CN106511399B - 一种大鲵粘液的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大鲵粘液的用途，大鲵粘液的提取物用于伤口愈合药物、伤口愈合医疗器械中的应用。本发明大鲵粘液提取物用于外伤出血、烧伤出血、烫伤出血、外科手术出血；药理试验表明，本发明得到大鲵粘液的提取物，具有很好的伤口愈合作用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术或保健食品等技术领域，具体涉及一种大鲵粘液的新用途。
背景技术
大鲵(Andrias davidianus Blanchard)为大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，俗名“娃娃鱼”，属国家二级保护动物，被称为“生物界活化石”。隐鳃鲵科目前仅存2属3种，其中大鲵属有2种：即中国大鲵(Andrias davidianus)和日本大鲵(Andrias japonicus)；隐鳃鲵属仅有分布于北美的隐鳃鲵(Cryptobranshus alleganiensis)一种。大鲵雌雄异体，7-8月产卵于岩石之上，随水漂流孵化。大鲵头部宽而扁阔，口大眼小，四肢短小，皮肤两侧有明显的褶皱，躯体多分布疣粒。大鲵的迁徙能力较差，对水环境的依赖性大，故常栖于水质清凉、岩石空洞较多的山间小溪的阴暗潮湿之地；其性情凶猛，以肉食为主，多有冬眠，成年大鲵体长可达2m以上。大鲵体表光滑无鳞，皮肤多显暗黑色和灰褐色，皮肤上有各种斑纹和丰富的腺体结构，当大鲵受到外来不良刺激时可分泌大量白色状粘液，粘液起初呈浆状，后渐变为粘稠胶状物，并伴有特殊性气味。大鲵几乎在全国各地均有分布，主要遍布在长江流域中上游和中南部山区，以陕西、湖北、湖南、江西、贵州等省分布较为集中。陕南作为大鲵生长的最佳适宜生活区域之一，有“大鲵之乡”之称。在汉中地区的城固、南郑、勉县、洋县、留坝、西乡、略阳等县广泛分布。目前，汉中地区大鲵养殖有200万尾左右，年孵化幼鲵突破50万尾以上，养殖户达1500多户，为大鲵向商品化、规模化、产业化发展奠定了基础。
中国独有、世界首创的大鲵粘液这种生物材料，颠覆传统医学伤口缝合技术，更将是颠覆传统大鲵养殖产业的新机遇。目前国内常用的医用粘合剂主要有血纤维蛋白、氰基丙烯酸酯以及贻贝足丝蛋白等。血纤维蛋白粘合力弱，固化缓慢，机械强度差。氰基丙烯酸酯毒性强，聚合物膜易碎。来源于海洋贻贝足丝的足丝蛋白，相比前两种具有高强度高韧性和防水性，但是一万个贻贝中才能制取1克粘附蛋白，导致贻贝足丝蛋白成本十分高昂。与贻贝足丝相比，大鲵体表粘液产量非常充足，每条一次可采50克，可重复循环大量采集实现规模化生产。大鲵的生活环境较为独特，一般在水流湍急，水质清凉，水草茂盛，石缝和岩洞多的山间溪流、河流和湖泊之中。大鲵粘液的应用目前在国际上完全是空白，公司建议军科院抓紧实施大鲵粘液的医用研发进度，尽快研制出粉末、喷雾、贴片、液体等系列产品，用于部队战场急救和医疗护理。
针对大鲵粘液伤口愈合作用进行深入的研究，具有重要意义。
发明内容
基于上述原因，我们研究得到一种新的大鲵粘液提取物，用于伤口愈合药物、伤口愈合医疗器械中，本发明的大鲵粘液的提取是通过大鲵粘液乙醇低温沉淀，沉淀物调pH值、酶解，超滤的方法，得到大鲵粘液的提取物；药理试验表明，本发明得到大鲵粘液的提取物，具有很好的伤口愈合作用。
本发明所述的大鲵为：经过人工仿生态环境饲养得到的子二代或子三代的大鲵。
本发明所述的大鲵粘液又名：大鲵黏液。
本发明通过以下技术方案实现的。
一种大鲵粘液的提取物用于伤口愈合药物、伤口愈合医疗器械中的应用；
其中伤口愈合药物用于外伤愈合、烧伤愈合、烫伤愈合、外科手术愈合。
其中伤口愈合医疗器械用于外伤愈合、烧伤愈合、烫伤愈合、外科手术愈合。
大鲵粘液的制备方法包括：大鲵通过电刺激法、真空法、刮擦法获得大鲵粘液，其中电刺激法中电压为5-10V，真空法中真空度1kPa-10kPa；大鲵粘液的提取物制备方法为：步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液1-3倍的注射用水，水浴加热至30℃-45℃，保持体系温度30℃-45℃，搅拌10-30min，加入大鲵粘液0.5-1.5倍的乙醇，搅拌5min-10min，从水浴中取出，放置0℃-5℃环境下静置8-12小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至30℃-45℃，保持体系温度30℃-45℃，加入大鲵粘液3-4倍的乙醇，搅拌5min-10min，从水浴中取出，放置0℃-5℃环境下静置8-12小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量2-3倍的注射用水，用pH调节剂A调节pH值4.5-5.5，加入沉淀重量0.20-0.40倍的中性蛋白酶，水解2-4小时后，加注射用水，用pH调节剂B调节pH值为6.0-7.0，再加入沉淀重量1-2倍的菠萝蛋白酶，水解3-6小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到50％-60％，静置12-24小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量4-8倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物。
其中pH调节剂A为枸橼酸、苹果酸或酒石酸。
pH调节剂B为枸橼酸钠。
本发明所述的大鲵为：经过人工仿生态环境饲养得到的子二代或子三代的大鲵。
本发明所述的大鲵粘液又名：大鲵黏液。
伤口愈合试验研究
试验1体外凝血效果试验
试验药物：本发明制备实施例得到大鲵粘液提取物；
对照药：取大鲵1只，真空法(真空度5kpa)，得到大鲵粘液，灭菌，冷冻干燥。
试验方法：取小白鼠的麻醉：取体重为22±2g的小白鼠；250ml三角瓶中放入少量脱脂棉，倒入10ml乙醚，左手带胶皮手套用无名指与小指将小鼠尾根部夹住，中指、食指与大拇指将小鼠颈部皮肤连同两只耳朵一起抓起，然后将小鼠头部塞进三角瓶，伸进约3cm，头部周围不能贴在三角瓶壁上，用手术刀片在小鼠背部划一长形伤口，深达皮下肌肉，将自制直径为0.5cm的塑料圆圈染上颜色，印在小鼠背部进行定位，用无菌镊子从圆圈中心将小鼠皮肤夹起，然后用无菌剪刀沿印迹剪除背部皮肤，便能得到大小、深浅基本一致的圆形伤口。取造模后小白鼠，随机分组，每组10只。对照组每天不做处理，给药组取样品0.1g加注射用水1ml，然后涂抹至伤口。用药9天，第一天、第七天、第九天用三角尺测量伤口大小。
试验结果见表1。
表1伤口愈合效果对比结果
注：与阴性对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组比较#P<0.05。
试验结论：上述试验表明，本发明的促进伤口愈合作用要显著优于对比例，充分说明本发明大鲵粘液的提取物具有更好的伤口愈合作用
试验2小鼠断尾伤口愈合效果试验
试验药物：本发明制备实施例得到大鲵粘液提取物；
对照药：取大鲵1只，真空法(真空度5kpa)，得到大鲵粘液，灭菌，冷冻干燥。
试验方法：分别称取0.1g实施例制得的大鲵粘液的提取物样品和1g阳性对照药大鲵粘液冻干粉，分别置于展示瓶中，灭菌备用；取同批次的C57BL/6小鼠，称重，量尾长；用手术剪去小鼠尾长的三分之一后，立即将断尾伤口插入展示瓶中，同时计时。计算血流停止时的小鼠愈合量。
试验结果见表2。
表2小鼠断尾伤口愈合效果试验结果
注：与阳性对照组比较*P<0.05。
试验结论：上述试验表明，本发明大鲵粘液提取物具有更加优秀的伤口愈合效果。
本发明所述的大鲵为：经过人工仿生态环境饲养得到的子二代或子三代的大鲵。
本发明所述的大鲵粘液又名：大鲵黏液。
一种大鲵粘液的提取物用于伤口愈合药物、伤口愈合医疗器械中的应用；
其中伤口愈合药物用于外伤愈合、烧伤愈合、烫伤愈合、外科手术愈合。其中伤口愈合医疗器械用于外伤愈合、烧伤愈合、烫伤愈合、外科手术愈合。
制备实施例
实施例1
取大鲵10只，采用真空法(真空度1kPa)，获得大鲵粘液508g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液1倍的注射用水，水浴加热至30℃，保持体系温度30℃，搅拌10min，加入大鲵粘液0.5倍的乙醇，搅拌5min，从水浴中取出，放置0℃环境下静置8小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至30℃，保持体系温度30℃，加入大鲵粘液3倍的乙醇，搅拌5min，从水浴中取出，放置0℃环境下静置8小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量2倍的注射用水，用枸橼酸调节pH值4.5，加入沉淀重量0.20倍的中性蛋白酶，水解2小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为6.0，再加入沉淀重量1倍的菠萝蛋白酶，水解6小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到50％，静置24小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量4倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物53.9g(总糖含量为61.3％)。
实施例2
取大鲵10只，采用真空法(真空度10kPa)，获得大鲵粘液496g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液3倍的注射用水，水浴加热至45℃，保持体系温度45℃，搅拌30min，加入大鲵粘液1.5倍的乙醇，搅拌10min，从水浴中取出，放置5℃环境下静置12小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至45℃，保持体系温度45℃，加入大鲵粘液4倍的乙醇，搅拌10min，从水浴中取出，放置5℃环境下静置12小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用苹果酸调节pH值5.5，加入沉淀重量0.40倍的中性蛋白酶，水解4小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为7.0，再加入沉淀重量2倍的菠萝蛋白酶，水解6小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到60％，静置24小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量8倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物50.6g(总糖含量为61.3％)。
实施例3
取大鲵10只，采用真空法(真空度5kPa)，获得大鲵粘液513g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液2倍的注射用水，水浴加热至40℃，保持体系温度40℃，搅拌20min，加入大鲵粘液1倍的乙醇，搅拌8min，从水浴中取出，放置3℃环境下静置10小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至40℃，保持体系温度40℃，加入大鲵粘液3.5倍的乙醇，搅拌8min，从水浴中取出，放置3℃环境下静置10小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量2.5倍的注射用水，用枸橼酸调节pH值5.0，加入沉淀重量0.30倍的中性蛋白酶，水解3小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为6.5，再加入沉淀重量1.5倍的菠萝蛋白酶，水解4.5小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到55％，静置18小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量6倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物53.7g(总糖含量为65.0％)。
实施例4
取大鲵10只，采用电击法，获得大鲵粘液481g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液1.5倍的注射用水，水浴加热至35℃，保持体系温度35℃，搅拌15min，加入大鲵粘液0.8倍的乙醇，搅拌6min，从水浴中取出，放置2℃环境下静置9小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至35℃，保持体系温度35℃，加入大鲵粘液3.5倍的乙醇，搅拌6min，从水浴中取出，放置2℃环境下静置9小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用酒石酸调节pH值4.5，加入沉淀重量0.25倍的中性蛋白酶，水解3小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为6.0，再加入沉淀重量1.2倍的菠萝蛋白酶，水解4小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到55％，静置16小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量5倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物49.1g(总糖含量为59.4％)。
实施例5
取大鲵10只，采用电击法，获得大鲵粘液482g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液3倍的注射用水，水浴加热至45℃，保持体系温度45℃，搅拌25min，加入大鲵粘液1.4倍的乙醇，搅拌9min，从水浴中取出，放置4℃环境下静置11小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至40℃，保持体系温度40℃，加入大鲵粘液4倍的乙醇，搅拌9min，从水浴中取出，放置5℃环境下静置11小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用枸橼酸调节pH值5.5，加入沉淀重量0.35倍的中性蛋白酶，水解3.5小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为7.0，再加入沉淀重量2倍的菠萝蛋白酶，水解5.5小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到60％，静置20小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量7倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物48.8g(总糖含量为59.1％)。
实施例6
取大鲵10只，采用刮擦法，获得大鲵粘液491g；
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液3倍的注射用水，水浴加热至45℃，保持体系温度45℃，搅拌25min，加入大鲵粘液1.4倍的乙醇，搅拌9min，从水浴中取出，放置4℃环境下静置11小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至40℃，保持体系温度40℃，加入大鲵粘液4倍的乙醇，搅拌9min，从水浴中取出，放置5℃环境下静置11小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用酒石酸调节pH值5.5，加入沉淀重量0.35倍的中性蛋白酶，水解3.5小时后，加注射用水，用枸橼酸钠调节pH值为7.0，再加入沉淀重量2倍的菠萝蛋白酶，水解5.5小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到60％，静置20小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量7倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物48.8g(总糖含量为59.1％)。
总糖检测分析方法
样品处理：取不同试验组得到大鲵粘液提取物，精密称定0.10g，加去离子水10mL，溶解完全，定溶在50mL容量瓶中；
标准曲线的制作：准确称取0.10g葡萄糖，用去离子水定容到100mL，配制成标准母液。取不同体积的母液用去离子水定容到50mL，配成浓度分别为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的标准溶液，以去离子水做空白对照，各取1mL于试管中，再加入4ml蒽酮试剂(2g/L)，浸入100℃沸水中煮沸10min，取出后用流动水冷却。在分光光度计上，进行光谱扫描，检测在波长620nm有最大吸收峰，并选择620nm处进行比色测定，并绘制标准曲线，得到公式为y＝0.0085x-0.092，R2＝0.99。
样品测定：取1mL样品于试管中，采用上述同样步骤进行操作，在620nm处进行比色测定，根据标准曲线计算。
本发明所述的大鲵为：经过人工仿生态环境饲养得到的子二代或子三代的大鲵。
本发明所述的大鲵粘液又名：大鲵黏液。
上述实施例大鲵粘液的提取物用于伤口愈合药物、伤口愈合医疗器械中的应用；
其中伤口愈合药物用于外伤愈合、烧伤愈合、烫伤愈合、外科手术愈合。
其中伤口愈合医疗器械用于外伤愈合、烧伤愈合、烫伤愈合、外科手术愈合。
本发明大鲵为：经过人工仿生态环境饲养得到的子二代或子三代的大鲵。
尽管以下本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，下述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
Claims (3)
1.一种用于伤口愈合药物、伤口愈合医疗器械的大鲵粘液的提取物，其特征在于大鲵粘液的提取物的制备方法为：
大鲵通过电刺激法、真空法、刮擦法获得大鲵粘液，其中电刺激法中电压为5-10V，真空法中真空度1kPa-10kPa；大鲵粘液的制备方法为：
步骤(1)：取大鲵粘液，加入大鲵粘液1-3倍的注射用水，水浴加热至30℃-45℃，保持体系温度30℃-45℃，搅拌10-30min，加入大鲵粘液0.5-1.5倍的乙醇，搅拌5min-10min，从水浴中取出，放置0℃-5℃环境下静置8-12小时，过滤，得到沉淀A，滤液备用；
步骤(2)：取步骤(1)滤液，水浴加热至30℃-45℃，保持体系温度30℃-45℃，加入大鲵粘液3-4倍的乙醇，搅拌5min-10min，从水浴中取出，放置0℃-5℃环境下静置8-12小时，过滤，得到沉淀B，沉淀A与沉淀B合并，得到沉淀；
步骤(3)：取步骤(2)得到的沉淀，加沉淀重量2-3倍的注射用水，用pH调节剂A调节pH值4.5-5.5，加入沉淀重量0.20-0.40倍的中性蛋白酶，水解2-4小时后，加注射用水，用pH调节剂B调节pH值为6.0-7.0，再加入沉淀重量1-2倍的菠萝蛋白酶，水解3-6小时，得到酶解液；
步骤(4)：取步骤(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量达到50％-60％，静置12-24小时，过滤，得到沉淀；
步骤(5)：取步骤(4)沉淀，加入沉淀重量4-8倍的注射用水，用0.22μm滤芯过滤，滤液再用截取分子量10000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液冷冻干燥，得到大鲵粘液提取物；
其中pH调节剂A为枸橼酸、苹果酸或酒石酸；
其中pH调节剂B为枸橼酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种用于伤口愈合药物、伤口愈合医疗器械的大鲵粘液的提取物，其中伤口愈合药物用于外伤伤口、烧伤伤口、烫伤伤口、外科手术愈合。
3.根据权利要求1所述的一种用于伤口愈合药物、伤口愈合医疗器械的大鲵粘液的提取物，其中伤口愈合医疗器械用于外伤愈合、烧伤愈合、烫伤愈合、外科手术愈合。
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