CN101899174A

CN101899174A - 用作化妆品原料的白芨多糖复合物及其制备方法

Info

Publication number: CN101899174A
Application number: CN 201010250402
Authority: CN
Inventors: 赵毅; 张婷婷; 姚志蕊; 陈婷婷; 马立伟; 许至安
Original assignee: JIANONG BIOCHEMICAL TECHNOLOGY (CHINA) Co Ltd
Current assignee: JIANONG BIOCHEMICAL TECHNOLOGY (CHINA) Co Ltd
Priority date: 2010-08-11
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2030-08-11
Also published as: CN101899174B

Abstract

本发明提供了用作化妆品原料的白芨多糖复合物及其制备方法，白芨块茎经干燥、粉碎、提取、酶处理、浓缩、干燥等步骤进行处理获得白芨多糖，然后将白芨多糖经过酶加工处理、色谱精制，制成一定分子量的小分子白芨多糖，将白芨多糖与小分子白芨多糖按照1∶1～1∶20比例复配成白芨多糖复合物。本发明的有益效果主要体现在：本法脱除蛋白效率更高，生产工艺绿色环保，产物后处理简便易操作，简化了生产工艺，降低了生产成本，且首次将白芨多糖复合物应用到化妆品中。

Description

用作化妆品原料的白芨多糖复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种作为化妆品原料的白芨多糖复合物及其制备方法与一种美白保湿抗衰老化妆品，属于天然植物深加工技术领域。

背景技术

白芨(Bletillast riata Reichb.f.)兰科白芨属，又称小白芨、莲及草、甘根、白根、竹粟胶、雪如来、紫兰(根)等，常见于荫蔽草丛或林下潮湿地，因其根色白而连生，故名之，在我国、日本及琉球均有分布。

现代研究分析表明，白芨中含有大量的植物性多糖，在干燥的鳞茎组织中含量约为40％～50％，这些多糖主要由β-1，4-甘露糖、β-1，4-葡萄糖和β-1，6-葡萄糖残基组成，属中性杂多糖。

白芨在我国民间作为药用已有上千年历史，白芨已成为现在使用的不少中成药中的主要成分之一，民间常将其作为胶粘性止血剂，不仅可以补肺、生肌、祛痰、止血、治疗吐血、肺病、咳血、慢性胃溃疡等，也可外用治疗疮毒溃烂。例如白芨配伍阿胶、枇杷叶、藕节用于治疗由阴虚引起的咳血；配伍乌贼骨用于治疗吐血；单独或配伍煅石膏用于外伤组织的外敷；配伍金银花、川贝母、甜花粉等构成“内消散”的主要成分；白芨粉末与芝麻油调和后可治疗组织烫伤等。

迄今为止，国内有关白芨多糖的制备文献不多，即使是有，也是常用sevag法来脱除蛋白质，这样的方法效率不高，申请号为20071019199.1的专利申请公开了一种采用蛋白酶去除植物蛋白来制得白芨多糖胶精制工艺，此法使得脱除蛋白效率得到提高，但是其中采用了丙酮乙醚等物质，最后产物后处理显得困难，会给环境造成污染，不利于环保。而且至今尚没有能将白芨应用于化妆品领域。

发明内容

本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种作为化妆品原料的白芨多糖复合物及其制备方法与用途。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

用作化妆品原料的白芨多糖复合物，其特征在于：该复合物包含20～80KDa的小分子白芨多糖和500～700KDa的白芨多糖，前者与后者的重量配比为1∶1～1∶20。

进一步地，以上所述用作化妆品原料的白芨多糖复合物的制备方法，

(1)按以下步骤制备所述20～80KDa的小分子白芨多糖：

步骤一：粉碎：将干燥的白芨块茎粉碎至100目；

步骤二：粗提取：加入70～75％乙醇水溶液煮沸，白芨块茎粉碎料与乙醇液质量体积比比为1∶5～1∶20，重复提取三次，去除脂溶性成分和植物色素，收集沉淀；

步骤三：再提取：向沉淀中加入去离子水，加热并维持温度50～55℃，连续搅拌2小时，重复提取两次；

步骤四：过滤浓缩：离心，收集上清液，过滤，浓缩至原体积的1/10～1/2；

步骤五：加酶：向浓缩液中加入纤维素酶，维持温度45～50℃，搅拌反应30～60分钟；

步骤六：灭酶：快速升温至100℃，煮沸5～10分钟，灭活纤维素酶；

步骤七：除酶：降温至50℃，加入木瓜蛋白酶，反应脱除植物蛋白及失活的纤维素酶，高速离心去除木瓜蛋白酶和一些脂溶性成分；

步骤八：收集：收集上清液，搅拌后加入上清液的三倍体积乙醇，放置12～24小时，直至沉淀完全；

步骤九：离心20分钟，收集上清液，回收乙醇，将沉淀真空干燥，得到小分子白芨多糖。

(2)按以下步骤制备所述500～700KDa的白芨多糖：

步骤一：粉碎：将干燥的白芨块茎粉碎至100目；

步骤二：粗提取：加入70～75％乙醇水溶液煮沸，白芨块茎粉碎料与乙醇液质量体积比比为1∶5～1∶2，重复提取三次，去除脂溶性成分和植物色素，收集沉淀；

步骤五：加酶：向浓缩液中加入木瓜蛋白酶，维持温度45～50℃，搅拌反应30～60分钟；

步骤六：收集：高速离心30分钟，收集上清液，搅拌后加入上清液的三倍体积乙醇，4～6℃放置12～24小时，直至沉淀完全；

步骤七：离心20分钟，收集上清液，回收乙醇，将沉淀真空干燥，得到白芨多糖；

(3)将(1)和(2)制得的小分子白芨多糖和白芨多糖按1∶1～1∶20的重量比复配，制得白芨多糖复合物。

进一步地，以上所述的用作化妆品原料的白芨多糖复合物的制备方法，所述小分子白芨多糖的制备过程中，步骤五所述纤维素酶的比活力为400u/mg，且纤维素酶与白芨提取液的质量体积比为1∶100000～1∶100。

进一步地，以上所述所述的用作化妆品原料的白芨多糖复合物的制备方法，所述小分子白芨多糖的制备过程中，步骤七加入木瓜蛋白酶以脱除植物蛋白及失活纤维素酶的反应时间为1～3小时。

进一步地，以上所述所述的用作化妆品原料的白芨多糖复合物的制备方法，制备小分子白芨多糖的步骤七和制备白芨多糖的步骤五，加入的木瓜蛋白酶的比活力均为600u/mg，且木瓜蛋白酶与白芨提取液的质量体积比均为1∶100000～1∶100。

本发明的有益效果主要体现在：本发明在制备白芨多糖和小分子白芨多糖的工艺中用木瓜蛋白酶去除植物蛋白，与常用的Sevage法相比，脱除蛋白效率更高，脱除蛋白后白芨多糖中蛋白含量在0.2％以下，由于在整个生产过程中不引入氯仿等有机溶剂，未用到水和乙醇之外的其他任何溶剂，生产工艺绿色环保，产物后处理简便易操作，简化了生产工艺，降低了生产成本。而且也是首次将白芨多糖复合物作为一种活性原料添加到化妆品中，，拓展了白芨的应用。

附图说明

图1：白芨多糖和降解白芨多糖中蛋白含量经BCA法检测结果示意图。

图2：燕麦葡萄糖标准曲线示意图。

图3：白芨多糖含量标准曲线示意图。

图4：白芨多糖复合物对B16细胞增殖的影响示意图。

图5：白芨多糖复合物对HaCat角质形成细胞增殖的影响示意图。

图6：白芨多糖复合物对成纤维增殖的影响示意图。

图7：白芨多糖和小分子白芨多糖对B16黑色素含量的影响示意图。

图8：BCA法测定蛋白浓度标准曲线示意图。

图9：白芨多糖复合物对B16来源酪氨酸酶的抑制效果示意图。

图10：不同浓度白芨多糖复合物对B16细胞中TRP1，TRP2，PMEL-17表达的影响示意图。

图11：白芨多糖复合物对HaCat细胞中VEGF表达量的影响示意图。

图12：经紫外照射的HaCat中Capase-9的表达量在添加白芨多糖复合物后的变化示意图。

图13：荧光值/蛋白含量对白芨多糖提取物浓度影响示意图。

图14：含有白芨多糖复合物的产品即使保湿效果示意图。

图15：含有白芨多糖复合物的产品对皮肤中黑色素含量的影响示意图。

图16：含有白芨多糖复合物的产品对皮肤亮度提升效果示意图。

图17：含有白芨多糖复合物的产品对皮肤角质层水分含量的影响示意图。

图18：含有白芨多糖复合物的产品对水分透皮散失率影响示意图。

图19：含有白芨多糖复合物的产品抗衰老效果示意图。

具体实施方式

本发明揭示了一种作为化妆品原料的白芨多糖复合物，该复合物包含20～80KDa的小分子白芨多糖和500～700KDa的白芨多糖，前者与后者的重量配比为1∶1～1∶20。

该白芨多糖复合物包含以下步骤：

(1)按以下步骤制备所述小分子白芨多糖：

步骤一：粉碎：将干燥的白芨块茎粉碎至100目；

步骤五：加酶：向浓缩液中加入纤维素酶，维持温度45～50℃，搅拌反应30～60分钟，纤维素酶的比活力为400u/mg，且纤维素酶与白芨提取液的质量体积比为1∶100000～1∶100；

步骤七：除酶：降温至50℃，加入木瓜蛋白酶以脱除植物蛋白及失活纤维素酶，反应时间为1～3小时，高速离心去除木瓜蛋白酶和一些脂溶性成分，木瓜蛋白酶的比活力为6000u/mg，且木瓜蛋白酶与白芨提取液的质量体积比为1∶100000～1∶100；

(2)按以下步骤制备所述白芨多糖：

步骤一：粉碎：将干燥的白芨块茎粉碎至100目；

步骤五：加酶：向浓缩液中加入木瓜蛋白酶，维持温度45～50℃，搅拌反应30～60分钟，木瓜蛋白酶的比活力为6000u/mg，且木瓜蛋白酶与白芨提取液的质量体积比为1∶100000～1∶100；

(3)将(1)和(2)制备获得的所述小分子白芨多糖和白芨多糖按1∶1～1∶20的重量比进行复配。

白芨多糖复合物在制备美白保湿化妆品过程中可作为添加剂加入。该化妆品的基质是动植物油、矿物油、蜡、高级醇、脂肪醇、硅油、表面活性剂、磷脂、醇类、多元醇类、水溶性聚合物、油溶性聚合物类、矿物质或去离子水，化妆品的剂型为水剂、霜剂、油剂、洗液或乳状液。

采用上述方法获得的白芨多糖复合物通过利用黑色素瘤细胞(B16-F1)模型，人永生化角质形成细胞(HaCat)模型和人皮肤成纤维细胞模型检验表明白芨多糖复合物对三种细胞均无细胞毒性，有抑制B16中黑色素产生的作用，不影响已产生的酪氨酸酶的活性，而是通过降低TRP2、PLEM-17的表达，从而抑制黑色素产生的作用，充分表明白芨多糖复合物是一种有效且安全的美白剂。而且可以提高HaCat细胞中VEGF的表达量，促进甘油的合成，抵抗和修复紫外线UVA、UVB对细胞造成的损伤，抑制紫外线照射引起的细胞凋亡，清除细胞中过量产生的活性氧(ROS)。同时动物安全性和刺激性实验证明，白芨多糖复合物安全，无刺激。

将白芨多糖复合物添加到化妆品中，配制成具有美白，保湿、抗衰老等作用的功能化妆品，通过无创性皮肤测试模型研究该白芨多糖复合物对皮肤角质层含水量，皮肤透皮水分散失率，皮肤色度，皮肤皱纹和弹性的影响。实验结果表明白芨多糖复合物可修复皮肤屏障，提高皮肤水分含量，美白皮肤，促进角质更新，提高皮肤弹性，抵御紫外伤害，延缓皮肤衰老的作用。

具体的检测方法如下：

一、蛋白浓度的测定；

利用BCA法测定蛋白浓度，采用Thermo scientific生产的BCATMProtein Assay Kit进行测定，白芨多糖和降解白芨多糖中蛋白含量经此方法检测结果如图1所示。

表1、待测样品的吸光值

二、多糖分子量测定；

利用HPLC方法测定多糖分子量：

以燕麦β-Glucan(武汉百特纯大分子科技有限公司)做标准品，标准曲线如图2所示；

所制备白芨多糖和小分子白芨多糖的分子量检测结果如表3所示：测定表明降解后小分子白芨多糖的分子量在5～40KDa之间。

表2、标准品HPLC保留时间与对应的分子量表

标准品分子量(1×10⁴Da)	保留时间	LOGeMW
			1.1	16.732	0.09531
8.1	14.811	2.091864
			19.06	14.128	2.947592
29	13.574	3.367296
			50	13.139	3.912023

表3、待测样品的保留时间及计算分子量：

样品名称	保留时间	LOGeMw	分子量(万)
				小分子白芨多糖1的1％水溶液	17.43	-0.57921	0.56033918

小分子白芨多糖2的1％水溶液	16.268	0.616601	1.852620642
				小分子白芨多糖3的1％水溶液	14.804	2.123204	8.357869917
小分子白芨多糖4的1％水溶液	13.35	3.619515	37.31946349
				白芨多糖的1％水溶液	12.718	4.269906	71.5149272

三、多糖浓度的测定；

本发明采用苯酚硫酸法测定多糖浓度，以葡萄糖为标准品，将待测样品编号：1、白芨多糖；2、降解白芨多糖；3、白芨多糖复合物；4、未经木瓜蛋白酶脱除蛋白的白芨多糖。标准曲线如图3所示；所制备白芨多糖和小分子白芨多糖的多糖含量检测结果见表5。

表4、多糖浓度与光吸收值表

葡萄糖浓度(mg/ml)	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.1
							吸光值	0.43	0.115	0.206	0.273	0.338	0.093
葡萄糖浓度(mg/ml)	0.12	0.14	0.16	0.18	0.2
							吸光值	0.535	0.594	0.71	0.803	0.885

表5、待测样品吸光值与计算出的多糖含量

样品	1	2	3	4
					吸光值	0.898	0.942	0.935	0.895
样品多糖浓度(mg/ml)	0.207	0.217	0.216	0.2063
					多糖含量(％)	103.5	108.7	107.9	103.15

四、细胞增殖测定；

利用细胞试验中广泛使用的MTT测定细胞增殖的方法，测定结果如图4：其中，图4中每个浓度五组平行，F检验(P＜0.05)，由图4可知白芨多糖对B16无细胞毒性，存活率均在90％以上。

白芨多糖复合物对HaCat角质形成细胞增殖的影响如图5所示：其中，图5中每个浓度五组平行，F检验(P＜0.05)，由图5得知在最高浓度为2mg/ml时，细胞存活率依然为105％，证明无细胞毒性。

白芨多糖复合物对成纤维细胞增殖的影响如图6所示，其中，图6中每个浓度五组平行，F检验(P＜0.05)。

五、白芨多糖复合物对黑色含量影响测定；

1、细胞传代分盘，用含10％FCS，10ng/ml MSH的DMEM培养基培养。

2、细胞贴壁后，加入待测样品，每个样品设置3～6组平行，同时设置空白对照，溶剂对照，阳性对照。

3、空白细胞长至90％满时，消化，用培养皿中培养基制成细胞悬液0.7ml，移入1.5ml离心管中，再用0.7ml培养基冲洗，移入同一管中。

4、1000rpm离心10min，弃去上清。

5、每支离心管中加入0.7ml Tris-Triton溶液，50℃烘箱放置2小时。

6、加入0.7ml 20％TCA溶液，放置1小时后，8500rpm离心20分钟。

7、小心用移液器吸去上清，丢弃，离心管敞口放在50℃鼓风干燥箱中烘干。

8、用无水乙醇洗涤两次，烘干。

9、每支离心管中加入200ul 3N NaOH，放入沸水浴中煮沸20min。

10、冷却后移入96孔板，测定450nm的吸光值，以630nm为参照波长。

白芨多糖和小分子白芨多糖对B16黑色素含量的影响，结果如图7：其中，图7中每个浓度五组平行，F检验(P＜0.05)。

由图7可以看出白芨多糖和降解白芨多糖均对B16细胞的黑色素产生有良好的抑制作用，熊果苷抑制B16黑色素产生的IC50浓度约为800ug/ml，白芨多糖和降解白芨多糖的IC50均在100ug左右，抑制效果远强于高于熊果苷，IC50指活性物对黑色素产生具有50％抑制率时的浓度。

六、白芨多糖复合物对B16细胞酪氨酸酶活力抑制的测定；

1、B16细胞来源的酶的制备

消化离心收集对数生长期的细胞，加入1％Triton X-100，冰浴磁力搅拌2小时，制成裂解细胞混合液，将裂解细胞混合液放入Amicon Ultra-15超滤离心管(50KDa)中，4500rpm，4℃低温离心30分钟；将膜上部分移入离心管中，迅速放入冰浴备用(放置时间不宜过长)，膜下部分弃去。

2、BCA法测定含酶细胞提取液的蛋白浓度，如图8所示。

3、经计算细胞提取物蛋白浓度为7430ug/ml，调整为1300ug/ml进行酪氨酸酶抑制试验。

表6、B16酪氨酸酶活性测定：

	A1	A2	A3	A4
					L-Dopa(0.02％)	20ul	0	20ul	0
待测样品	0	0	20ul	20ul
					样品溶剂	20ul	20ul	0	0
PH＝6.8的PBS	140ul	160ul	140ul	160ul

白芨多糖复合物对B16细胞来源的酪氨酸酶的抑制作用结果如图9所示：其中，图7中每个浓度五组平行，F检验(P＜0.05)。

由图9可知，熊果苷对B16细胞来源的酪氨酸酶的抑制IC50＝0.01％，白芨多糖复合物虽然对B16细胞来源的酪氨酸酶具有一定抑制作用，但是效果不及熊果苷，由此可推知白芨多糖复合物对黑色素生成的抑制不只是通过抑制酪氨酸酶活性，而是还有其它作用途径，我们通过实验七进行验证。

七、B16细胞中TRP1、TRP2、PMEL-17表达量的测定；

1、SDS-PAGE凝胶电泳，丙烯酰胺浓度(10％)，将B16细胞裂解液中蛋白成分进行分离。

2、将分离好的蛋白进行电泳转PVDF(0.22um)膜进行印迹

3、10％BSA封膜，利用TRP1，TRP2，PMEL-17抗体进行免疫结合，PBS清洗清洗除去未结合的一抗，然后再用连接有辣根过氧化物酶的酶连二抗进行免疫结合，PBS清洗，加入显色液，避光显色至条带清晰时加入双蒸水终止反应。

不同浓度白芨多糖复合物对B16细胞中TRP1，TRP2，PMEL-17表达的影响如图10所示：

由western blotting显影结果可以看出，白芨多糖复合物对三种酪氨酸酶相关蛋白的表达均有不同程度的抑制，尤其是对TRP-1表达量的影响最为显著。验证了由实验六的结果所作之推测。

八、利用Eliasa试剂盒检测白芨多糖复合物对HaCat细胞中VEGF的表达量的影响。

试剂盒购自上海美季生物技术有限公司购买，按照试剂盒说明书操作，结果如图11所示：HaCat细胞经80ug/ml白芨多糖复合物处理后，与空白相比较VEGF表达量的变化，纵坐标数值为平均值±标准偏差(n＝6)，F检验，(P＜0.05)。

随着培养时间的延长，VEGF的表达量也随之增加，表明白芨多糖复合物可促进角质形成细胞中VEGF的表达。

九、利用荧光检测的方法测定Caspase-9表达量的变化；

a、细胞培养前处理

细胞培养120小时后，吸取培养基，PBS清洗一次，加入PBS直到正好覆盖细胞，200mJ/cm2UVB照射5分钟，设置空白对照(未用UVB)照射，然后更换培养基，加入100ug/ml白芨多糖复合物，继续培养8小时。

b、采收细胞，加入复合蛋白酶抑制剂，Triton裂解，测定裂解液蛋白浓度。

c、加入caspase-9的荧光底物，37℃反应60min，400/505nm测定荧光值(INFINITE M200酶标仪)。

d、以荧光值/蛋白含量(F/Protein)对白芨多糖提取物浓度做图。

经紫外照射的HaCat中Caspase-9的表达量在添加白芨多糖复合物之后的变化，结果如图12所示，其中图中数据为平均值±标准偏差，P＜0.05，与空白及UVB对照组在统计学上有明显差异。

由图12可知在白芨多糖复合物的作用下，被紫外损伤的HaCat细胞中凋亡信号Caspase-9的表达量大大降低。

十、检测经紫外照射后的HaCat中ROS的表达量在添加白芨多糖复合物之后的变化；

a、37℃，5％CO2进行细胞培养；

b、细胞培养120小时后，吸取培养基，PBS清洗一次，加入PBS到正好覆盖细胞，200mJ/cm2UVB照射5分钟，设置空白对照(未用UVB)照射，每组实验设5个平行；

c、更换培养基，加入100ug/ml白芨多糖复合物，继续培养4小时；

d、加入二氢罗丹明123(荧光探针)，培养20min；

e、采收细胞，制成1ml PBS悬液，超声破碎，10000rpm低温离心；

f、用酶标仪检测500/536nm的荧光值，同时用BCA法测定蛋白浓度。

以荧光值/蛋白含量(F/Protein)对白芨多糖提取物浓度做图13，其中图中数据为平均值±标准偏差，P＜0.05，与空白及UVB对照组在统计学上有明显差异。

由图13可知，经紫外照射的HaCat中ROS的生成量在添加白芨多糖复合物之后明显降低，并呈剂量依赖性(25～250ug/ml内)。

十一、白芨多糖复合物在化妆品种的应用，及添加有白芨多糖复合物的化妆品的人体非创性功效评测：

按照本发明技术方案制得的白芨多糖复合物，可以作为美白，保湿，防晒和抗衰老的功效性原料，其使用形式没有特殊要求，它可以用于水剂、霜剂、油剂、洗液、乳状液等各种不同剂型的化妆品中。

作为本发明应用的典型基质，涉及的已知物质有：动植物油、矿物油、蜡、高级醇、脂肪醇、硅油、表面活性剂、磷脂、醇类、多元醇类、水溶性聚合物、油溶性聚合物类、矿物质、去离子水等，另外，根据需要可适当加入PH调节剂、抗氧化剂、螯合剂、颜料、防腐剂和香精等。此外，也可以与具有美白作用、抗衰老作用或护肤作用的其它活性成分结合使用，如防晒剂、血液循环促进剂、消毒剂、消炎剂、细胞活化剂、维生素类、氨基酸类、润湿剂、角质层分离剂。

产品配料表1是添加有白芨多糖复合物的化妆品的具体配料组成。配制时，将表中组分A加热至85℃，溶化搅拌均匀，作为油相，将组分B放入容器加热至85℃，搅拌溶解成水相原料，油相原料加入水相原料中搅拌，乳化均质1min后，继续搅拌冷却至45℃时，加入香精、防腐剂等，搅拌均匀，陈化24小时后即可灌装、包装、检验，制得本发明之实例产品。

配料表1：

以不添加白芨多糖复合物的产品为空白对照，将产品进行即时保湿人体非创性功效评测，实验方法如下：

1、筛选30名18～50岁之间的健康志愿者，选定前臂内侧作为产品使用部位，每个产品实验部位面积为3×3CM²，产品使用量为2mg/CM²，约为半粒绿豆大小。2、志愿者清洗前臂，在恒温恒湿实验室静坐30分钟，测定受试部位的水分含量值和水分透皮散失率(TEWL)作为空白值。3、在测试部位使用产品，4使用产品的第2、4、6个小时测定测试部位的水分含量值和水分透皮散失率(TEWL)的变化，每个部位测5次，取平均值。6、统计数据，分析水分含量值和水分透皮散失率(TEWL)的变化情况。

含有白芨多糖复合物的产品的即时保湿效果如图14所示，图中数值为平均值±SD，P＜0.05，经过F检测，在添加量为1％时，对皮肤角质层含水量的即时提升度最高达33％，在使用6个小时后提升度依然达到19％，远高于空白产品的即时保湿效果。

十二、以不添加白芨多糖复合物的产品为空白对照，将产品进行长效美白，保湿，抗衰老人体非创性功效评测，实验方法如下：

1、筛选30名18～50岁之间的健康志愿者，选定产品测试部位，每个测试部位面积为2×2～3×3CM²，产品使用量为2mg/CM²，约为半粒绿豆大小。

2、志愿者清洗测试部位，在恒温恒湿实验室静坐30分钟，运用皮肤测试仪测定受试部位的黑色素含量值(Mexameter)和皮肤亮度值(Colorimeter)，水分含量值(Cornemeter)和水分透皮散失率(TEWL)(Tewameter)，皮肤弹性和皱纹状况(MPA580)作为空白值。

3、产品发放给志愿者，早晚在固定部位涂抹一次，实验期间实验部位不得使用其他化妆品。

4、测试周期6周，每两周在恒温恒湿环境中测定一次测定受试部位的黑色素含量值和皮肤亮度值，水分含量值和水分透皮散失率(TEWL)，皮肤弹性和皱纹状况的变化情况。

5、统计数据，分析使用前后黑色素含量值和皮肤亮度值、水分含量值和水分透皮散失率(TEWL)，皮肤弹性和皱纹状况的变化。

含有白芨多糖复合物的产品的美白效果如图15，16所示：图15和16中数值为平均值±SD，P＜0.05，经过F检测，白芨多糖复合物本身具有一定的美白作用，可以提升皮肤亮度，降低皮肤黑色素含量，但是单独使用的效果并不突出，与熊果苷一起对熊果苷具有增效协同作用的，建议和熊果苷一起使用，后续我们将进一步研究和其他具有美白活性的原料的搭配使用效果。含有白芨多糖复合物的产品的保湿效果图17，18所示：

由图17，18可知白芨多糖复合物具有良好的保湿效果，小分子白芨多糖和白芨多糖的结合即可快速提高皮肤角质层含水量，又可修复皮肤屏障，长期使用具有修复保湿的作用，从根本上提升皮肤的保湿效果。

含有白芨多糖复合物的产品的抗衰老效果如图19所示，以R2，R5两个指标衡量皮肤弹性的变化，图中R2显示无负压使皮肤有负压时的最大的拉伸量之比，超接近1，弹性超好；R5测试的第一个循环过程中，皮肤恢复过程的弹性部分与加负压过程的弹性部分之比，超接近1，弹性超好；两个指标都有明显的提升，说明白芨多糖复合物可以明显提升测试部位皮肤弹性：图19的数值为平均值±SD，P＜0.05，R2，R5与不使用样品部位存在显著差异。

通过以上理化性质检测，细胞模型评价，动物模型评价和非创性人体评价，证明：白芨多糖复合物是一种质量稳定，指标与成分明确，具有美白，修复保湿，抗氧化，抗紫外、抗衰老作用的植物多糖原料，安全无刺激，可以作为功能原料单独或复配其他功能原料使用在任何剂型的化妆品中。

本发明对白芨多糖进行精制提取，并利用细胞培养技术和非创性皮肤评价技术进行研究，验证了白芨多糖可促进Hacat角质形成细胞中VEGF的表达，发现白芨多糖可明显降低皮肤的经皮水分散失率，证明其对皮肤屏障具有良好的修复作用，鉴于白芨是一种分子量较大的植物多糖，我们进一步利用生物酶加工技术对其进行了降解，非创性皮肤评价实验发现一定分子量范围(20～80KDa)的小分子白芨多糖可显著提高皮肤的水分含量，对皮肤具有良好的保湿效果，在此基础上，结合白芨在其他传统领域的应用，我们将白芨多糖和小分子白芨多糖按一定比例合理搭配成白芨多糖复合物，综合利用生物酶加工技术，细胞培养技术，非创性皮肤评测技术，全面研究了白芨多糖复合物在细胞水平和人体水平上的美白，保湿，抗紫外，抗氧化，延缓衰老作用，发现白芨多糖复合物具有显著的保湿和抗氧化作用，并具有一定的美白，延缓衰老作用。

本发明尚有多种具体的实施方式，凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims

1.用作化妆品原料的白芨多糖复合物，其特征在于：该复合物包含20～80KDa的小分子白芨多糖和500～700KDa的白芨多糖，前者与后者的重量配比为1∶1～1∶20。

2.权利要求1所述用作化妆品原料的白芨多糖复合物的制备方法，其特征在于：

(1)按以下步骤制备所述20～80KDa的小分子白芨多糖：

步骤一：粉碎：将干燥的白芨块茎粉碎至100目；

(2)按以下步骤制备所述500～700KDa的白芨多糖：

步骤一：粉碎：将干燥的白芨块茎粉碎至100目；

3.根据权利要求2所述的用作化妆品原料的白芨多糖复合物的制备方法，其特征在于：所述小分子白芨多糖的制备过程中，步骤五所述纤维素酶的比活力为400u/mg，且纤维素酶与白芨提取液的质量体积比为1∶100000～1∶100。

4.根据权利要求2所述的用作化妆品原料的白芨多糖复合物的制备方法，其特征在于：所述小分子白芨多糖的制备过程中，步骤七加入木瓜蛋白酶以脱除植物蛋白及失活纤维素酶的反应时间为1～3小时。

5.根据权利要求2所述的用作化妆品原料的白芨多糖复合物的制备方法，其特征在于：制备小分子白芨多糖的步骤七和制备白芨多糖的步骤五，加入的木瓜蛋白酶的比活力均为600u/mg，且木瓜蛋白酶与白芨提取液的质量体积比均为1∶100000～1∶100。