CN104988199A - 一种大鲵黏液蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大鲵黏液蛋白肽的制备方法，1)电击刺激法采集大鲵粘液，冻干得粘液冻干粉；2)将所得粘液冻干粉加入50～120倍质量的蒸馏水中，再加入黏液冻干粉质量10％-30％的碱性蛋白酶，调节pH至9～9.5，在40～60℃温度条件下酶解1～3h，再将混合液煮沸1～2min，冷却至19～25℃；3)将步骤2)处理完成的混合液在3000-4500r/min条件下，离心10～20min，取清液，调节清液pH值为4～5，在40～45℃温度条件下，加入1％～2％活性碳，搅拌45～60min进行脱色脱腥，然后在3000-4500r/min条件下，离心10-15min，过0.45μm滤膜得滤液；4)将步骤3)处理完成的滤液在30℃-60℃温度条件下旋转蒸发浓缩至原样1/7～1/8，将浓缩液用塑料袋密封，在温度19～25℃，压力150-250MPa条件下，杀菌1-5min，在洁净环境下，真空冷冻干燥、粉碎得到粘液蛋白肽粉。
Description
技术领域
本发明属于大鲵深加工领域，涉及一种大鲵黏液蛋白肽的制备方法
背景技术
大鲵(Andrias davidianus)属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，是我国特有的珍稀特产，属国家二类保护动物,主要分布于长江中上游、珠江中上游及汉水上游的溪流中。上世纪90年代以来，湖南、湖北、陕西及广西都建立了大量的大鲵驯养繁殖企业。仅湖南省就有大鲵驯养繁殖企业35家左右，年繁殖能力已达4-5万尾。随着养殖规模的扩大，大鲵资源的精深加工利用成为一个关系大鲵产业持续发展的紧迫课题。至今还没有一种经济效益显著的大鲵精深加工利用技术，这严重制约了大鲵养殖业的发展。
大鲵体表无鳞，多皮肤腺，在生长过程中不断分泌黏液。大鲵作为有3亿5千万年的物种，除了具有寿命长、能自我修复的特点，还具有包括体表黏液在内的独特的非特异性免疫系统。大鲵在长期进化过程中体表黏液具备了抵御环境变化的能力和丰富的生物学活性。因此，大鲵黏液具有更大的利用价值和利用的可能性。如果能够对大鲵体表黏液进行开发利用，可以起到既利用大鲵资源，又不危害大鲵生长繁殖的效果，是实现大鲵资源可持续利用的最理想状态。
经检测黏液中主要成分为水(83-86％)、蛋白质(12％)，含有少量的多糖(0.48％)，具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等功效。针对大鲵黏液中蛋白质进行提取开发的报道比较少见。如何将大鲵黏液中蛋白质提取出来是本领域探索的课题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大鲵黏液蛋白肽的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种大鲵黏液蛋白肽的制备方法，步骤如下：
1)电击刺激法采集大鲵黏液，冻干脱水后研磨粉碎，得黏液冻干粉；
2)将所得黏液冻干粉加入50～120倍质量的蒸馏水中，再加入黏液冻干粉质量10％-30％的碱性蛋白酶，调节pH至9～9.5，在40～60℃温度条件下酶解1～3h，再将混合液煮沸1～2min，冷却至19～25℃；
3)将步骤2)处理完成的混合液在3000-4500r/min条件下，离心10～20min，取清液，调节清液pH值为4～5，在40～45℃温度条件下，加入清液质量的1％～2％活性碳，搅拌45～60min进行脱色脱腥，然后在3000-4500r/min条件下，离心10-15min，过0.45μm滤膜得滤液；
4)将步骤3)处理完成的滤液在30--60℃温度条件下旋转蒸发浓缩至原样体积的1/7～1/8，将浓缩液用塑料袋密封，在温度19～25℃，压力150-250MPa条件下，杀菌1-5min，在洁净环境下，真空冷冻干燥、粉碎得到黏液蛋白肽粉。
优选的，所述步骤2)进行如下：将所得黏液冻干粉加入100倍质量的蒸馏水中，再加入黏液冻干粉质量20％的碱性蛋白酶，调节pH至9，在40℃温度条件下酶解3h，再将混合液煮沸1min，冷却至19～25℃。
优选的，所述步骤3)进行如下：将步骤2)处理完成的混合液在4500r/min条件下，离心10min，取清液，调节清液pH值为4，在45℃温度条件下，加入清液质量1％的活性碳，搅拌45min进行脱色脱腥，然后在4500r/min条件下，离心15min，过0.45μm滤膜得滤液。
本发明的有益效果在于：本发明操作方法更简单快捷，成本低，产率高，制得的产品色泽良好、无异味，蛋白肽含量高，易溶于冷水，整个操作过程温度低，保留了蛋白肽的生物活性，更多的保留了大鲵黏液有效成分，是一种很好的营养保健品原料。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
1)电击刺激法采集2kg大鲵黏液，冻干脱水后研磨粉碎，得黏液冻干粉；
2)将所得黏液冻干粉加入100倍质量的蒸馏水中，再加入黏液冻干粉质量20％的碱性蛋白酶，调节pH至9，在400℃温度条件下酶解3h，再将混合液煮沸1min，冷却至19～25℃；
3)将步骤2)处理完成的混合液在3000r/min条件下，离心20min，取清液，调节清液pH值为4，在45℃温度条件下，加入清液重量1％的活性碳，搅拌45min进行脱色脱腥，然后在4500r/min条件下，离心10min，过0.45μm滤膜得滤液；
4)将步骤3)处理完成的在30℃温度条件下旋转蒸发浓缩至原样体积的1/7，将浓缩液用塑料袋密封，在温度19～25℃，压力250MPa条件下，杀菌5min，在洁净环境下，真空冷冻干燥、粉碎得到黏液蛋白肽粉。
实施例2
1)电击刺激法采集2kg大鲵黏液，冻干脱水后研磨粉碎，得黏液冻干粉；
2)将所得黏液冻干粉加入120倍质量的蒸馏水中，再加入黏液冻干粉质量10％的碱性蛋白酶，调节pH至9.5，在60℃温度条件下酶解1h，再将混合液煮沸2min，冷却至19～25℃；
3)将步骤2)处理完成的混合液在4500r/min条件下，离心10min，取清液，调节清液pH值为4，在40℃温度条件下，加入清液质量2％的活性碳，搅拌45min进行脱色脱腥，然后在3000r/min条件下，离心15min，过0.45μm滤膜得滤液；
4)将步骤3)处理完成的滤液在60℃温度条件下旋转蒸发浓缩至原样体积的1/8，将浓缩液用塑料袋密封，在温度19～25℃，压力200MPa条件下，杀菌3min，在洁净环境下，真空冷冻干燥、粉碎得到黏液蛋白肽粉。
实施例3
1)电击刺激法采集大鲵黏液，冻干脱水后研磨粉碎，得黏液冻干粉；
2)将所得黏液冻干粉加入50倍质量的蒸馏水中，再加入黏液冻干粉质量10％的碱性蛋白酶，调节pH至9，在50℃温度条件下酶解2h，再将混合液煮沸1min，冷却至19～25℃；
3)将步骤2)处理完成的混合液在4000r/min条件下，离心150min，取清液，调节清液PH值为4.5，在43℃温度条件下，加入清液质量1.5％的活性碳，搅拌50min进行脱色脱腥，然后在4000r/min条件下，离心10min，过0.45μm滤膜得滤液；
4)将步骤3)处理完成的滤液在40℃温度条件下旋转蒸发浓缩至原样体积的1/7，将浓缩液用塑料袋密封，在温度19～25℃，压力200MPa条件下，杀菌5min，在洁净环境下，真空冷冻干燥、粉碎得到黏液蛋白肽粉。
试验例1、多肽分子量的测定
检测方法：通过凝胶层析法测定分子量，试验过程中选用0.1mol/L的Tris-HCl洗脱液平衡处理SPhedexG-25凝胶柱后，在220nm的波长下，检测浓度为2mg/ml的标准物质：还原性谷胱甘肽(307Da)、缩宫素(1007Da)、胰高血糖素(3485Da)、和胰岛素(5808Da)，根据标准物质分子量对数和洗脱体积，拟合得回归方程为：y＝-40.238x+194.57(R2＝0.9909)；其中，y为洗脱体积，x为相应分子量的对数值。
将各实施例所得多肽分别配制为浓度为4mg/ml，在上述条件下分别进样洗脱，将出峰体积带入标准曲线，即可得样品分子量及其分布范围，通过峰面积归一法，确定不同分子量蛋白肽的相对百分含量，所得结果如表1所示。
表1：多肽分子量分布及表观色泽
| 实施例编号 | 色泽 | 大于3kD | 2～3kD | 1～2kD | 小于1kD |
| 实施例1 | 乳白～乳黄 | ─ | 2.5％ | 3.4％ | 94.1％ |
| 实施例2 | 乳白～乳黄 | ─ | 3.6％ | 4.8％ | 91.6％ |
| 实施例3 | 乳白～乳黄 | ─ | 3.7％ | 5.2％ | 91.1％ |
从表1可知，通过本发明制备的大鲵胶原蛋白肽其分子量主要集中在小于1kD范围内，并且色泽良好，在正常的乳白与乳黄之间。
试验例2、透皮吸收试验
取体重150g的Wistar大鼠，麻醉，剔净绒毛，小心剥皮，分离皮下脂肪组织及黏液组织，用生理盐水反复冲洗数遍；扩散装置及介质选用改进型Franz扩散池；扩散介质选用生理盐水，提供与人体内相似的环境。将各实施例所得胶原蛋白肽溶于水中，配制成浓度为1.0％的多肽溶液，等体积均匀涂抹在实验材料上。按照常规的透皮吸收操作，检测215nm波长下多肽溶液的紫外吸光度值，通过公式求出透过率。根据实验结果可知：实施例1～3所得胶原蛋白肽的透过率分别为80.9％、82.3％和85.6％；从试验例2可知本发明所得黏液蛋肽的透皮吸收性好。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.一种大鲵黏液蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)电击刺激法采集大鲵黏液，冻干脱水后研磨粉碎，得黏液冻干粉；
2)将所得黏液冻干粉加入50～120倍质量的蒸馏水中，再加入黏液冻干粉质量10％-30％的碱性蛋白酶，调节pH至9～9.5，在40～60℃温度条件下酶解1～3h，再将混合液煮沸1～2min，冷却至19～25℃；
3)将步骤2)处理完成的混合液在3000-4500r/min条件下，离心10～20min，取清液，调节清液pH值为4～5，在40～45℃温度条件下，加入清液质量1％～2％的活性碳，搅拌45～60min进行脱色脱腥，然后在3000-4500r/min条件下，离心10-15min，过0.45μm滤膜得滤液；
4)将步骤3)处理完成的滤液在30℃--60℃温度条件下旋转蒸发浓缩至原样体积的1/7～1/8，将浓缩液用塑料袋密封，在温度19～25℃，压力150-250MPa条件下，杀菌1-5min，在洁净环境下，真空冷冻干燥、粉碎得到黏液蛋白肽粉。
2.根据权利要求1所述大鲵黏液蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)进行如下：将所得黏液冻干粉加入100倍质量的蒸馏水中，再加入黏液冻干粉质量20％的碱性蛋白酶，调节pH至9，在40℃温度条件下酶解3h，再将混合液煮沸1min，冷却至19～25℃。
3.根据权利要求1所述大鲵黏液蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3)进行如下：将步骤2)处理完成的混合液在4500r/min条件下，离心10min，取清液，调节清液pH值为4，在45℃温度条件下，加入清液质量1％的活性碳，搅拌45min进行脱色脱腥，然后在4500r/min条件下，离心15min，过0.45μm滤膜得滤液。
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