CN115998954B - 一种含鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物材料领域,具体涉及一种含鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物及其应用。本发明提供一种生物墨水组合物,其特征在于,所述生物墨水组合物包括:(a)一种或多种光固化生物材料;(b)鲵皮肤分泌物;(c)溶剂;(d)光引发剂。本发明提供的生物墨水组合物,既具有生物相容性又具有粘附性,有助于生物打印,尤其是手术中原位生物打印的进行。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域,具体涉及一种含鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物及其应用。
背景技术
作为一种用于制造含有活细胞的支架(scaffold)的关键方法,生物打印广泛应用于生物医学领域,如骨、软骨、皮肤、肝脏和神经组织的再生以及疾病调查和构建药物筛选的微器官。最近,通过利用模拟(mimic)天然细胞外基质成分的生物墨水以及能够模拟组织结构的生物打印技术,生物打印取得进一步地发展,与传统生物打印即体外制造组织结构后进行体内移植不同。然而,生物打印出的植入性组织和宿主之间的几何不匹配(geometric mismatch)可能导致低整合。即使可以用医学扫描图像(例如计算机断层扫描或磁共振成像)的信息来生物打印定制的组织,但有限的扫描分辨率、移植前的手术清创和不断变化的宿主组织形态往往会产生不可避免的不一致的植入质量。
手术中生物打印(intraoperative bioprinting),又名原位生物打印(in situbioprinting),定义为在活体上进行的用于组织修复的生物打印,这涉及外科手术期间生物墨水的实时沉积。直接生物打印到受伤区域里,这为将形成的移植物精确符合伤口的几何结构提供了一种有效方式。对生物材料、细胞、细胞因子和/或其他成分的沉积的局部控制,模拟自然异质性(heterogeneity),进一步促进组织重建(tissue remodeling)。此外,与体外生物打印后植入的组织相比,手术中生物打印将源于样本转移和人工干预的污染与干扰的风险最小化。因此,据报道,手术中生物打印已应用到组织修复用于骨、软骨和皮肤的再生。基于同轴挤出(coaxial extrusion)法设计出手持式3D生物打印机(Biopen),以原位制造用于软骨缺陷的支架。激光辅助生物打印技术也作为手术中生物打印技术,使用封装(encapsulating)间充质干细胞、内皮细胞和血管内皮生长因子的胶原结构(construct),应用到修复小鼠颅盖骨。在集成成像的指导下,原位生物打印出含有自体同源的真皮成纤维细胞和表皮角质细胞的分层的(layered)皮肤纤维蛋白/胶原蛋白水凝胶(hydrogels)。
医学影像与外科学到工程学的跨学科合作,促进了手术中生物打印的发展。然而,到目前为止,特别是在原位生物打印的背景下,能够在生物打印结构和宿主组织表面之间(往往是潮湿的界面)实现有效粘附(adhesion)的生物墨水几乎没有被研究过。在这种潮湿的条件下,水分子的水合层(hydration layer)通常阻止表面之间的紧密接触和稳定粘附,阻碍粘附以及随后的支架整合和组织再生。
基于此,本发明通过添加鲵皮肤分泌物,提供了一种既具有生物相容性又具有粘附性的生物墨水组合物,以期缓解现有难题中的至少一种。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种含鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物,其特征在于,所述生物墨水组合物,包括:(a)一种或多种光固化生物材料;(b)鲵皮肤分泌物;(c)溶剂;(d)光引发剂。
进一步地,所述光固化生物材料包括GelMA、HAMA、ColMA、ChSMA、CSMA、DexMA、CMCSMA、AlgMA、PEGDA、PVAMA、SilMA、F127DA、HepMA中的一种或多种。
进一步地,所述光固化生物材料的浓度为5-50wt.%。
进一步地,所述鲵皮肤分泌物的浓度为0.1-5wt.%。
进一步地,所述鲵皮肤分泌物为冻干粉的形式。
进一步地,所述鲵包括大鲵属、隐鳃鲵属、山溪鲵属、小鲵属、巴鲵属、爪鲵属、肥鲵属、拟小鲵属、北鲵属、极北鲵属中的一种或多种。
进一步地,所述光引发剂的浓度为0.05-5wt.%。
进一步地,所述光引发剂包括2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、2-羟基-2-甲基苯丙酮、樟脑醌、双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-苯基氧化膦、二苯甲酮、过氧化苯甲酰中的一种或多种。
进一步地,所述生物墨水组合物进一步包括增稠剂。
进一步地,所述增稠剂包括明胶、透明质酸及其盐、胶原、硫酸软骨素、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、海藻酸及其盐、聚乙二醇、聚乙烯醇、丝素、聚醚F127、肝素中的一种或多种。
进一步地,所述光固化生物材料由所述增稠剂甲基丙烯酰化改性后得到。
进一步地,所述增稠剂的浓度为0-20wt.%。
进一步地,所述光固化生物材料为GelMA和HAMA;所述GelMA的浓度为5-50wt.%,所述HAMA的浓度为0-10wt.%。
进一步地,所述生物墨水组合物沉积到基底或表面上。
进一步地,所述基底或表面存在于水性介质或空气介质中。
进一步地,所述基底或表面包括亲水基底、疏水基底、金属、生物组织中的一种或多种。
进一步地,所述水性介质包括水、盐溶液、细胞培养基、体液中的一种或多种。
进一步地,所述沉积使用挤出。
进一步地,所述溶剂包括PBS、纯水、生理盐水中的一种或多种。
进一步地,所述生物墨水组合物含有活细胞。
进一步地,所述活细胞包括成肌细胞、间充质干细胞、神经细胞、骨细胞中的一种或多种。
进一步地,所述生物墨水组合物进一步包括生长因子、抗生素、外泌体中的一种或多种。
另一方面,本发明还提供了含鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物在生物打印中的应用。
进一步地,所述生物打印包括水下生物打印、空气中生物打印、原位生物打印中的一种或多种。
进一步地,通过所述生物打印制造结构。
进一步地,所述结构包括2D结构和/或3D结构。
进一步地,所述结构为一层或多层。
另一方面,本发明提供了一种制备含有鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物的方法。
另一方面,本发明还提供了一种用于生物打印的试剂盒,所述试剂盒包括含鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物和生物打印装置,其特征在于,所述生物墨水组合物包括:(a)一种或多种光固化生物材料;(b)鲵皮肤分泌物;(c)溶剂;(d)光引发剂。
进一步地,所述光固化包括GelMA、HAMA、ColMA、ChSMA、CSMA、DexMA、CMCSMA、AlgMA、PEGDA、PVAMA、SilMA、F127DA、HepMA中的一种或多种。
进一步地,所述光固化生物材料的浓度为5-50wt.%。
进一步地,所述鲵皮肤分泌物的浓度为0.1-5wt.%。
进一步地,所述鲵皮肤分泌物为冻干粉的形式。
进一步地,所述鲵包括大鲵属、隐鳃鲵属、山溪鲵属、小鲵属、巴鲵属、爪鲵属、肥鲵属、拟小鲵属、北鲵属、极北鲵属中的一种或多种。
进一步地,所述光引发剂的浓度为0.05-5wt.%。
进一步地,所述光引发剂包括2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、2-羟基-2-甲基苯丙酮、樟脑醌、双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-苯基氧化膦、二苯甲酮、过氧化苯甲酰中的一种或多种。
进一步地,所述生物墨水组合物进一步包括增稠剂。
进一步地,所述增稠剂包括明胶、透明质酸及其盐、胶原、硫酸软骨素、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、海藻酸及其盐、聚乙二醇、聚乙烯醇、丝素、聚醚F127、肝素中的一种或多种。
进一步地,所述光固化生物材料由所述增稠剂甲基丙烯酰化改性后得到。
进一步地,所述增稠剂的浓度为0-20wt.%。
进一步地,所述光固化生物材料为GelMA和HAMA;所述GelMA的浓度为5-50wt.%,所述HAMA的浓度为0-10wt.%。
进一步地,所述生物墨水组合物沉积到基底或表面上。
进一步地,所述基底或表面存在于水性介质或空气介质中。
进一步地,所述基底或表面包括亲水基底、疏水基底、金属、生物组织中的一种或多种。
进一步地,所述水性介质包括水、盐溶液、细胞培养基、体液中的一种或多种。
进一步地,所述沉积使用挤出。
进一步地,所述溶剂包括PBS、纯水、生理盐水中的一种或多种。
进一步地,所述生物墨水组合物含有活细胞。
进一步地,所述活细胞包括成肌细胞、间充质干细胞、神经细胞、骨细胞中的一种或多种。
进一步地,所述生物墨水组合物进一步包括生长因子、抗生素、外泌体中的一种或多种。
进一步地,所述介质的温度为15-55℃,可优选为25-35℃。
进一步地,所述打印装置的喷嘴内径尺寸为0.11-0.33mm,可优选为0.26mm;所述打印装置的打印头移动速度为300-1100mm/min-1,可优选为500-700mm/min-1。
进一步地,所述挤出的挤出压力为20-40PSI,可优选为25PSI。
进一步地,所述打印装置的喷嘴尖端与沉积层之间的距离为0.05-0.15mm,可优选为0.075-0.1mm。
有益效果
本发明提供一种含鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物及其应用。本发明技术方案通过一系列实验揭示,本发明提供的生物墨水组合物不仅能够模拟天然细胞外基质成分,而且具有强大的粘附性,适用于多种不同化学特性的基底与表面(例如亲水基底、疏水基底、金属、生物组织)和多种介质(水性介质、空气介质),其中,特别包括湿润的创口及其所处的液体环境;利用本发明提供的生物墨水组合物在生物组织上生物打印出的结构,能够符合不规则组织表面形貌;此外,载细胞的生物墨水组合物经证实,对细胞存活和铺展的细胞相容性很高;并且,本发明提供的生物墨水组合物还可以进一步包括生长因子、抗生素、外泌体等物质。简言之,本发明提供的生物墨水组合物有助于手术中原位生物打印的实现。
本发明特别地采用鲵皮肤分泌物(还可以理解为“鲵粘液提取物”或“鲵皮肤粘液提取物”),其遇水成胶,增加了生物墨水组合物的粘性(尤其是湿粘结)以及生物相容性和促再生功能,同时还具有抗菌作用,极大地丰富了生物墨水的应用场景。
综上所述,本发明技术方案提供的生物墨水组合物及其应用,在一定程度上有助于生物打印,特别是在体液包围的潮湿组织表面上进行手术中原位生物打印的实现。
定义
如本文所使用,“水下(underwater)”和“潮湿(wet)”是指在水性介质下,例如纯水、PBS、细胞培养基以及体液。
如本文所使用,“结构(construct)”是指利用生物墨水经生物打印产生的2D图案和/或3D图案,所述结构为一层或多层。
如本文所使用,“光引发剂(photoinitiator)”,又称“光敏剂(photosensitizer)”、“光固化剂(photocuring agent)”,是指可以借助光引发自由基(或阳离子)交联/聚合反应的化学物质,所述光可以为紫外光和可见光。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为手术中生物打印系统和粘附性生物墨水组合物成分的说明图(A为水下生物打印过程的示意图,包括在潮湿条件下的生物打印、体外测试和原位生物打印;B为生物墨水组合物的示意图:GelMA、明胶、HAMA和SSAD成分;C为生物墨水组合物内的相互作用,主要包括有助于生物墨水的内聚性(cohesive)的S-S键和氢键;光交联后,GelMA和HAMA的链式聚合进一步引入稳定的化学键;粘附机制包括:π-π电子、阳离子-π相互作用、疏水相互作用、氢键以及沉积的生物墨水组合物和不同基底(包括组织培养处理的培养皿、玻璃、PDMS、塑料(原始聚苯乙烯)、金属和生物组织)之间的金属配位键);
图2为生物墨水组合物在水下的粘附性、内聚性和生物打印保真度的实验图(A为生物墨水的粘附性和内聚性与4种不同组成的生物墨水在25℃、组织培养处理的培养皿表面生物打印出的网格结构;B为在25℃测试的4种生物墨水的动态流变学特性,AD-/HAMA-:含有GelMA和明胶的生物墨水,AD+/HAMA-:含有GelMA、明胶和SSAD的生物墨水,AD-/HAMA+:含有GelMA、明胶和HAMA的生物墨水,AD+/HAMA+:含有GelMA、明胶、HAMA和SSAD的生物墨水);
图3为用粘附性生物墨水组合物进行水下生物打印的实验图(A为在25℃、组织培养处理的培养皿上水下生物打印复杂图案和多色彩设计;B为在组织培养处理的培养皿上、多层次(10至50)水下生物打印的0°、45°和90°的视图;C为在25℃、不同的介质(左侧标记)中、不同基底表面(上侧标记)上生物打印出的网格结构);
图4为用挤出式生物打印机进行手术中生物打印的实验图(A为在不同温度和不同挤出(电机旋转)速度下手绘的细丝形态;B为使用生物打印机在水下玻璃表面上手写的2D图案;C为在25℃、使用生物打印机在玻璃表面上用单个或多个生物墨水组合物手写的3D图案;D为在25℃、体外鸡胸组织上原位生物打印的照片);
图5为用粘附性生物墨水组合物进行水下载细胞的生物打印的实验图(A为在25℃、组织培养处理的平板的孔底部,直接嵌有C2C12成肌细胞的生物打印出的图案的明视野图像;B为生物打印后1、7和14天,细胞的活(绿色)/死(红色)分析;C为生物打印后1、7和14天,细胞的F-肌动蛋白(绿色)染色;D为培养的1、7和14天,活/死细胞的定量分析);
图6为在不同的生物打印参数下使用生物墨水组合物生物打印出的网格和保真度分析(A为设计的网格图案;B-F为不同条件下、在组织培养处理的培养皿表面上生物打印出的图案,变化如下:B,层间距离;C,喷嘴(机针)尺寸;D,挤出压力;E,喷嘴移动速度;F,温度;对于每一对图示,左侧为生物打印出的图案的照片,右侧为该图案在设计的图案上的叠加,其中紫色区域表示过度打印(overprinting),绿色区域表示错印);
图7为用生物墨水组合物生物打印出的图案的SEM图像(显示水凝胶生物材料和组织培养处理的培养皿之间的界面)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在本文中,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的,术语“大约”,典型地表示为所述值的+/-5%,更典型的是所述值的+/-4%,更典型的是所述值的+/-3%,更典型的是所述值的+/-2%,甚至更典型的是所述值的+/-1%,甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
在本说明书中,某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解,这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁,且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此,范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如,范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3,从1到4,从1到5,从2到4,从2到6,从3到6等,以及此范围内的单独数字,例如1,2,3,4,5和6。无论该范围的广度如何,均适用以上规则。
实施例一:材料与方法
GelMA和HAMA的合成:
用以前报道的方法合成GelMA和HAMA[参考文献45、63]。简而言之,A型牛皮明胶(~225Bloom,Sigma-Aldrich,美国)和甲基丙烯酸酯酸酐(methacrylate anhydride)(Sigma-Aldrich)在PBS(pH=7.4,ThermoFisher,美国)中50℃反应1小时,得到GelMA。以酸酐比明胶为1:2的重量比,缓慢滴加甲基丙烯酸酯酸酐。接着,用去离子水1:1稀释溶液,并用透析膜(截留分子量[MWCO]:12-14kDa,Spectrum,美国)40℃透析5天以去除杂质,随后冷冻干燥得到白色粉末。
在HAMA的合成中,3g透明质酸钠盐(分子量:1,530kDa,Lifecore Biomedical,美国)溶于400mL去离子水,4℃过夜。将溶液置于冰上,加入等体积的二甲基甲酰胺(DMF,Sigma-Aldrich),同时剧烈搅拌。以甲基丙烯酸酯酸酐比透明质酸二糖单位为5:1的摩尔比,在4h期间,用泵(1.375mL h-1)加入甲基丙烯酸酯酸酐。在此过程中,用梅特勒DL21滴定仪(MettlerToledo,荷兰)和水性0.5M NaOH溶液(Sigma-Aldrich)控制pH。在完全加入甲基丙烯酸酯酸酐后,额外监测pH一小时并保持在pH8.5以上。随后,将反应混合物置于4℃过夜。第二天,将NaCl(Sigma-Aldrich)溶于反应混合物,加至0.5M,并用10等体积的乙醇在-78℃(用丙酮干冰浴冷却)沉淀混合物。收集干燥白色颗粒的HAMA,将其溶于去离子水,并用去离子水透析2天。透析后,冷冻干燥HAMA溶液得到白色粉末。
粘附性(adhesive)生物墨水的制备:
本发明提供的生物墨水组合物包括一种或多种光固化生物材料、鲵皮肤分泌物、溶剂、光引发剂。其中,光固化生物材料的浓度范围为5-50wt.%;鲵皮肤分泌物的浓度范围为0.1-5wt.%;光引发剂的浓度范围为0.05-5wt.%;溶剂除PBS外,还可以选用生理盐水、纯水。需要强调的是,考虑到实际成本和硬度等问题,可以选择性添加增稠剂以适应性调整;而增稠剂的浓度范围为0-20wt.%。
具体地,在本发明实施例中,通过调整溶于PBS(表1)的GelMA、HAMA、明胶和鲵皮肤分泌物的浓度,制备4组不同组成的生物墨水。其中,GelMA的浓度范围为5-50wt.%(优选为5wt.%),HAMA的浓度范围为0-10wt.%(优选为0.0875wt.%),鲵皮肤分泌物的浓度范围为0.1-5wt.%(优选为0.0125wt.%),明胶的浓度范围为0-20wt.%(优选为5wt.%),光引发剂(photoinitiator,PI)(优选为Irgacure 2959(也可以理解为“2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮”))的浓度范围为0.05-5wt.%(优选为0.5wt.%)。本发明实施例中采用的鲵皮肤分泌物为中国大鲵皮肤分泌物(SSAD),根据实际情况可选用其他种类的鲵,且鲵皮肤分泌物为冻干粉的粉末的形式。浓度的设计是基于对水下生物打印效果的研究,也就是说,可根据实际打印需求,调整具体组分的种类及其相应的浓度。
表1.图2中使用的不同生物墨水的成分
备注:a)SSAD-/HAMA-:含有GelMA和明胶的生物墨水;b)SSAD+/HAMA-:含有GelMA、明胶和SSAD的生物墨水;c)SSAD-/HAMA+:含有GelMA、明胶和HAMA的生物墨水;d)SSAD+/HAMA+:含有GelMA、明胶、HAMA和SSAD的生物墨水。
流变学分析:
在25℃,用混合型流变仪(HR-3,Waters,美国)评估4种生物墨水的流变特性。采用0.01s-1到1000s-1的剪切斜坡模式(shear ramp mode)和1000μm的间隙尺寸(gap size)来进行测试。
挤出式生物打印:
首先用3D Studio Max(Autodesk,美国)设计结构,并用Repetier(Hot-World,德国)切片和修饰。用Allevi 2生物打印机(Allevi,美国)来生物打印。本发明提供的生物墨水组合物还可以用适当的生物打印机进行生物打印。根据不同的用途,生物打印参数配置如下:打印头移动速度为300到1100mm/min-1,内针尺寸为0.11到0.33mm,挤出压力为20到40PSI,水性介质温度为15℃到55℃。生物打印后和必要时,将结构暴露至UV光(~10mW cm-2,360-480nm,OmniCure,美国)来光交联。无细胞的(acellular)生物打印出的结构在UV光下交联60s,而载细胞的(cell-laden)结构交联30s以避免UV辐射相关的细胞活力下降。
SEM样品制备和成像:
在组织培养处理的(tissue culture-treated)培养皿(petri dish)上,将生物墨水生物打印成网格图案。光交联和冷冻干燥后,用EMS 150T S金属溅射镀膜机(150T S,Quorum Technologies Ltd.,英国),将生物打印出的样品随后溅射镀膜一层80:20Pt/Pd的纳米层。用SEM(Supra55VP,Carl Zeiss,德国)在6kV对溅射镀膜的样品成像。
生物打印出的图案保真度的可视化:
用高斯模糊滤波平滑处理生物打印出的图案的照片并使用MATLAB函数im2bw(https://www.mathworks.com/help/images/ref/im2bw.html)将其转换成二进制图像。通过将相应的图像与设计的图案叠加(overlay)来可视化结构性保真度,其中粉色表示生物打印过度(overbioprinting)和绿色表示生物打印不足(underbioprinting),如前所述[参考文献45]。
含有细胞的生物墨水组合物的制备和生物打印:
为了证明有细胞的生物打印能力,应用水下生物打印系统来生物打印载细胞的生物墨水组合物。将C2C12成肌细胞(ATCC,美国)培养于补充有10%(v/v)胎牛血清(FBS,ThermoFisher)的DMEM(ThermoFisher)。将细胞培养于37℃、5%(v/v)CO2的培养箱(FormaScientific,USA)并每周用0.05%(w/v)胰蛋白酶-EDTA(ThermoFisher)传代两次。生物打印前,将胰蛋白酶处理的细胞(1×106mL-1)重悬于生物墨水组合物。根据实际情况,还可选用成肌细胞、间充质干细胞、神经细胞、骨细胞等细胞类型。
将Allevi 2生物打印机置于无菌环境下的细胞培养罩(cell culture hood)。在500mm/min-1的喷嘴(0.26mm)移动速度和25PSI的压力下,载细胞的生物墨水组合物直接在25℃、组织培养处理的平板的孔底上被生物打印出。生物打印出的图案通过UV照射(~10mWcm-2,360-480nm,30s)来光交联,并用PBS冲洗。之后,用含有10%(v/v)FBS的DMEM替换培养基,并培养于37℃和5%(v/v)CO2,用于进一步评估细胞行为。
细胞活力分析:
如以前的报道[参考文献45],用活/死试验(ThermoFisher)评估细胞活力。用倒置显微镜(Eclipse Ti,Nikon,日本)观察染色的结构。用ImageJ(National Institutes ofHealth,美国)量化活细胞和死细胞的数量,以分析细胞活力。对于F-肌动蛋白染色,用4%(w/v)多聚甲醛(ThermoFisher)固定结构15min,用0.05%(v/v)Triton X-100(Sigma-Aldrich)通透,并然后用2%(w/v)牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich)和2%(v/v)FBS封闭。最后,用罗丹明标记鬼笔环肽(rhodamine-phalloidin)(ThermoFisher)对细胞骨架进行F-肌动蛋白染色,并且用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Vector Laboratories,美国)对细胞核染色。倒置显微镜下可视化样品。
实施例二:
本实施例使用含有甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(methacrylated hyaluronic acid,HAMA)、明胶和中国大鲵的皮肤分泌物(Skin Secretion of Andrias davidianus,SSAD)的生物墨水组合物来实现潮湿条件下高效的手术中生物打印。其中,GelMA和HAMA为光固化生物材料,明胶为增稠剂。
还可以将本发明的原理应用于除GelMA和/或HAMA之外的光固化生物材料。例如,可以在生物墨水组合物中包括的一种或多种光固化生物材料,其可以选自GelMA、HAMA、ColMA、ChSMA、CSMA、DexMA、CMCSMA、AlgMA、PEGDA、PVAMA、SilMA、F127DA、HepMA。并且,上述光固化生物材料是由增稠剂甲基丙烯酰化(甲基丙烯酸酯化)改性后得到的,其中,增稠剂是亲水性聚合物,所述增稠剂可选自明胶、透明质酸及其盐、胶原、硫酸软骨素、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、海藻酸及其盐、聚乙二醇、聚乙烯醇、丝素、聚醚F127、肝素。而添加增稠剂的目的在于,调节预期的生物墨水的硬度以及节约成本,也就是说,添加增稠剂并不是必须的,而且添加的增稠剂与添加的光固化生物材料之间可以没有直接的对应关系(“直接的对应关系”可以理解为,例如,GelMA与明胶、HAMA与透明质酸及其盐)。简而言之,可以在生物墨水组合物中包括一种或多种光固化生物材料和/或一种或多种增稠剂的组合。
应注意,本发明提供的生物墨水组合物的交联,可以典型地用紫外光或可见光完成(也可以理解为“光交联”)。根据实际需要,光引发剂可选自2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、2-羟基-2-甲基苯丙酮、樟脑醌、双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-苯基氧化膦、二苯甲酮、过氧化苯甲酰。需要强调的是,上述光引发剂主要作用是交联光固化生物材料中的MA基团。
在不同表面原位制造的水下生物打印策略的示意图如图1A所示。本发明提供的独特的生物墨水组合物的几乎普适的粘附能力受π-π电子/阳离子-π相互作用、疏水相互作用、氢键以及所述生物墨水组合物和不同表面化学特性的各种各样的基底(substrate)之间的金属配位键的相互作用影响。所述各种各样的基底不仅包括生物组织,还包括常见的表面,如组织培养处理的培养皿、玻璃、硅酮聚合物、塑料(原始聚苯乙烯(pristinepolystyrene))和金属,这表明所述生物墨水组合物应用于在伤口上以及可能在现存的不同材料的植入物上进行原位生物打印的多功能性。在粘附性、内聚性和生物打印保真度上,对所述生物墨水组合物进行了评估。在优化的生物打印参数下,所述生物墨水组合物具备多材料(multi-material)、多层次(multi-layer)和多界面(multi-interface)的能力,可以在水下生物打印出各种图案。最后,评估了载细胞的生物墨水组合物的细胞相容性。
本实施例提供的水下粘附性生物墨水组合物,包括GelMA、明胶、HAMA和SSAD(图1B)。GelMA是最广泛使用的光交联聚合物之一,由甲基丙烯酸酐和明胶的反应合成。并由于固有的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列,GelMA能够支持细胞粘附、增殖和分化。此外,添加到所述生物墨水组合物中的明胶,不仅增加所述生物墨水组合物的粘度(viscosity),而且明胶从水凝胶后生物打印(post-bioprinting)的去除,为细胞铺展与迁移提供空间。HAMA源于透明质酸,是一种广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织的ECM的成分。它经甲基丙烯酸酯基修饰以引入光交联特性。通过添加HAMA,由于其高密度的羟基和羧基,潜在的氢键数量增加。SSAD是一种新开发的生物材料,含有大量能参与多种生理功能的多肽和蛋白质。此外,它在伤口愈合中起仿生粘合剂(adhesive)的作用,其中丰富的酪氨酸、苯丙氨酸以及其他氨基酸的成分参与了粘附相互作用。除此之外,本发明提供的生物墨水组合物还可以进一步包括生长因子、抗生素、外泌体等物质。
在水下生物打印期间,GelMA、HAMA、SSAD分子之间形成的大量的氢键和SSAD内部的S-S键,能增强挤出的生物墨水组合物在潮湿条件下的物理稳定性和内聚性(图1C)。此外,SSAD与其他表面的相互作用的多功能性,有助于水凝胶的粘附特性,其依赖于基底表面的化学特征。氢键被认为是促进生物粘附和在其他亲水表面上粘附的主要机制。接触疏水性表面(如聚二甲基硅氧烷(PDMS)或塑料(原始聚苯乙烯))时,产生强烈的π-π相互作用或阳离子-π相互作用以及疏水相互作用。此外,GelMA、明胶、HAMA和/或SSAD的羧酸基与金属之间的键合,使应用生物墨水组合物到现存的医疗植入物和设备成为可能。最后,生物打印后的光交联主要受GelMA和HAMA中的甲基丙烯酰基的自由基聚合影响,其进一步提供化学和结构。
实施例三:
对于挤出式生物打印,要求生物墨水能连续挤出并接着迅速稳定得以形成预期的图案,这通常由使用高粘度、具有剪切稀化特性或具有响应性(如温度)的生物材料来实现。将含有5wt.%GelMA和5wt.%明胶的生物墨水确定为对照组,鉴于GelMA此浓度下良好的细胞相容性和生物活性及添加明胶而提高的粘度。具体成分列于表1。
如图2A所示,由含有5wt.%GelMA和5wt.%明胶的对照生物墨水,在水下挤出期间,仅具有弱粘附性且支持形成即刻的纤维,然而内聚性也不足,导致振动时迅速分解(disintegration)。相比之下,当单独补充0.0125wt.%SSAD时,生物墨水的粘附性增加,然而添加0.0875wt.%HAMA本身没有影响生物墨水的粘附性。结果表明,SSAD担任调节生物墨水的粘附性的主要因素,使在水下的粘附性提高。内聚力是另一个水下生物打印期间影响生物墨水完整性的关键因素。与对照组相比,0.0125wt.%SSAD的单独存在,扰乱了挤出的细丝之间的内聚力,生物墨水中进一步添加0.0875wt.%HAMA,有效地恢复了其内聚力,可能是由于增加的氢键,因为不同的生物墨水之间粘度没有显著性差异存在(图2B)。
最后,用4种类型的生物墨水(没有随后的光交联)、通过在水下沉积20层的网格图案,来评估生物打印保真度,其中有序的细丝表明强大的稳定性。生物打印出的结构呈现出明显的差异。在水下打印图案后,对照生物墨水显示粘附力和内聚力低下并因此迅速经历不稳定。由于提高的粘附力,含有SSAD的生物墨水实现了良好的细丝,但挤出期间减少的内聚力导致图案的无序。相反,生物打印图案期间,HAMA的添加没有显著提高生物墨水的粘附性,但内聚性令人满意。值得注意的是,当4种成分全部存在时,可以实现明确的(well-defined)、多层次、高度稳定的网格结构的优化的水下生物打印。
应该注意的是,仅用含有5wt.%GelMA和5wt.%明胶的生物墨水在空气中生物打印时,过程是顺利的,与以前证明的一致[参考文献45]。但是,同样的生物墨水组成(即5wt.%GelMA和5wt.%明胶)不能在水环境中进行生物打印,挤出后不久表现分散的片段,导致在周围水的机械干扰下无法保持任何可见的形状。然而,当应用含有5wt.%GelMA、5wt.%明胶、0.0875wt.%HAMA和0.0125wt.%SSAD的生物墨水组合物,在水下成功地生物打印出一个结构,其在同一结构中、同每个相邻层一起,紧密地附在组织培养处理的培养皿的底部。值得注意的是,即使没有光交联,生物打印出的结构可以在水下保持其完整性和在培养皿上的稳定粘附。同样有趣和重要的是,在水下生物打印过程中,因为挤出的生物墨水会容易受周围液体的浮力支持,可以避免在空气中进行生物打印时的结构崩塌(structural collapse)或变形(deformation)。
本发明用提供的生物墨水组合物进一步研究了生物打印参数的影响,包括层间距离、喷嘴尺寸(在本文中还可以理解为“喷嘴内径尺寸”“内针尺寸”)、压力、喷嘴移动速度(在本文中还可以理解为“打印头移动速度”)和水温。通过比较生物打印出的结构与设计的图案(图6)来评估生物打印保真度。通过调整沉积层和喷嘴尖端之间的间隙,层间距离在0.05mm到0.15mm变化。在距离为0.05mm时观察到重叠,并且当距离增加到0.075mm和0.1mm时,实现了生物打印的准确性,但在进一步增加距离后,不匹配变得明显。喷嘴尺寸越小,生物打印出的细丝越细且网格结构越精确。然而,喷嘴的最小直径不一定提高分辨率,因为它可能引起生物墨水在尖端(tip)的堵塞。对于挤出压力,20磅每平方英寸(PSI)导致生物打印不完全,且增加到25PSI获得最佳图案,然而更高的压力导致局部融合。确定500mm min-1和700mm min-1的喷嘴移动速度是生物打印的合适设置。由于GelMA和明胶具有热胶凝(thermogelling)特性,水温也影响了生物打印能力,其中在15℃至55℃的范围内,过低或过高的温度都降低形状的保真度,而接近于室温和体温(25-35℃)的温度似乎是最优的。了解这些不同的关键生物打印参数的效果对于应用潮湿条件-粘附性生物墨水组合物到原位生物打印至关重要。
实施例四:
如图3A和3B所证明,本发明的生物墨水组合物具备在水下、在组织培养处理的培养皿表面上的生物打印出各种复杂结构的的能力。多材料生物打印(一种仿生组织异质性的基本方法)也可以与本发明结合。此外,结构崩塌是挤出式生物打印的主要限制。在本发明的生物打印系统中,由于抵消重力的浮力,水下多层次生物打印后卓越的结构的维持,进一步扩展了生物墨水在制造更厚的组织结构中的应用。这一特征某种程度上类似于水凝胶嵌入的(hydrogel-embedded)生物打印。另一个最近报道的液中(in-liquid)生物打印也使在水下环境中挤出成为可能,然而除非常不同的应用场景外,形成一个完整的组织并不容易实现。
正如所讨论的,本发明的生物墨水组合物的成分与不同表面之间有多种可能的相互作用。评估了生物打印到各种具有不同表面化学特性的基底上的生物墨水组合物的粘附性,通过将其全部浸入到水性介质中(图3C)。结果显示,生物打印到Dulbecco’s modifiedEagle培养基(DMEM)和磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)下面的组织培养处理的培养皿上的图案,粘附力保持不变,或者事实上,与在水中相比略有提高。通过培养基或盐溶液中的阳离子,去除阻碍生物墨水与基底表面接触的水化层,可能有助于这种提高,尽管差异并不显著。除组织培养处理的培养皿表面外,玻璃、PDMS、组织培养未处理的聚苯乙烯塑料、铝和铜,作为额外的水下生物打印基底并呈现令人鼓舞的粘附结果和生物打印出的图案,这与不同的相互作用有关。如图1C所示的所述不同的相互作用包括,例如,疏水相互作用(例如,与疏水表面的π-π相互作用和阳离子-π相互作用)、与亲水表面的氢键、与金属元素键合的羧酸基以及它们可能的组合。举个例子,通过扫描电子显微镜(SEM)观察到,组织培养处理的培养皿表面和生物打印出的图案之间的紧密粘附,如图7所示。注意,生物打印出的纤维的扁平(flattening)是由于干燥过程。这一观察再次证实了卓越的水下粘附力。
实施例五:
用本发明提供的生物墨水组合物,在不同的设置下、针对挤出的细丝的形态评估水下适印性(printability)。观察到2种类型的细丝,包括明确的细丝和不规则的细丝,其中所述明确的细丝几乎是直的且长度上直径相等。图4A的结果表明,生物墨水的挤出速度(表现为电机转速)降低,导致带有斑点的不规则细丝和过度沉积(over-deposition)。在相同的生物墨水挤出速度下,在范围内增加生物打印温度,提高了转变成明确的细丝的形态。在更高的生物墨水挤出率下(超过14.06°s-1,以描述将生物墨水推出注射器的伺服电机的旋速为单位)细丝中的斑点消失,而过度沉积现象主要是由于温度。以优化的生物打印参数,本发明成功地在水下的玻璃表面上制作了一系列复杂的2D图案(图4B),表现骨头、肠子、大脑、蒙娜丽莎和蓝精灵。3D结构展示出生物打印出的图案和基底(玻璃)之间以及不同层之间的强大的界面粘附力,促进了在垂直方向上、用多种材料制造体积结构的可能性(图4C)。此外,将鸡肉用作天然组织的体外模拟,在鸡肉上产生了符合不规则组织表面形貌(topography)的生物打印出的图案的良好粘附性(图4D),证明了进行直接手术中生物打印的潜力。可以清楚地看到,在鸡肉上原位生物打印出的图案(没有光交联)的强大粘附力。
实施例六:
生物墨水的适印性和生物性能之间的平衡,始终是3D生物打印的一项挑战。例如,有利于沉积保真度的更小的机针尺寸或更低的温度,可能在生物打印过程中导致细胞损伤。鉴于本发明优化的生物打印参数和细胞友好的设置,确定0.26mm作为喷嘴内径、25PSI作为压力、500mm/min-1作为喷嘴移动速度且25℃作为介质温度为用于细胞的生物打印条件。为了证明本发明水下生物打印系统的细胞相容性,将C2C12成肌细胞(还可以封装成肌细胞、间充质干细胞、神经细胞、骨细胞等多种类型的细胞,实验情况未显示)封装进本发明提供的生物墨水组合物(在此实施例为5wt.%GelMA、5wt.%明胶、0.0125wt.%SSAD和0.0875wt.%HAMA),并将其直接生物打印到充满培养基的组织培养处理的聚苯乙烯塑料孔的表面上,随后进行UV照射(10mW cm-2、360-480nm、30s)。封装C2C12细胞的生物打印出的图案培养了1、7和14天(图5A)。据揭示,生物打印出的结构稳定并在此期间保持其图案。C2C12细胞的活力在第1天为86.0±7.9%,第7天增加到96.0±3.6%,并且第14天接近100%(图5B,5D)。生物打印上由挤出生物墨水引起的剪切力可能是第1天评估时明显的细胞死亡的主要原因。此外,F-肌动蛋白染色表明,在生物打印的7天后,细胞已经很好地铺展;在第14天,细胞密度进一步增加,这也可能表明所述细胞的增殖(图5C)。这些结果共同证明,本发明提供的生物墨水组合物对细胞存活和铺展的细胞相容性和重要作用,而且水下生物打印过程只在培养的早期阶段对封装的细胞造成了轻微的损伤。
总结:
总之,本发明提供了一种含有光固化生物材料和鲵皮肤分泌物的可光交联生物墨水组合物,用于手术中生物打印,尤其在水下起增强粘附力和内聚力的作用。可能在多材料和/或多层次的样式中,生物打印平面图案和体积结构。所述生物墨水组合物在不同基底上显示出良好的粘附性,包括亲水(玻璃、组织培养处理的培养皿)或疏水(PDMS、组织培养未处理的聚苯乙烯塑料)和不同材料(聚合物、玻璃、或金属、生物组织)以及在不同的水环境下(如水、盐溶液、细胞培养基、体液)。通过打印设备,所述生物墨水组合物可以用于在潮湿条件下直接手写图案,这进一步促进了原位生物打印。应该注意的是,在未来,不同的粘附力不仅使在体液包围的潮湿组织表面上进行直接手术中生物打印成为可能,而且还可能在由金属或聚合物材料制成的现存的植入物上进行。此外,本发明提供的生物墨水组合物还一定程度有助于手术中生物打印技术在微创组织再生(minimally invasive tissueregeneration)上的应用。
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上面结合附图对本发明的实施例进行了描述,但是本发明并不局限于上述的具体实施方式,上述的具体实施方式仅仅是示意性的,而不是限制性的,本领域的普通技术人员在本发明的启示下,在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下,还可做出很多形式,这些均属于本发明的保护之内。
Claims (17)
1.鲵皮肤分泌物在制备用于水下生物打印的生物墨水中的用途,其特征在于,所述生物墨水包括:
(a)一种或多种光固化生物材料,所述光固化生物材料包括GelMA、HAMA、ColMA、ChSMA、CSMA、DexMA、CMCSMA、AlgMA、PEGDA、PVAMA、SilMA、F127DA、HepMA中的一种或多种;
(b)鲵皮肤分泌物;
(c)溶剂;
(d)光引发剂,所述光引发剂包括2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、2-羟基-2-甲基苯丙酮、樟脑醌、双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-苯基氧化膦、二苯甲酮、过氧化苯甲酰中的一种或多种;
(e)增稠剂,所述增稠剂包括明胶、透明质酸及其盐、胶原、硫酸软骨素、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、海藻酸及其盐、聚乙二醇、聚乙烯醇、丝素、聚醚F127、肝素中的一种或多种;
其中,所述光固化生物材料的浓度包括5wt.%;所述鲵皮肤分泌物的浓度包括0.0125wt.%;所述光引发剂的浓度为0.05-5wt.%;所述增稠剂的浓度包括5wt.%。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述鲵皮肤分泌物为冻干粉的形式。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述鲵包括大鲵属、隐鳃鲵属、山溪鲵属、小鲵属、巴鲵属、爪鲵属、肥鲵属、拟小鲵属、北鲵属、极北鲵属中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述光固化生物材料由所述增稠剂甲基丙烯酰化改性后得到。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述光固化生物材料为GelMA和HAMA;所述GelMA的浓度为5wt.%,所述HAMA的浓度为0.0875wt.%。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述生物墨水用于沉积到基底或表面上。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述基底或表面存在于水性介质中。
8.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述基底或表面包括亲水基底、疏水基底、金属、生物组织中的一种或多种。
9.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述水性介质包括水、盐溶液、细胞培养基、体液中的一种或多种。
10.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述沉积使用挤出。
11.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述溶剂包括PBS、纯水、生理盐水中的一种或多种。
12.如权利要求1-11任一项所述的用途,其特征在于,所述生物墨水含有活细胞。
13.如权利要求12所述的用途,其特征在于,所述活细胞包括成肌细胞、间充质干细胞、神经细胞、骨细胞中的一种或多种。
14.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述生物墨水进一步包括生长因子、抗生素、外泌体中的一种或多种。
15.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述生物墨水通过所述水下生物打印制造结构,所述结构包括2D结构和/或3D结构。
16.如权利要求15所述的用途,其特征在于,所述结构为一层或多层。
17.一种用于水下生物打印的含鲵皮肤分泌物的生物墨水组合物,其特征在于,所述生物墨水组合物包括:
(a)GelMA;
(b)HAMA;
(c)鲵皮肤分泌物;
(d)溶剂;
(e)光引发剂;
其中,所述GelMA的浓度包括5wt.%,所述HAMA的浓度包括0.0875wt.%,所述鲵皮肤分泌物的浓度包括0.0125wt.%;所述光引发剂的浓度为0.05-5wt.%。
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