CN109970879B - 一种白芨多糖提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药领域，公开了一种白芨多糖提取物及其制备方法，制备方法为：将白芨药材粉碎、过筛，制成白芨粉末；将白芨粉末加入水中，超声提取，离心、滤过后，制得白芨水提液；将白芨水提液浓缩后加入乙醇沉淀，取沉淀洗涤后干燥，即得白芨粗多糖；将所述白芨粗多糖加蒸馏水溶解，离心，取上清液依次进行微滤和超滤，浓缩、醇沉后取沉淀洗涤并干燥，即得白芨多糖提取物。本发明先用超声提取法，破坏白芨粉末细胞壁，利于白芨多糖充分溶出，在超声水提醇沉法制备白芨粗多糖的基础上，采用微滤‑超滤联合纯化，制备白芨多糖提取物，该法可以有效去除蛋白质、淀粉等杂质，制得的白芨多糖提取物纯度高、蛋白质含量低，且不含淀粉等非活性多糖。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，尤其是涉及一种白芨多糖提取物及其制备方法。
背景技术
白芨为兰科多年生草本植物白芨Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，本品质黏味涩、为收涩止血之要药，临床多用于肺胃出血之证。其主要药效部位为白芨胶(白芨多糖)，具有抗炎、促凝血、抗氧化等药效作用。同时，白芨多糖具较好的组织相容性、生物黏附性、生物降解性、对黏膜无刺激性，且资源丰富、廉价易得，具有生物黏附载体材料的特性。白芨多糖为中药白芨中提取的一种水溶性杂多糖，又称白芨胶、白芨甘露聚糖。其分子量分布较宽，平均分子量为10-20kD。
目前白芨多糖的提取工艺主要有水提取法、水提醇沉法、连续逆流提取法、纤维素酶解法等。以上单一的水提法都要经过高温处理，在高温处理的过程会造成白芨药材中淀粉会随多糖同时溶出，从而造成所制备的白芨多糖中含有大量的淀粉；而纤维酶酶解法在制备过程中虽然不会有淀粉等非活性多糖溶出，但在提取过程中又同时引入了蛋白质等杂质，而蛋白质和淀粉都是大分子结构在后期的纯化过程中很难除去，从而限制了白芨多糖的综合开发，如CN108251469A及CN107522794A等关于酶法提取白芨多糖的资料中，未在提取过程中涉及除去纤维素酶或果胶酶的方法及操作。
由于多糖提取时多采用水为溶剂，对其进行浓缩时较为费时费力，且无较好的解决方法。本专利采用超滤将其纯化的同时，也对白芨溶液进行了一定程度的浓缩，大大节省了人力物力，且其浓缩过程温度较低，不会破坏多糖的结构及活性，较大程度保留了白芨多糖“药辅合一”的特性，为白芨多糖后续开发及研究奠定了一定的基础。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中白芨多糖提取过程中蛋白质及淀粉等杂质难以去除，降低白芨多糖的提取纯度的问题，提供一种白芨多糖的提取方法，降低提纯后的白芨多糖中的蛋白质及淀粉含量，提高白芨多糖的纯度。且本发明采用微滤-超滤联合进行多糖的纯化，超滤在纯化多糖的同时对多糖溶液进行一定程度的浓缩，大大节省了人力物力，且其浓缩温度较低，不会破坏多糖的结构及活性，较大程度保留了白芨多糖“药辅合一”的特性，为白芨多糖后续开发及研究奠定了一定的基础。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种白芨多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将白芨药材粉碎、过筛，制成白芨粉末；
(2)将所述白芨粉末，用水超声提取，离心、滤过后，即得白芨水提液；
(3)将所述白芨水提液浓缩后加入乙醇沉淀，取沉淀洗涤后干燥，即得白芨粗多糖；
(4)将所述白芨粗多糖加蒸馏水溶解，离心，上清液依次进行微滤和超滤，超滤液经浓缩、醇沉后，取沉淀洗涤并干燥，即得白芨多糖提取物。
本发明先采用超声提取法，可以利用外界超声波以及强力搅拌的机械力破坏白芨的细胞壁，使白芨多糖提取过程中细胞壁间的阻力减小，包裹在细胞壁内的白芨多糖可充分释放出来，提高白芨多糖的提取率。然后再利用水提醇沉法提取白芨粗多糖，提取出的白芨粗多糖再经过微滤-超滤联合纯化，去除蛋白质和淀粉等杂质。在超滤的过程中，不仅纯化了白芨多糖，还对其微滤液起到浓缩的效果，大大缩短了时间，提高了效率，得到的白芨多糖纯度达到89％以上，蛋白质含量低，且不含淀粉等非活性多糖。是一种白芨多糖提取效率高、选择性好，且对白芨多糖破坏性小的白芨多糖提取方法。
作为优选，步骤(1)中的白芨药材粉碎后过40-100目筛。
作为优选，步骤(2)中在超声提取之前先加入以白芨多糖微球为载体的固定化纤维素酶进行水解，固定化纤维素酶的制备方法如下：
a)用0.5-3％的乙酸溶液溶解白芨粉末，得到1-5％的白芨多糖乙酸溶液；
b)在白芨多糖乙酸溶液中加入与白芨多糖质量比为5:1-2:1的Fe3O4粉末，超声后得到水相白芨多糖-Fe3O4溶液；
c)在搅拌状态下依次将液体石蜡和质量比为4:1-3:1的司班80和吐温80加入容器中，分散均匀后逐滴加入上述水相白芨多糖-Fe3O4溶液，高速搅拌形成稳定乳液体系后，加入2-6％的戊二醛溶液反应1-4h；
d)分别用石油醚、乙醇、蒸馏水反复洗涤产物，在外界磁场作用下收集，干燥后得到磁性白芨多糖微球；
e)在上述磁性白芨多糖微球中加入磷酸缓冲溶液和浓度为10-30mg/mL的纤维素酶溶液，吸附反应0.5-3h；
f)吸附结束后在加入95％硫酸铵溶液沉淀0.5-3h；
g)沉淀结束后加入2-6％的戊二醛溶液，20-30℃下交联反应5-10h；
h)离心分离后，用蒸馏水和醋酸缓冲溶液反复洗涤产物，得到具有磁性的固定化纤维素酶。
本发明制备出以白芨多糖微球为载体的固定化纤维素酶，在超声提取之前先加入固定化纤维素酶进行水解，可以使白芨的细胞壁分解，使白芨多糖更好的释放出来，提高白芨多糖的提取率。且固定化的纤维素酶以具有磁性的白芨多糖微球为载体，在提取后可以利用其本身能被磁场吸附的能力，将其从提取液中除去，此法简单易行，效率高，又不会大量破坏其中多糖等有益成分。
采用固定化纤维素酶，分解白芨细胞壁后经过固定化的纤维素酶作为固体可以从溶液中回收，避免加入游离酶反应后引入难以分离的蛋白质杂质。又因为白芨多糖分子中存在氨基，表面的氨基可以和蛋白质分子表面的羧基、羟基、巯基等反应，可将蛋白质分子吸附在表面，通过化学试剂进行共价、交联反应，使蛋白质分子固定，从而实现酶的固定。采用白芨多糖微球作为固定化纤维素酶的载体，可以成功将纤维素酶固定化的同时，在白芨多糖提取过程中又不会引入新的杂质。
在乳化剂和交联剂的作用下，将磁性无机粒子Fe3O4与有机高分子白芨多糖结合，形成以白芨多糖为壳、磁性粒子Fe3O4为核的具有一定磁性及球状结构的白芨多糖微球，使白芨多糖微球具有磁性，采用磁性白芨多糖微球作为载体固定化后的纤维素酶可以利用Fe3O4在磁场中受到的磁力，直接在外界磁场作用下回收，回收操作简单便捷，不会引入新的杂质。一般情况下纤维素酶在固定化后，酶的活性容易降低，而本发明先用沉淀剂形成酶聚集体，再用双功能试剂将其交联，形成具有一定空间结构的比较稳定的聚集体，制备出具有良好催化活性、操作稳定性和磁响应性的磁性固定化纤维素酶聚集体，将其用在白芨多糖的提取中，活性较好，回收率高，对温度、pH的稳定性好，且具有良好的储藏稳定性。
作为优选，步骤(2)中水与白芨粉末的质量比为90:1-5:1，超声提取时间为0.5-9h。
作为进一步优选，步骤(2)中水与白芨粉末的质量比为70:1-20:1，超声提取时间为1-7小时。
作为再进一步优选，步骤(2)中水与白芨粉末的质量比为70:1-30:1，超声时间为3-5小时，反应温度为30℃-50℃。
作为优选，步骤(3)中加入乙醇后醇沉浓度为40-80％，在4-30℃下静置12-72h，过滤，将沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，在20-100℃下干燥。
作为进一步优选，步骤(3)中加入乙醇后醇沉浓度为50-70％。，在6-15℃下静置15-42h，过滤，将沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，在30-50℃下干燥。
作为再进一步优选，步骤(3)中加入无水乙醇后乙醇浓度为55％-65％，在8-10℃静置15-24小时，过滤，将沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，在35-45℃下干燥。
作为优选，步骤(4)中，浓缩方法为减压浓缩、常压浓缩及超滤浓缩中的一种或几种，微滤选择0.22-0.8μm，超滤截留分子量为3-100KDa，滤截比为1:9-9:1，超滤温度为20-50℃，超滤次数1-5次，超滤液浓缩到0.5～4g/L、醇沉至40～90％后，取沉淀洗涤后在40-100℃下干燥。
作为进一步优选，步骤(4)中，微滤选择0.22-0.45μm，超滤截留分子量为3-10KDa，滤截比为3:7-7:3，温度为25-40℃，超滤次数2-3次，超滤液浓缩到1～2g/L、醇沉至60～80％后，取沉淀洗涤后在50-60℃下干燥。
作为进一步优选，步骤(4)中，浓缩方法为超滤-减压浓缩。
本发明还提供了一种白芨多糖提取物，按照上述任一方法制得。用上述方法制得的白芨多糖提取物，纯度高，不含淀粉等非活性多糖，蛋白质含量低，且白芨多糖的结构及活性不会被破坏，较大程度保留了白芨多糖“药辅合一”的特性，有利于白芨多糖提取物在各个领域的应用。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)采用超声提取法，可以利用外界超声波以及强力搅拌的机械力破坏白芨的细胞壁，使白芨多糖提取过程中细胞壁间的阻力减小，包裹在细胞壁内的白芨多糖可充分释放出来，提高白芨多糖的提取率；
(2)在利用水提醇沉法提取白芨粗多糖的基础上，再经过微滤-超滤联合纯化，超滤-减压浓缩联合浓缩，可以有效去除蛋白质、淀粉、低聚糖和单糖等杂质，且大大提高了效率；
(3)在进行超声提取之前先加入固定化纤维素酶进行水解，可以使白芨的细胞壁分解，使白芨多糖更好的释放出来，提高白芨多糖的提取率；
(4)采用以带有磁性的白芨多糖微球为载体的固定化纤维素酶，可以在外部磁场作用下直接将酶回收，分解白芨细胞壁的同时不会引入蛋白质等新的杂质，且固定化纤维素酶比游离酶稳定性高，可反复使用；
(5)制得的白芨多糖提取物纯度高，蛋白质含量低，且不含淀粉等非活性多糖，白芨多糖的结构及活性不会被破坏，较大程度保留了白芨多糖“药辅合一”的特性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1：
将白芨药材粉碎过40目筛，称取50g粉粹后的白芨粉末，在搅拌状态下加入3500mL水中，在搅拌速度为27r/min、超声频率为28kW的条件下超声提取9小时后，离心、过滤，获得白芨水提液。
将上述获得的白芨水提液浓缩至0.1g/mL生药浓度后，在单方向搅拌状态下加入无水乙醇至乙醇浓度为60％，4℃下静置12h，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后20℃真空干燥，得到白芨粗多糖。
将上述白芨粗多糖加入去离子水溶解，离心，取上清液用微滤仪(0.22μm)过滤，取微滤液在0.10MPa压力，超滤截留分子量为100KDa，50℃下进行2次超滤，滤截比为1:9，获得超滤液，将超滤液减压浓缩到0.5g/L，再醇沉至40％后，取沉淀洗涤后在60℃真空干燥，即得白芨多糖提取物。
实施例2：
将白芨药材粉碎过80目筛，称取50g粉粹后的白芨粉末，在搅拌状态下加入4500mL水中，在搅拌速度为27r/min、超声频率为28kW的条件下超声提取5小时后，离心、过滤，获得白芨水提液。
将上述获得的白芨水提液浓缩至0.1g/ml生药浓度后，在单方向搅拌状态下加入无水乙醇至乙醇浓度为40％，10℃下放置24小时，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后50℃真空干燥，得到白芨粗多糖。
将上述白芨粗多糖加入去离子水溶解，高速离心，取上清液用微滤仪(0.45μm)过滤，取微滤液在0.10MPa压力，超滤截留分子量为10KDa，40℃下进行1次超滤，滤截比为6:4，获得超滤液，将超滤液常压浓缩到1g/L，再醇沉至60％后，取沉淀洗涤后在40℃真空干燥，即得白芨多糖提取物。
实施例3：
将白芨药材粉碎过100目筛，称取50g粉粹后的白芨粉末，在搅拌状态下加入250mL水中，在搅拌速度为27r/min、超声频率为28kW的条件下超声提取0.5小时后，离心、过滤，获得白芨水提液。
将上述获得的白芨水提液浓缩至0.1g/ml生药浓度后，在单方向搅拌状态下加入无水乙醇至乙醇浓度为80％，30℃下放置72小时，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后40℃真空干燥，得到白芨粗多糖。
将上述白芨粗多糖加入去离子水溶解，高速离心，取上清液用微滤仪(0.8μm)过滤，取微滤液在0.10MPa压力，超滤截留分子量为3KDa，20℃下进行5次超滤，滤截比为9:1，获得超滤液，将超滤液超滤-减压浓缩到2g/L，再醇沉至80％后，取沉淀洗涤后在80℃真空干燥，即得白芨多糖提取物。
实施例4：
固定化纤维素酶的制备：将用实施例1中方法制得的白芨多糖提取物溶于0.5％浓度的乙酸溶液中，得到5％的白芨多糖乙酸溶液，取40ml白芨多糖乙酸溶液置于100mL烧杯中，加入与白芨多糖质量比为2:1的Fe3O4粉末，40kHz超声作用15min后得到水相白芨多糖-Fe3O4溶液。
依次将80mL液体石蜡、5.4g乳化剂(4.3g司班80和1.1g吐温80)加入1L的三口烧瓶中，低速搅拌15min，分散均匀后，逐滴加入配置好的水相白芨多糖-Fe3O4溶液，持续高速搅拌30min形成稳定乳液体系后，再加入10mL 6％的戊二醛溶液交联反应1h，最后用3mol/LNaOH溶液调节pH到9，升温到70℃继续搅拌2h，即可制得磁性白芨多糖微球。反应结束后，分别用石油醚、乙醇、蒸馏水反复洗涤微球，用磁铁收集后置于40℃烘箱干燥。
称取0.2g上述磁性白芨多糖微球于50mL离心管中，加入5mL磷酸缓冲溶液和1mL浓度为10mg/mL的纤维素酶溶液，在摇床上吸附反应0.5h。吸附结束后将离心管放置在冰水浴中，加入5mL 95％硫酸铵溶液沉淀30min，接着加入1mL浓度为3％的戊二醛溶液，在20℃交联反应7h后，离心处理，用蒸馏水、0.05mol/L pH＝5.0醋酸缓冲溶液反复洗涤3次，得到固定化纤维素酶。
白芨多糖提取物的制备：将白芨药材粉碎过40目筛，称取50g粉粹后的白芨粉末，在搅拌状态下加入3500mL水中，加入上述固定化纤维素酶，50℃下酶解反应5h，在搅拌速度为27r/min、超声频率为28kW的条件下超声提取9小时后，离心、过滤，获得白芨水提液。
将上述获得的白芨水提液浓缩至0.1g/mL生药浓度后，在单方向搅拌状态下加入无水乙醇至乙醇浓度为60％，4℃下静置12h，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后20℃真空干燥，得到白芨粗多糖。
将上述白芨粗多糖加入去离子水溶解，离心，取上清液用微滤仪(0.22μm)过滤，取微滤液在0.10MPa压力，超滤截留分子量为100KDa，50℃下进行2次超滤，滤截比为1:9，获得超滤液，将超滤液减压浓缩到0.5g/L，再醇沉至40％后，取沉淀洗涤后在60℃真空干燥，即得白芨多糖提取物。
实施例5：
固定化纤维素酶的制备：将用实施例1中方法制得的白芨多糖提取物溶于2.5％浓度的乙酸溶液中，得到3％的白芨多糖乙酸溶液，取40ml白芨多糖乙酸溶液置于100mL烧杯中，加入与白芨多糖质量比为3:1的Fe3O4粉末，40kHz超声作用15min后得到水相白芨多糖-Fe3O4溶液。
依次将80mL液体石蜡、5.4g乳化剂(4.0g司班80和1.4g吐温80)加入1L的三口烧瓶中，低速搅拌15min，分散均匀后，逐滴加入配置好的水相白芨多糖-Fe3O4溶液，持续高速搅拌30min形成稳定乳液体系后，再加入10mL 4％的戊二醛溶液交联反应3h，最后用3mol/LNaOH溶液调节pH到9，升温到70℃继续搅拌2h，即可制得磁性白芨多糖微球。反应结束后，分别用石油醚、乙醇、蒸馏水反复洗涤微球，用磁铁收集后置于40℃烘箱干燥。
称取0.2g上述磁性白芨多糖微球于50mL离心管中，加入5mL磷酸缓冲溶液和1mL浓度为20mg/mL的纤维素酶溶液，在摇床上吸附反应3h。吸附结束后将离心管放置在冰水浴中，加入5mL 95％硫酸铵溶液沉淀1.5h，接着加入1mL浓度为6％的戊二醛溶液，在30℃交联反应5h后，离心处理，用蒸馏水、0.05mol/L pH＝5.0醋酸缓冲溶液反复洗涤3次，得到固定化纤维素酶。
白芨多糖提取物的制备：将白芨药材粉碎过40目筛，称取50g粉粹后的白芨粉末，在搅拌状态下加入1000mL水中，加入上述固定化纤维素酶，60℃下酶解反应2h，在搅拌速度为27r/min、超声频率为28kW的条件下超声提取7小时后，离心、过滤，获得白芨水提液。
将上述获得的白芨水提液浓缩至0.1g/mL生药浓度后，在单方向搅拌状态下加入无水乙醇至乙醇浓度为50％，15℃下静置15h，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后30℃真空干燥，得到白芨粗多糖。
将上述白芨粗多糖加入去离子水溶解，离心，取上清液用微滤仪(0.22μm)过滤，取微滤液在0.10MPa压力，超滤截留分子量为10KDa，25℃下进行3次超滤，滤截比为3:7，获得超滤液，将超滤液减压浓缩到4g/L，再醇沉至90％后，取沉淀洗涤后在50℃真空干燥，即得白芨多糖提取物。
实施例6：
固定化纤维素酶的制备：将用实施例1中方法制得的白芨多糖制品溶于3％浓度的乙酸溶液中，得到1％的白芨多糖乙酸溶液，取40ml白芨多糖乙酸溶液置于100mL烧杯中，加入与白芨多糖质量比为5:1的Fe3O4粉末，40kHz超声作用15min后得到水相白芨多糖-Fe3O4溶液。
依次将80mL液体石蜡、5.4g乳化剂(4.2g司班80和1.2g吐温80)加入1L的三口烧瓶中，低速搅拌15min，分散均匀后，逐滴加入配置好的水相白芨多糖-Fe3O4溶液，持续高速搅拌30min形成稳定乳液体系后，再加入10mL 2％的戊二醛溶液交联反应4h，最后用3mol/LNaOH溶液调节pH到9，升温到70℃继续搅拌2h，即可制得磁性白芨多糖微球。反应结束后，分别用石油醚、乙醇、蒸馏水反复洗涤微球，用磁铁收集后置于40℃烘箱干燥。
称取0.2g上述磁性白芨多糖微球于50mL离心管中，加入5mL磷酸缓冲溶液和1mL浓度为30mg/mL的纤维素酶溶液，在摇床上吸附反应2.5h。吸附结束后将离心管放置在冰水浴中，加入5mL 95％硫酸铵溶液沉淀3h，接着加入1mL浓度为2％的戊二醛溶液，在25℃交联反应10h后，离心处理，用蒸馏水、0.05mol/L pH＝5.0醋酸缓冲溶液反复洗涤3次，得到固定化纤维素酶。
白芨多糖提取物的制备：将白芨药材粉碎过40目筛，称取50g粉粹后的白芨粉末，在搅拌状态下加入1500mL水中，加入上述固定化纤维素酶，55℃下酶解反应3h，在搅拌速度为27r/min、超声频率为28kW的条件下超声提取1小时后，离心、过滤，获得白芨水提液。
将上述获得的白芨水提液浓缩至0.1g/mL生药浓度后，在单方向搅拌状态下加入无水乙醇至乙醇浓度为70％，6℃下静置42h，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后100℃真空干燥，得到白芨粗多糖。
将上述白芨粗多糖加入去离子水溶解，离心，取上清液用微滤仪(0.22μm)过滤，取微滤液在0.10MPa压力，超滤截留分子量为100KDa，30℃下进行3次超滤，滤截比为7:3，获得超滤液，将超滤液减压浓缩到1.5g/L，再醇沉至70％后，取沉淀洗涤后在55℃真空干燥，即得白芨多糖提取物。
对比例1：
称取50g白芨饮片，在搅拌状态下加入3500mL水中，在搅拌速度为27r/min、超声频率为28kW的条件下超声提取9小时后，离心、过滤，获得白芨水提液。
将上述获得的白芨水提液浓缩至0.1g/mL生药浓度后，在单方向搅拌状态下加入无水乙醇至乙醇浓度为60％，4℃下静置12h，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后20℃真空干燥，得到白芨粗多糖。
将上述白芨粗多糖加入去离子水溶解，离心，取上清液用微滤仪(0.22μm)过滤，取微滤液在0.10MPa压力，超滤截留分子量为100KDa，50℃下进行2次超滤，滤截比为1:9，获得超滤液，将超滤液减压浓缩到0.5g/L，再醇沉至40％后，取沉淀洗涤后在60℃真空干燥，即得白芨多糖提取物。
对比例2：
称取50g白芨饮片，在搅拌状态下加入4500mL水中，在搅拌速度为27r/min、超声频率为28kW的条件下超声提取5小时后，离心、过滤，获得白芨水提液。
将上述获得的白芨水提液浓缩至0.1g/ml生药浓度后，在单方向搅拌状态下加入无水乙醇至乙醇浓度为40％，10℃下放置24小时，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后50℃真空干燥，得到白芨粗多糖。
将上述白芨粗多糖加入去离子水溶解，高速离心，取上清液用微滤仪(0.45μm)过滤，取微滤液在0.10MPa压力，超滤截留分子量为10KDa，40℃下进行1次超滤，滤截比为6:4，获得超滤液，将超滤液减压浓缩到0.5g/L，再醇沉至40％后，取沉淀洗涤后在40℃真空干燥，即得白芨多糖提取物。
对上述实施例和对比例中白芨多糖的提取率、白芨多糖的纯度、提取物中的淀粉和蛋白质含量进行测量和计算，结果如表1所示：
表1：白芨多糖的提取率和纯度以及提取物中淀粉和蛋白质含量。
由表1可知，用白芨药材制成的白芨粉末为原料比使用白芨饮片为原料提取白芨多糖的提取率、白芨多糖纯度都有显著提高。
在超声提取之前先使用固定化纤维素酶对白芨粉末进行水解，比直接对白芨粉末进行超声提取的提取率和白芨多糖纯度有显著提高。
本发明提供的白芨多糖提取方法，白芨多糖的提取率高，原料利用率高，制得的白芨多糖提取物纯度高。
Claims (9)
1.一种白芨多糖提取物的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将白芨药材粉碎、过筛，制成白芨粉末；
（2）将所述白芨粉末加入水中，并加入固定化纤维素酶进行酶解，然后用水超声提取，离心、滤过后，即得白芨水提液；
所述固定化纤维素酶的制备方法如下：
a) 用0.5-3%的乙酸溶液溶解白芨粉末，得到1-5%的白芨多糖乙酸溶液；
b) 在白芨多糖乙酸溶液中加入与白芨多糖质量比为5:1-2:1的Fe3O4粉末，超声后得到水相白芨多糖- Fe3O4溶液；
c) 在搅拌状态下依次将液体石蜡和质量比为4:1-3:1的司班80和吐温80加入容器中，分散均匀后逐滴加入上述水相白芨多糖- Fe3O4溶液，高速搅拌形成稳定乳液体系后，加入2-6%的戊二醛溶液反应1-4h；
d) 分别用石油醚、乙醇、蒸馏水反复洗涤产物，在外界磁场作用下收集，干燥后得到磁性白芨多糖微球；
e) 在上述磁性白芨多糖微球中加入磷酸缓冲溶液和浓度为10-30mg/mL的纤维素酶溶液，吸附反应0.5-3h；
f) 吸附结束后在加入95%硫酸铵溶液沉淀0.5-3h；
g) 沉淀结束后加入2-6%的戊二醛溶液，20-30℃下交联反应5-10h；
h) 离心分离后，用蒸馏水和醋酸缓冲溶液反复洗涤产物，得到具有磁性的固定化纤维素酶；
（3）将所述白芨水提液浓缩后加入乙醇沉淀，取沉淀洗涤后干燥，即得白芨粗多糖；
（4）将所述白芨粗多糖加蒸馏水溶解，离心，上清液依次进行微滤和超滤，超滤液经浓缩、醇沉后，取沉淀洗涤并干燥，即得白芨多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的一种白芨多糖提取物的制备方法，其特征是，步骤（1）中的白芨药材粉碎后过40-100目筛。
3.根据权利要求1所述的一种白芨多糖提取物的制备方法，其特征是，步骤（2）中水与白芨粉末的质量比为90:1-5:1，超声提取时间为0.5-9h。
4.根据权利要求3所述的一种白芨多糖提取物的制备方法，其特征是，步骤（2）中水与白芨粉末的质量比为70:1-20:1，超声提取时间为1-7h。
5.根据权利要求1所述的一种白芨多糖提取物的制备方法，其特征是，步骤（3）中加入乙醇后醇沉浓度为40-80%，在4-30°C下静置12-72h，过滤，将沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，在20-100°C下干燥。
6.根据权利要求5所述的一种白芨多糖提取物的制备方法，其特征是，步骤（3）中加入乙醇后醇沉浓度为50-70%，在6-15°C下静置15-42小时，过滤，将沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，在30-50°C下干燥。
7.根据权利要求1所述的一种白芨多糖提取物的制备方法，其特征是，步骤（4）中，浓缩方法为减压浓缩、常压浓缩及超滤浓缩中的一种或几种，微滤选择0.22-0.8μm，超滤截留分子量为3-100KDa，超滤温度为20-50°C，超滤次数1-5次，超滤液浓缩到0.5~4g/L、醇沉至40~90%后，取沉淀洗涤后在40-100°C下干燥。
8.根据权利要求7所述的一种白芨多糖提取物的制备方法，其特征是，步骤（4）中，微滤选择0.22-0.45μm，超滤截留分子量为3-10KDa，温度为25-40°C，超滤次数2-3次，超滤液浓缩到1~2g/L、醇沉至60~80%后，取沉淀洗涤后在50-60°C下干燥。
9.一种白芨多糖提取物，其特征是，按照权利要求1-8所述任一方法制得。
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