CN113321749A - 一种高纯度香菇多糖的快速提取方法 - Google Patents

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马纯昶
范哲欢
韩奥轩
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Abstract

本发明涉及香菇多糖领域，是一种高纯度香菇多糖的快速提取方法。新鲜香菇经冷冻干燥、粉碎、浸泡、闪式提取、提取液离心、醇沉、超声复溶、离心、冷冻干燥得到香菇多糖；具体步骤如下：原料及预处理：取新鲜香菇，冷冻干燥后粉碎浸泡；闪式提取：将香菇浸泡液置于闪式提取器中提取；离心：提取液离心得到上清液；醇沉：提取液加入无水乙醇，离心得到多糖沉淀；复溶：多糖沉淀加入去离子水，超声溶解得到浸膏；冷冻干燥：将浸膏冻实后冷冻干燥，得到香菇多糖。本发明提取耗时短、产物纯度高，提高了香菇多糖提取效率，有利于香菇多糖的应用推广。

Description

一种高纯度香菇多糖的快速提取方法
技术领域
本发明涉及植物多糖提取领域，具体涉及一种香菇多糖的快速提取方法。
背景技术
香菇(Lentinus edodes)属担子菌纲、伞菌目，是一种历史悠久的食用真菌，常生长于阔叶树倒木上，春冬季是其主要生长时期，生长形态各异，多为群生，也有单生或散生等。香菇味道鲜美，气味独特，被称为“山珍之王”，在我国最早的人工种植记录更是可追溯到800年之前。
香菇多糖(Lentinan)是从香菇中提取得到的一种具有特定生物活性的植物多糖，是香菇中药理活性最显著的成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗辐射等功能，是世界上公认的免疫增强剂和干扰素。
然而，香菇多糖在香菇子实体中的含量较低，导致提取纯化过程复杂，难以得到高纯度的香菇多糖原料药。目前对于香菇多糖的提取，多采用热水浸提法、酶解法、超声或微波辅助提取法等。
专利CN 105001351 A提供了一种香菇多糖的提取方法，该法采用传统热水浸提法对香菇多糖进行提取，提取步骤耗时1～3h，多糖得率仅为3.93％，效率不高。
专利CN 110256598 A也是一种通过热水浸提法对香菇多糖进行提取的方法，该法采用分级醇沉，各醇沉组分总得率约为15％，但糖含量较低，仅为30％～50％。
专利CN 112094878.A提供了一种酶法提取香菇多糖的方法，该方法耗时长，仅酶提取步骤耗时就有12h，且需要对pH及温度进行严格控制，步骤繁琐。
由此可见，传统多糖提取手段多存耗时长、产率低等问题，且产物纯度得不到保障，通常需要进行进一步的纯化处理，这就导致终产物产率进一步降低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是，提供了一种高纯度香菇多糖的提取方法，以饱满的未开伞香菇作为原料，采用闪式提取法进行提取，提取耗时短、效率高，香菇多糖得率高、纯度高，有利于香菇多糖的应用推广。
本发明的技术方案是，一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，新鲜香菇经冷冻干燥、粉碎、浸泡、闪式提取、提取液离心、醇沉、超声复溶、冷冻干燥得到香菇多糖；具体步骤如下：
(1)预处理：取新鲜香菇，冷冻干燥后粉碎，用2～20倍去离子水浸泡；干燥时间为12～72h；
(2)闪式提取：将香菇浸泡液放入闪式提取器中提取；提取次数1～5次，提取温度室温～80℃；
(3)离心：提取液离心得到上清液；
(4)醇沉：上清液浓缩后加入无水乙醇，离心得到多糖沉淀；浓缩后液体体积与原料的物料比为1:1～1:5，加入乙醇体积为浓缩液体积的1～4倍；
(5)超声复溶：多糖沉淀加入去离子水，超声溶解得到浸膏，浸膏质量浓度为20-50mg/mL，离心除去不溶物；
(6)冷冻干燥：将浸膏冻实后冷冻干燥，得到香菇多糖；
根据本发明的一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，优选的是，步骤(1)中所述新鲜香菇味饱满未开伞新鲜香菇。香菇子实体选择未开伞中菇期子实体，菌盖直径约为1.5～2.0cm。香菇的生长时期分为菇蕾期、中菇期和菇末期，总体糖含量呈现出先上升后下降的趋势，以中菇期含量最高；开伞后的香菇由于生长消耗，其所含多糖会有部分损失，因此以未开伞的中菇期子实体为原料最佳。
根据本发明的一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，优选的是，步骤(1)冷冻干燥时间为12～72h，冷冻干燥后含水量不高于10％。
优选的是，步骤(1)粉碎过筛目数为10～100目，浸泡时间为10～60min。
优选的是，干燥温度为-80～-90℃。优选的是，用5～20倍去离子水浸泡。
采用冷冻干燥作为子实体的干燥手段，因为采用烘干温度过高，会改变多糖的化学结构和性质，且烘干后的子实体缩水严重，色素堆积导致提取得到的粗多糖成色较差，纯度较低，因此选用冷冻干燥作为干燥手段，保证香菇多糖成色及纯度的同时，确保活性不受影响。
根据本发明的一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，优选的是，步骤(2)所述提取电压为100～150V；所述提取时间为30s～3min。
根据本发明的一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，优选的是，步骤(3)中提取液在3000～10000r/min的转速下高速离心。
根据本发明的一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，优选的是，步骤(4)所述醇沉时间为8～24h，醇沉温度为4～8℃；步骤(4)所述离心速度为3000～10000r/min。加入乙醇体积为浓缩液体积的1～4倍。
将上清液浓缩至物料比为1:1～1:5，加入清液体积1～4倍的无水乙醇，使乙醇浓度约为50％～80％，醇沉温度为4～8℃，醇沉时间为8～24h。研究表明，大分子香菇多糖具有较好的生物活性，当乙醇浓度为80％左右时，大部分多糖均已沉淀，继续提高乙醇浓度不仅耗费溶剂极多，且该浓度下沉淀的多为小分子寡糖，不具有明显活性，造成浪费，因此，醇沉浓度为50～80％为宜。
根据本发明的一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，优选的是，步骤(5)所述浸膏的质量浓度为30～40mg/mL。
根据本发明的一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，优选的是，步骤(5)所述超声功率为100～400W；所述超声时间为5～60min；步骤(5)所述离心速度为3000～10000r/min。
更优选的是，超声溶解30～40min，功率为100～300W。离心5-15min去除不溶物，保留清液。
根据本发明的一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，优选的是，步骤(6)所述冷冻干燥时间为10～65h。
优选的是，步骤(6)将上述清液在-20℃下冻实后，采用冷冻干燥，温度为-80～-90℃。
冷冻干燥的原理是固态水在低压环境下直接升华形成气态水除去，因此在进行冷冻干燥前需要对样品进行预冷冻处理，使其中所含的水结成冰，一般在-20℃下完成即可；冷冻干燥的温度是指干燥过程中冷阱的温度，二者不是同一温度。
有益效果
(1)对香菇子实体进行挑选，选择糖含量最高的生长期香菇子实体作为原料，提高了香菇多糖的得率；
(2)采用冷冻干燥作为新鲜子实体以及粗多糖的干燥手段，在低温的环境下，保证了多糖的结构与活性不发生改变；
(3)采用闪式提取技术，将提取时间控制在3min以内，极大地缩短了提取时间，提高了提取效率，温度适中，在不破坏多糖结构的前提下保证了溶出率；
(4)本发明所得多糖产率高，糖含量高，故无需进行后续纯化操作，所用有机试剂仅有乙醇，成本低，危害小，可放大工业化生产，有利于香菇多糖的推广应用。
本发明不涉及粗多糖后续脱色、除蛋白以及柱层析等分离纯化手段，所得产品为醇沉后的粗多糖。在对糖含量进行测定时发现，所得粗多糖的糖含量均为90％左右，已有相当高的纯度，可作为保健品或食品添加剂的原料使用。
使用闪式提取法，以饱满未开伞中菇期子实体为原料，得到一种香菇粗多糖，该多糖得率高，纯度高，极大简化了后续提纯工艺，提高了香菇粗多糖的提取效率，为后续应用推广奠定了基础。
附图说明
图1是苯酚硫酸法中的标准曲线。
图2是实施例2的香菇多糖的高效凝胶色谱。
具体实施方式
实施例1
本发明为一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，包括以下步骤：
(1)将香菇子实体冷冻干燥，干燥温度为-90℃，干燥时间为24h，粉碎后，过50目筛网，得到香菇粉末，加入10倍去离子水浸泡，浸泡时间为30min；
(2)闪式提取，将香菇浸泡液置于闪式提取器中，设置提取电压为120V，提取时间为1min，提取次数3次，提取温度50℃，进行提取。
(3)离心，将闪式提取器内的固液混合物倾出后，采用大容量离心机在4000r/min的速度下离心10min。
(4)醇沉，将清液浓缩至物料比为1:3，加入3倍体积的无水乙醇，使乙醇浓度约为75％，醇沉温度为4℃，醇沉时间为12h。
(5)超声复溶，将上述醇沉多糖离心后，加入去离子水形成浸膏，使浸膏质量浓度约为35mg/mL，超声溶解30min，功率为100W。4000r/min的速度下离心10min去除不溶物，保留清液。
(6)干燥，将上述清液在-20℃下冻实后，采用冷冻干燥，温度为-90℃，干燥时间为12小时，得到香菇粗多糖。经苯酚硫酸法测试，以葡萄糖作为标准物质，绘制标准曲线(图1)，计算得到香菇粗多糖的糖含量为94.73％，得率为7.45％。
实施例2
本发明为一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，包括以下步骤：
(1)将香菇子实体冷冻干燥，干燥温度为-90℃，干燥时间为24h，粉碎后，过10目筛网，得到香菇粉末。加入5倍去离子水浸泡，浸泡时间为10min
(2)闪式提取，将香菇浸泡液置于闪式提取器中，设置提取电压为100V，提取时间为30s，提取次数1次，提取温度为室温，进行提取。
(3)离心，将闪式提取器内的固液混合物倾出后，采用大容量离心机在3000r/min的速度下离心10min。
(4)醇沉，将清液浓缩至物料比为1:1，加入1倍体积的无水乙醇，使乙醇浓度约为50％，醇沉温度为4℃，醇沉时间为8h。
(5)超声复溶，将上述醇沉多糖离心后，加入去离子水形成浸膏，使浸膏质量浓度约为30mg/mL，超声溶解5min，功率为100W。3000r/min的速度下离心10min去除不溶物，保留清液。
(6)干燥，将上述清液在-20℃下冻实后，采用冷冻干燥，温度为-90℃，干燥时间为8小时，得到香菇粗多糖。经测试，所得香菇粗多糖得率为8.51％，糖含量为92.71％，其高效凝胶色谱图如图2所示。
实施例3
本发明为一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，包括以下步骤：
(1)将香菇子实体冷冻干燥，干燥温度为-80℃，干燥时间为12h，粉碎后，过100目筛网，得到香菇粉末。加入20倍去离子水浸泡，浸泡时间为60min
(2)闪式提取，将香菇浸泡液置于闪式提取器中，设置提取电压为150V，提取时间为3min，提取次数5次，提取温度80℃，进行提取。
(3)离心，将闪式提取器内的固液混合物倾出后，采用大容量离心机在10000r/min的速度下离心10min。
(4)醇沉，将清液浓缩至物料比为1:5，加入4倍体积的无水乙醇使乙醇浓度约为80％，醇沉温度为4℃，醇沉时间为24h。
(5)超声复溶，将上述醇沉多糖离心后，加入去离子水形成浸膏，使浸膏质量浓度约为40mg/mL，超声溶解60min，功率为400W。10000r/min的速度下离心10min去除不溶物，保留清液。
(6)干燥，将上述清液在-20℃下冻实后，采用冷冻干燥，温度为-80℃，干燥时间为72小时，得到香菇粗多糖。经测试，所得香菇粗多糖得率为8.80％，糖含量为90.82％。

Claims (10)

1.一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：新鲜香菇经冷冻干燥、粉碎、浸泡、闪式提取、提取液离心、醇沉、超声复溶、冷冻干燥得到香菇多糖；具体步骤如下：
(1)预处理：取新鲜香菇，冷冻干燥后粉碎，用2～20倍去离子水浸泡；干燥时间为12～72h；
(2)闪式提取：将香菇浸泡液放入闪式提取器中提取；提取次数1～5次，提取温度室温～80℃；
(3)离心：提取液离心得到上清液；
(4)醇沉：上清液浓缩后加入无水乙醇，离心得到多糖沉淀；浓缩后液体体积与原料的物料比为1:1～1:5；
(5)超声复溶：多糖沉淀加入去离子水，超声溶解得到浸膏，浸膏质量浓度为20-50mg/mL，离心除去不溶物；
(6)冷冻干燥：将浸膏冻实后冷冻干燥8～72h，得到香菇多糖。
2.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述新鲜香菇味饱满未开伞新鲜香菇。
3.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(1)冷冻干燥时间为12～72h，冷冻干燥后含水量不高于10％。
4.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(2)所述提取电压为100～150V；所述提取时间为30s～3min。
5.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(3)中提取液在3000～10000r/min的转速下高速离心。
6.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(4)所述醇沉时间为8～24h，醇沉温度为4～8℃；步骤(4)所述离心速度为3000～10000r/min。
7.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(5)所述浸膏的质量浓度为30～40mg/mL。
8.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(5)所述超声功率为100～400W；所述超声时间为5～60min；步骤(5)所述离心速度为3000～10000r/min。
9.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(6)所述冷冻干燥时间为10～65h。
10.根据权利要求1所述一种高纯度香菇多糖的快速提取方法，其特征在于：步骤(6)将上述清液在-20℃下冻实后，采用冷冻干燥，温度为-80～-90℃。
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