔树脂脱色时，步骤繁琐且耗时较长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效提取香菇多糖同步脱色的方法，该方法能高效提取香菇多糖，同时在提取时溶剂能吸附多糖中的色素而达到脱色作用。
实现本发明目的技术方案如下：
一种高效提取香菇多糖同步脱色的方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱和丙二酸混合加入去离子水中，水浴加热，搅拌反应制成低共熔溶剂；
(2)香菇子实体烘干，磨粉，过筛去除大颗粒以及杂质，采用索氏抽提法脱脂，烘干得到脱脂香菇粉；
(3)将脱脂香菇粉与低共熔溶剂在亚临界水反应釜中混合，在140～160℃下提取10～20min，提取结束后冷却至室温；
(4)提取液离心，抽滤，除去原料残渣，经减压浓缩后醇沉过夜，离心得到多糖沉淀物；
(5)多糖沉淀物加水溶解，采用Sevage法脱除溶液中的蛋白，再进行醇沉过夜，离心得到多糖沉淀物，再次加水溶解后透析、冷冻干燥，获得多糖。
优选地，步骤(1)中，氯化胆碱与丙二酸的摩尔比为1:2，低共熔溶剂中的含水量为30％～50％；反应温度为85±5℃，反应时间为2～3h。
优选地，步骤(2)中，过筛为过50目筛；索氏抽提法中以无水乙醇为脱脂试剂，索氏抽提脱脂6h。
优选地，步骤(3)中，脱脂香菇粉与低共熔溶剂的料液比为1:20～40，g：mL。
优选地，步骤(4)或(5)中，离心速度为4000r/min，离心时间为15～20min。
优选地，步骤(4)或(5)中，醇沉条件为采用4倍体积乙醇沉淀多糖，时间为12小时，醇沉温度为4℃。
优选地，步骤(5)中，多糖溶液与sevage试剂的体积比为4:1，sevage试剂为体积比为1:4的氯仿与正丁醇的混合溶剂，脱除次数为14次。
优选地，步骤(5)中，透析袋的截留分子量为3500Da，透析时间为48h，透析温度为4℃。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明在进行多糖提取的同时对多糖进行脱色，减少了实验的操作步骤，降低了实验的繁琐程度。本发明的脱色效果不弱于传统脱色方式，且多糖具有100％的保留率。
附图说明
图1为各实施例和对照例的多糖脱色率与保留率结果图，A-C,a-e表示不同组之间的显著性差异(p<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步详细描述。
1.采用的试剂包括：氯化胆碱、丙二酸、乙醇、氯仿(三氯甲烷)、正丁醇和H2O2均为分析纯(国药试剂有限公司)，香菇子实体(扬州汊河菜市场)。
2.采用的仪器设备包括：
紫外可见分光光度计(Lambda 35，美国珀金埃尔默股份有限公司)，低速大容量离心机(L550，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，高温高压反应釜(KH-50郑州卓成仪器科技有限公司)。
3.计算公式：
(1)苯酚-硫酸法计算样品中的多糖含量计算公式：
M＝C×V×10-6 (1)
式中：M为多糖质量，g；C为粗多糖溶液中多糖的质量浓度，μg/mL；V为粗多糖溶液体积，mL。
(2)多糖得率计算公式：
式中：D1为香菇多糖得率，％；M0为苯酚硫酸法计算出的香菇多糖含量，g；M1为香菇粉质量，g。
(3)脱色率计算公式：
式中：D2为脱色率，％；OD0为未脱色样品在420nm处的吸光值；OD1为脱色处理后的样品在420n处的吸光值。
(4)多糖保留率计算公式：
式中：D3为多糖保留率，％；M3为脱色处理后多糖含量，g；M2为样品多糖含量，g。
实施例1
(1)按摩尔比1:2称取氯化胆碱以及丙二酸，加入去离子水中，85℃水浴搅拌反应2h，制得低共熔溶剂(含水量30％)。
(2)香菇子实体烘干，磨粉，过50目筛去除大颗粒以及杂质，以无水乙醇为脱脂试剂，采用索氏抽提法脱脂6h，干燥，得到脱脂香菇粉。
(3)将脱脂香菇粉与低共熔溶剂在高温高压反应釜中以料液比1：40(g:mL)混合搅拌均匀，于150℃亚临界水反应15min，提取结束后将反应釜放入流水冷却至室温。
(4)所得提取液4000r/min离心15min去除沉淀，取上清液抽滤，除去原料残渣，减压浓缩后，加入4倍体积无水乙醇，放入4℃冰箱中静置过夜，然后4000r/min离心15min，收集多糖沉淀物。
(5)将多糖沉淀物用去离子水溶解，再按体积比4:1加入Sevage试剂，充分振荡30min，在4000r/min下离心10min后收集上清液，重复操作至中间无变性蛋白质层出现。将上清液减压浓缩蒸发除去残留的Sevage试剂，并再次加入4倍体积无水乙醇，得到多糖沉淀物。所得多糖溶液在4℃下用3500Da透析袋透析48h，将截留液冷冻干燥，获得低共熔溶剂辅助亚临界水提取的香菇多糖。多糖得率为5.68％，脱色率为54.1％，多糖保留率为100％。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于亚临界反应温度为160℃，反应时间为15min，料液比为1:20，低共熔溶剂的含水量为50％。多糖得率为5.50％，脱色率为55.9％，多糖保留率为100％。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于亚临界反应温度为140℃，反应时间为15min，料液比为1:40，低共熔溶剂的含水量为50％，多糖得率为5.40％，脱色率为54.5％，多糖保留率为100％。
对照例1
采用传统热水提取法提取香菇多糖：将脱脂香菇粉末按照料液比1:30加入去离子水，在90℃下提取2h，离心以除去固体残渣。得到浓缩上清液后，加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜，4000r/min离心15min，收集沉淀。将所得沉淀用去离子水溶解，通过Sevage法脱除蛋白质，将上清液减压浓缩蒸发除去残留的Sevage试剂，并在4℃下透析48h(Mw 3500Da)，将截留液冷冻干燥获得热水提取多糖，多糖得率为5.25％。
采用活性炭法对提取出的多糖进行脱色：将1％浓度的活性炭加入到1.0mg/mL的香菇多糖溶液中，搅拌均匀后55℃下水浴2h，料液8000r/min，离心10min去除沉淀，得到脱色后的上清液。1％活性炭脱色的脱色率为59.8％，多糖保留率为68.85％。
对照例2
本对照例与对照例1基本相同，均采用传统热水提取法提取香菇多糖，不同之处在于采用过氧化氢H2O2法对提取出的多糖进行脱色：将7％过氧化氢溶液加入到1.0mg/mL的香菇多糖溶液中，混合均匀后55℃水浴2h，得到脱色后的香菇多糖溶液。7％过氧化氢脱色的脱色率为59.6％，多糖保留率为69.06％。
对照例3
本对照例与对照例1基本相同，均采用传统热水提取法提取香菇多糖，不同之处在于采用D101大孔树脂吸附脱色：量取75mL预处理树脂于锥形瓶中，加入50mL香菇多糖溶液，缓慢震荡3h脱色，过滤得到脱色溶液。D101大孔树脂脱色率为49.6％，多糖保留率为75.78％。
对照例4
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于亚临界反应温度为140℃，反应时间为15min，料液比为1:10，低共熔溶剂的含水量为50％，多糖得率为2.32％，脱色率为54.5％，多糖保留率为100％。
对照例5
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于亚临界反应温度为140℃，反应时间为15min，料液比为1:50，低共熔溶剂的含水量为50％，多糖得率为4.06％，脱色率为54.5％，多糖保留率为100％。

Claims (2)

1.一种高效提取香菇多糖同步脱色的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将氯化胆碱和丙二酸混合加入去离子水中，水浴加热，搅拌反应制成低共熔溶剂，氯化胆碱与丙二酸的摩尔比为1:2，低共熔溶剂中的含水量为30%~50%，反应温度为85±5℃，反应时间为2~3 h；
（2）香菇子实体烘干，磨粉，过筛去除大颗粒以及杂质，采用索氏抽提法脱脂，烘干得到脱脂香菇粉；
（3）将脱脂香菇粉与低共熔溶剂在亚临界水反应釜中混合，在140~160 ℃下提取10~20min，提取结束后冷却至室温，脱脂香菇粉与低共熔溶剂的料液比为1:20~40，g：mL；
（4）提取液离心，抽滤，除去原料残渣，经减压浓缩后醇沉过夜，离心得到多糖沉淀物，离心速度为4000 r/min，离心时间为15 ~20min，醇沉条件为采用4倍体积乙醇沉淀多糖，时间为12小时，醇沉温度为4℃；
（5）多糖沉淀物加水溶解，采用Sevage法脱除溶液中的蛋白，再进行醇沉过夜，醇沉条件为采用4倍体积乙醇沉淀多糖，时间为12小时，醇沉温度为4℃，离心得到多糖沉淀物，离心速度为4000 r/min，离心时间为15 ~20min，再次加水溶解后透析、冷冻干燥，获得多糖，多糖溶液与sevage试剂的体积比为4:1，sevage试剂为体积比为1:4的氯仿与正丁醇的混合溶剂，脱除次数为14次，透析袋的截留分子量为3500 Da，透析时间为48 h，透析温度为4℃。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，过筛为过50目筛；索氏抽提法中以无水乙醇为脱脂试剂，索氏抽提脱脂6 h。
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