CN108066369A - 一种大鲵粘液提取物的制备方法 - Google Patents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract
本发明属于医药技术或保健食品等技术领域，具体涉及一种大鲵粘液提取物的制备方法。该方法包括电刺激法、真空法、刮擦法，得到大鲵粘液，进一步针对大鲵粘液乙醇低温沉淀，沉淀物调pH值、酶解，超滤的方法，得到大鲵粘液的提取物，本发明工艺方法适合工业化生产，对环境无污染，具有提取率高，有效成分含量高等优点。
Description
技术领域
本发明属于医药技术或保健食品等技术领域，具体涉及一种大鲵粘液提取物的制备方法。
背景技术
大鲵(Andrias davidianus Blanchard)为大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，俗名“娃娃鱼”，属国家二级保护动物，被称为“生物界活化石”。隐鳃鲵科目前仅存2属3种，其中大鲵属有2种：即中国大鲵(Andrias davidianus)和日本大鲵(Andrias japonicus)；隐鳃鲵属仅有分布于北美的隐鳃鲵(Cryptobranshus alleganiensis)一种。大鲵雌雄异体，7-8月产卵于岩石之上，随水漂流孵化。大鲵头部宽而扁阔，口大眼小，四肢短小，皮肤两侧有明显的褶皱，躯体多分布疣粒。大鲵的迁徙能力较差，对水环境的依赖性大，故常栖于水质清凉、岩石空洞较多的山间小溪的阴暗潮湿之地；其性情凶猛，以肉食为主，多有冬眠，成年大鲵体长可达2m以上。大鲵体表光滑无鳞，皮肤多显暗黑色和灰褐色，皮肤上有各种斑纹和丰富的腺体结构，当大鲵受到外来不良刺激时可分泌大量白色状粘液，粘液起初呈浆状，后渐变为粘稠胶状物，并伴有特殊性气味。大鲵几乎在全国各地均有分布，主要遍布在长江流域中上游和中南部山区，以陕西、湖北、湖南、江西、贵州等省分布较为集中。陕南作为大鲵生长的最佳适宜生活区域之一，有“大鲵之乡”之称。在汉中地区的城固、南郑、勉县、洋县、留坝、西乡、略阳等县广泛分布。目前，汉中地区大鲵养殖有200万尾左右，年孵化幼鲵突破50万尾以上，养殖户达1500多户，为大鲵向商品化、规模化、产业化发展奠定了基础。
大鲵全身都是宝，其表皮所分泌的粘液是一项极为重要的新材料。大鲵粘液在伤口愈合方面存在巨大的医用价值，未来可应用于手术创口愈合和战场急救等医学领域。大鲵除了高营养价值，还有更神奇的特性。大鲵在遇到外部刺激时，身体表层会分泌出一种粘液。将该粘液制成的粉末涂于动物内脏的创口时发现，伤口在2秒左右就自动愈合，瞬间止血，而且发现粘合后的创口表面仅有一条细线，粘合的非常牢固。大鲵粘液具有的这种生物特性，是一种非常好的组织粘合剂，具有优异的医用性能。技术人员在后续的活体试验中发现，粘液的固体粉末没有毒性等副作用，是目前最具前景的天然医用生物材料。大鲵经历了长期的进化，其粘液材料的微结构和与之对应的力学性能趋于最优化，所表现出的优异强韧性和功能适应性，是传统人工合成材料无法比拟的。大鲵粘液材料经过加工后用于人体组织和器官的修复，具有很好的生物相容性。中国独有、世界首创的大鲵粘液这种生物材料，颠覆传统医学伤口缝合技术，更将是颠覆传统大鲵养殖产业的新机遇。目前国内常用的医用粘合剂主要有血纤维蛋白、氰基丙烯酸酯以及贻贝足丝蛋白等。血纤维蛋白粘合力弱，固化缓慢，机械强度差。氰基丙烯酸酯毒性强，聚合物膜易碎。来源于海洋贻贝足丝的足丝蛋白，相比前两种具有高强度高韧性和防水性，但是一万个贻贝中才能制取1克粘附蛋白，导致贻贝足丝蛋白成本十分高昂。与贻贝足丝相比，大鲵体表粘液产量非常充足，每条一次可采50g左右，可重复循环大量采集实现规模化生产。大鲵的生活环境较为独特，一般在水流湍急，水质清凉，水草茂盛，石缝和岩洞多的山间溪流、河流和湖泊之中。大鲵粘液的应用目前在国际上完全是空白。因此，研究开发新的大鲵粘液的提取物制备方法，具有重要意义。
发明内容
基于上述原因，我们通过科学的实验，确定一种新的大鲵粘液提取物的制备方法，该方法包括包括电刺激法、真空法、刮擦法，得到大鲵粘液，进一步针对大鲵粘液乙醇低温沉淀，沉淀物调pH值、酶解，超滤的方法，得到大鲵粘液的提取物，本发明工艺方法适合工业化生产，对环境无污染，具有提取率高，有效成分含量高等优点。
本发明所述的大鲵为：经过人工仿生态环境饲养得到的子二代或子三代的大鲵。
本发明所述的大鲵粘液又名：大鲵黏液。
本发明通过以下技术方案实现的。
一种大鲵粘液提取物的制备方法，其制备方法包括电刺激法、真空法、刮擦法，得到大鲵粘液。
其中电刺激法中电压为5-10V，真空法中真空度1kPa-10kPa。
所述的一种大鲵粘液提取物的制备方法，还包括酶解法。
所述的一种大鲵粘液提取物的制备方法：
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液1-3倍的注射用水，水浴加热至30℃-45℃，保持体系温度30℃-45℃，搅拌10-30min，加入大鲵粘液0.5-1.5倍的乙醇，搅拌5min-10min，从水浴中取出，放置0℃-5℃环境下静置8-12小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至30℃-45℃，保持体系温度30℃-45℃，加入大鲵粘液3-4倍的乙醇，搅拌5min-10min，从水浴中取出，放置0℃-5℃环境下静置8-12小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量2-3倍的注射用水，用pH调节剂A调节pH值4.5-5.5，加入沉淀重量0.20-0.40倍的中性蛋白酶，水解2-4小时后，加注射用水，用pH调节剂B调节pH值为6.0-7.0，再加入沉淀重量1-2倍的菠萝蛋白酶，水解3-6小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到50％-60％，静置12-24小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量4-8倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物。
其中pH调节剂A为枸橼酸、苹果酸或酒石酸。
pH调节剂B为枸橼酸钠。
本发明所述的大鲵为：经过人工仿生态环境饲养得到的子二代或子三代的大鲵。
本发明所述的大鲵粘液又名：大鲵黏液。
制备实施例
实施例1
取大鲵10只，采用真空法(真空度1kPa)，获得大鲵粘液508g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液1倍的注射用水，水浴加热至30℃，保持体系温度30℃，搅拌10min，加入大鲵粘液0.5倍的乙醇，搅拌5min，从水浴中取出，放置0℃环境下静置8小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至30℃，保持体系温度30℃，加入大鲵粘液3倍的乙醇，搅拌5min，从水浴中取出，放置0℃环境下静置8小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量2倍的注射用水，用枸橼酸调节pH值4.5，加入沉淀重量0.20倍的中性蛋白酶，水解2小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为6.0，再加入沉淀重量1倍的菠萝蛋白酶，水解6小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到50％，静置24小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量4倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物53.9g(总糖含量为61.3％)。
实施例2
取大鲵10只，采用真空法(真空度10kPa)，获得大鲵粘液496g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液3倍的注射用水，水浴加热至45℃，保持体系温度45℃，搅拌30min，加入大鲵粘液1.5倍的乙醇，搅拌10min，从水浴中取出，放置5℃环境下静置12小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至45℃，保持体系温度45℃，加入大鲵粘液4倍的乙醇，搅拌10min，从水浴中取出，放置5℃环境下静置12小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用苹果酸调节pH值5.5，加入沉淀重量0.40倍的中性蛋白酶，水解4小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为7.0，再加入沉淀重量2倍的菠萝蛋白酶，水解6小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到60％，静置24小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量8倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物50.6g(总糖含量为61.3％)。
实施例3
取大鲵10只，采用真空法(真空度5kPa)，获得大鲵粘液513g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液2倍的注射用水，水浴加热至40℃，保持体系温度40℃，搅拌20min，加入大鲵粘液1倍的乙醇，搅拌8min，从水浴中取出，放置3℃环境下静置10小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至40℃，保持体系温度40℃，加入大鲵粘液3.5倍的乙醇，搅拌8min，从水浴中取出，放置3℃环境下静置10小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量2.5倍的注射用水，用枸橼酸调节pH值5.0，加入沉淀重量0.30倍的中性蛋白酶，水解3小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为6.5，再加入沉淀重量1.5倍的菠萝蛋白酶，水解4.5小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到55％，静置18小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量6倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物53.7g(总糖含量为65.0％)。
实施例4
取大鲵10只，采用电击法，获得大鲵粘液481g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液1.5倍的注射用水，水浴加热至35℃，保持体系温度35℃，搅拌15min，加入大鲵粘液0.8倍的乙醇，搅拌6min，从水浴中取出，放置2℃环境下静置9小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至35℃，保持体系温度35℃，加入大鲵粘液3.5倍的乙醇，搅拌6min，从水浴中取出，放置2℃环境下静置9小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用酒石酸调节pH值4.5，加入沉淀重量0.25倍的中性蛋白酶，水解3小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为6.0，再加入沉淀重量1.2倍的菠萝蛋白酶，水解4小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到55％，静置16小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量5倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物49.1g(总糖含量为59.4％)。
实施例5
取大鲵10只，采用电击法，获得大鲵粘液482g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液3倍的注射用水，水浴加热至45℃，保持体系温度45℃，搅拌25min，加入大鲵粘液1.4倍的乙醇，搅拌9min，从水浴中取出，放置4℃环境下静置11小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至40℃，保持体系温度40℃，加入大鲵粘液4倍的乙醇，搅拌9min，从水浴中取出，放置5℃环境下静置11小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用枸橼酸调节pH值5.5，加入沉淀重量0.35倍的中性蛋白酶，水解3.5小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为7.0，再加入沉淀重量2倍的菠萝蛋白酶，水解5.5小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到60％，静置20小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量7倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物48.8g(总糖含量为59.1％)。
实施例6
取大鲵10只，采用刮擦法，获得大鲵粘液491g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液3倍的注射用水，水浴加热至45℃，保持体系温度45℃，搅拌25min，加入大鲵粘液1.4倍的乙醇，搅拌9min，从水浴中取出，放置4℃环境下静置11小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至40℃，保持体系温度40℃，加入大鲵粘液4倍的乙醇，搅拌9min，从水浴中取出，放置5℃环境下静置11小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用酒石酸调节pH值5.5，加入沉淀重量0.35倍的中性蛋白酶，水解3.5小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为7.0，再加入沉淀重量2倍的菠萝蛋白酶，水解5.5小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到60％，静置20小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量7倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物48.8g(总糖含量为59.1％)。
总糖检测分析方法
样品处理：取不同试验组得到大鲵粘液提取物，精密称定0.10g，加去离子水10mL，溶解完全，定溶在50mL容量瓶中；
标准曲线的制作：准确称取0.10g葡萄糖，用去离子水定容到100mL，配制成标准母液。取不同体积的母液用去离子水定容到50m L，配成浓度分别为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的标准溶液，以去离子水做空白对照，各取1m L于试管中，再加入4ml蒽酮试剂(2g/L)，浸入100℃沸水中煮沸10min，取出后用流动水冷却。在分光光度计上，进行光谱扫描，检测在波长620nm有最大吸收峰，并选择620nm处进行比色测定，并绘制标准曲线，得到公式为y＝0.0085x-0.092，R2＝0.99。
样品测定：取1mL样品于试管中，采用上述同样步骤进行操作，在620nm处进行比色测定，根据标准曲线计算。
本发明大鲵为：经过人工仿生态环境饲养得到的子二代或子三代的大鲵。
尽管以下本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，下述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
Claims (6)
1.一种大鲵粘液提取物的制备方法，其特征在于：制备方法包括电刺激法、真空法、刮擦法，得到大鲵粘液。
2.根据权利要求1所述的一种大鲵粘液提取物的制备方法，其中电刺激法中电压为5-10V，真空法中真空度1kPa-10kPa。
3.根据权要求1所述的一种大鲵粘液提取物的制备方法，其特征在于还包括酶解法。
4.根据权利要求3所述的一种大鲵粘液提取物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液1-3倍的注射用水，水浴加热至30℃-45℃，保持体系温度30℃-45℃，搅拌10-30min，加入大鲵粘液0.5-1.5倍的乙醇，搅拌5min-10min，从水浴中取出，放置0℃-5℃环境下静置8-12小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至30℃-45℃，保持体系温度30℃-45℃，加入大鲵粘液3-4倍的乙醇，搅拌5min-10min，从水浴中取出，放置0℃-5℃环境下静置8-12小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量2-3倍的注射用水，用pH调节剂A调节pH值4.5-5.5，加入沉淀重量0.20-0.40倍的中性蛋白酶，水解2-4小时后，加注射用水，用pH调节剂B调节pH值为6.0-7.0，再加入沉淀重量1-2倍的菠萝蛋白酶，水解3-6小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到50％-60％，静置12-24小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量4-8倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物。
5.根据权利要求4所述的一种大鲵粘液提取物的制备方法，其中pH调节剂A为枸橼酸、苹果酸或酒石酸。
6.根据权利要求5所述的一种大鲵粘液提取物的制备方法，其中pH调节剂B为枸橼酸钠。
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