CN111001038A - 胶原基3d打印生物墨水、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胶原基3D打印生物墨水、其制备方法及应用。本发明的生物墨水主要由生物相容性的高分子和微量的植物来源多酚等组成，安全无毒，具有高的生物相容性，且制备工艺简单，成本低廉，且其能够在碱性明胶凝固浴中通过三重交联反应快速固化。利用本发明生物墨水以3D打印方式制得的胶原支架具有较高强度和稳定性，可以作为生物工程支架广泛应用。

Description

胶原基3D打印生物墨水、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种生物医学材料，尤其涉及一种胶原基3D打印生物墨水、其制备方法及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
3D生物(细胞)打印是近些年发展起来的用于体内外制造组织或器官的增材制造技术，这种新型的组织工程技术可以实现将细胞，生长因子等成分精确地定位在生物支架的各个部位。3D生物打印技术的发展对于解决器官缺损等临床医学难题和个性化医疗与再生医学的发展具有重大意义。对于3D生物打印技术来说，其核心要素之一便是生物墨水的制造。理想的生物墨水通常需具备以下几点要求：(1)快速成型(固化)的能力；(2)反应条件温和适宜细胞生存生长；(3)生物相容性高能与细胞共混打印。
现有的3D打印生物墨水存在多种问题，包括：交联速度慢，打印支架达到一定层数之后需要用交联剂进一步交联固化成形；具有一定的细胞毒性，引入的光引发剂，有毒的交联剂戊二醛等使打印的支架难于进一步在生物医学中应用；细胞相容性不高，不能有效促进细胞生长和分化等。例如CN108310463A中的生物墨水制备方法需要将凝胶支架用戊二醛等有毒交联剂固化定性，无法满足实现墨水与细胞共混打印；CN110171131A中的生物墨水制备方法需要加入有毒的光引发剂触发支架固化。CN109575683A中的生物墨水制备方法支架固化时间长达15min-30min，难以实现快速的多层打印。另外，越来越多的合成高分子和其它天然高分子被用于合成3D打印生物墨水，但由于它们不能有效降解或者细胞相容性不高，从而阻止了它们的进一步应用。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种胶原基3D打印生物墨水、其制备方法及应用，从而克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种胶原基3D打印生物墨水，其包括溶剂和溶解于溶剂中的基质，所述基质包含质量比为1:0.001～0.05：1～20的胶原、植物多酚和醛基化的含羟基高分子。
本发明实施例还提供了一种胶原基3D打印生物墨水的制备方法，其包括：将胶原溶液与植物多酚溶液混合后反应形成胶原-多酚混合凝胶，再将所述胶原-多酚混合凝胶与醛基化的含羟基高分子及溶剂混合；其中，所述胶原、植物多酚和醛基化的含羟基高分子的质量比为1:0.001～0.05：1～20。
本发明实施例还提供了一种3D打印方法，其包括：
提供前述的任一种胶原基3D打印生物墨水，或者利用前述的任一种方法制备胶原基3D打印生物墨水；以及
在碱性明胶凝固浴中，利用所述墨水进行3D打印。
在一些实施方式中，所述的3D打印方法还包括：在打印结束后，将凝固浴置于35～38℃孵育，待其中的明胶浴溶解后，获得打印好的胶原基支架。
与现有技术相比，本发明的优点至少在于：
(1)模拟了天然细胞外基质的有效成分(主要成分为胶原蛋白和多糖等)，以胶原材料为基础，佐以可降解无毒性高分子和植物来源大分子，合成了一类未添加有毒交联剂的高相容性快速自交联生物墨水，其具有优异的细胞相容性，可与细胞进行共混打印；
(2)将所述生物墨水与碱性明胶凝固浴相结合，在生物墨水注入碱性明胶凝固浴中时即可立即发生固化，固化在10s之内发生，反应条件温和，效率高，能获得具有较高稳定性的胶原基支架，且其具有高生物相容性，在生物组织工程等领域具有广泛应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明实施例1中胶原-单宁酸混合凝胶的圆二色谱分析结果，其中线条1对应于胶原-单宁酸质量比为1:0.01时制备的胶原-单宁酸混合凝胶，线条2对应于胶原-单宁酸质量比为1:0.02时制备的胶原-单宁酸混合凝胶，线条3对应于纯胶原；
图2示出了本发明实施例1中胶原-单宁酸混合凝胶的红外光谱分析结果，其中线条1对应于胶原-单宁酸质量比为1:0.01时制备的胶原-单宁酸混合凝胶，线条2对应于纯胶原；
图3示出了本发明实施例1中牛皮来源Ⅰ型胶原的电泳分析结果，其中α1、α2、β分别对应胶原的三条螺旋链；
图4示出了本发明实施例1所获生物墨水的流变学分析结果；
图5a-图5b分别示出了本发明实施例1中胶原基支架的设计图、实物图；
图6示出了本发明实施例1中胶原基支架表面的SEM形貌；
图7示出了本发明实施例1中采用不同交联方式所获胶原基支架的弹性模量。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供的胶原基3D打印生物墨水，其包括溶剂和溶解于溶剂中的基质，所述基质包含质量比为1:0.001～0.05：1～20的胶原、植物多酚和醛基化的含羟基高分子。
在一些实施方式中，所述墨水中基质的浓度为1～60mg/ml。
在一些实施方式中，所述溶剂为浓度0.1～1.0wt％的乙酸溶液。
在一些实施方式中，所述墨水的pH值为3～4。
在一些实施方式中，所述胶原与植物多酚的质量比为1:0.001～0.02，优选为1:0.01～0.02。
在一些实施方式中，所述醛基化的含羟基类高分子的来源包括但不限于水溶性透明质酸、葡聚糖、环糊精、淀粉、聚乙二醇中的一种或多种的组合。
在一些实施方式中，所述植物多酚包括但不限于单宁酸、表没食子儿茶素、没食子酸中的一种或多种的组合。
在一些实施方式中，所述胶原为动物来源胶原，包括但不限于牛皮来源Ⅰ型胶原等。
在一些实施方式中，所述醛基化的含羟基类高分子的制备方法包括：在室温下，于保护性气氛中将含羟基类高分子、对醛基苯甲酸与4-二甲氨基吡啶溶于无水有机溶剂中，之后加入N,N'-二环己基碳二亚胺，20～37℃条件下反应15～20h。其中，所述含羟基类高分子、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶与N,N'-二环己基碳二亚胺的分子当量之比可以为1：3～4：0.3～0.4：5～6。所述无水有机溶剂可以采用四氢呋喃等，且不限于此。所述保护性气氛可以选自氮气气氛、惰性气氛或其混合气氛等，且不限于此。
本发明实施例的另一个方面提供的一种胶原基3D打印生物墨水的制备方法包括：将胶原溶液与植物多酚溶液混合反应制备形成胶原-植物多酚酸混合凝胶，再将所述胶原-植物多酚混合凝胶与醛基化的含羟基高分子及溶剂混合；所述胶原、植物多酚和醛基化的含羟基高分子的质量比为1:0.001～0.05:1～20。
在一些实施方式中，所述制备方法具体包括：将固定质量比的胶原和植物多酚分别用溶剂溶解，待完全溶解后在室温下将两种溶液迅速搅拌混合，使得胶原和植物多酚在氢键、疏水作用、π-π共轭物理作用等驱使下形成一种简单凝胶，成胶时间在30s以内。其中，所述溶剂选用浓度0.1～1.0wt％的乙酸溶液。
在一些实施方式中，所述制备方法具体包括：将所述胶原-植物多酚混合凝胶与醛基化的含羟基高分子溶液混合。其中，所述醛基化的含羟基高分子溶液中采用的溶剂包括浓度0.1～1.0wt％的乙酸溶液或纯水。
在一些实施方式中，所述墨水中基质的浓度为1～60mg/ml。
在一些实施方式中，所述溶剂包括浓度0.1～1wt％的乙酸溶液。
在一些实施方式中，所述墨水的pH值为3～4。
在一些实施方式中，所述胶原与植物多酚的质量比为1:0.001～0.02，优选为1:0.01～0.02。在一些实施方式中，所述醛基化的含羟基类高分子的来源包括水溶性透明质酸、葡聚糖、环糊精、淀粉、聚乙二醇中的一种或多种的组合。
在一些实施方式中，所述植物多酚包括但不限于单宁酸、表没食子儿茶素、没食子酸中的一种或多种的组合。
在一些实施方式中，所述胶原为动物来源胶原，包括但不限于牛皮来源Ⅰ型胶原等。
在一些实施方式中，所述醛基化的含羟基类高分子的制备方法包括：在保护性气氛中将含羟基类高分子、对醛基苯甲酸与4-二甲氨基吡啶溶于无水有机溶剂中，之后加入N,N'-二环己基碳二亚胺，20～37℃条件下反应15～20h。其中，所述含羟基类高分子、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶与N,N'-二环己基碳二亚胺的分子当量之比为1：3～4：0.3～0.4：5～6。所述无水有机溶剂可以采用四氢呋喃等，且不限于此。所述保护性气氛可以选自氮气气氛、惰性气氛或其混合气氛等，且不限于此。
在一些实施方式中，所述含羟基类高分子包括且不限于水溶性透明质酸、葡聚糖、环糊精、淀粉、聚乙二醇中的一种或多种的组合。
本发明实施例的另一个方面提供了所述胶原基3D打印生物墨水于制备生物工程支架中的用途。
本发明实施例的另一个方面提供了一种3D打印方法，其包括：
提供所述的胶原基3D打印生物墨水，或者利用所述的方法制备胶原基3D打印生物墨水；以及
在碱性明胶凝固浴中，利用所述墨水进行3D打印。
在一些实施方式中，所述的3D打印方法具体包括：将所述墨水的pH值调节至3～4，并去除其中的气泡，再进行3D打印。
在一些实施方式中，所述的3D打印方法具体包括：将明胶和阿拉伯胶溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到碱性明胶凝固浴。
进一步的，所述碱性明胶凝固浴包含2～2.5wt％明胶和0.2～0.3wt％阿拉伯胶，而所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4～7.8。
在一些实施方式中，所述的3D打印方法还包括：在温度为4～10℃的条件下，将所述生物墨水在所述碱性明胶凝固浴中打印并固化成形。
在一些实施方式中，所述的3D打印方法还包括：在打印结束后，将凝固浴置于35～38℃孵育，待其中的明胶浴溶解后，获得打印好的胶原基支架。
本发明前述实施例提供的胶原基3D打印生物墨水主要由纯的可降解无毒性高分子和植物来源大分子组成，未引入有毒交联剂或小分子，具有优异的细胞相容性，可与细胞进行共混打印。所述生物墨水在碱性环境下，可快速成型，反应条件温和，具有高生物相容性。
本发明前述实施例提供的胶原基3D打印生物墨水与碱性明胶凝固浴相结合，在生物墨水注入碱性明胶浴中时，即可快速固化并促进三重交联，即：(1)胶原在碱性溶液中迅速自交联固化；(2)单宁酸等植物多酚在碱性环境下氧化，与胶原链间发生席夫碱和迈克尔加成反应，进一步加强固化；(3)碱性环境下能促进席夫碱反应，使醛基化的含羟基类高分子进一步与胶原上的氨基交联，更进一步加强支架稳定性。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，实施例中的试验方法均按照常规条件进行。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：本实施例提供的一种胶原基3D打印生物墨水包括基质和溶剂，其中基质的质量浓度为20mg/ml。
进一步的，基质的组成成分为胶原、单宁酸、醛基化的含羟基类高分子，按质量比其组成为胶原：单宁酸：醛基化的含羟基高分子＝1:0.01-0.02：1。
进一步的，溶剂为质量分数为0.1％的乙酸溶液。其中，醛基化的含羟基类高分子是由含羟基类高分子经醛基化处理后形成。该含羟基类高分子采用透明质酸。
进一步的，单宁酸为一种含有5个棓酰基的天然植物来源多酚，又名鞣酸，其亦可被替代为其它的植物多酚，如表没食子儿茶素、没食子酸中的一种或多种的组合。
所述生物墨水可以通过如下工艺制备，包括：
(1)预先制备胶原-单宁酸混合凝胶，即，分别按质量比1:0.01、1：0.02将胶原与单宁酸混合形成凝胶，所述凝胶制备方法为将固定质量比的胶原和单宁酸基质分别用0.1wt％的乙酸溶液溶解，待完全溶解后在室温下将两种溶液迅速搅拌混合，胶原和单宁酸在氢键、疏水作用、π-π共轭等作用下形成一种简单凝胶，成胶时间在30s以内。参阅图1所示圆二色谱分析结果，表明胶原-单宁酸混合凝胶中胶原仍保持三螺旋结构所具备的α螺旋和β折叠特征峰，再请参阅图2所示的红外光谱，其中也显示在胶原-单宁酸混合凝胶中胶原基本结构未有任何变化，进一步表明本实施例的生物墨水仍可保留胶原材料所特有的生物活性。
该步骤中采用胶原为牛皮来源Ⅰ型胶原，并也可替代为其它动物来源胶原。参阅图3，其中示出了本实施例所采用牛皮来源Ⅰ型胶原的相对分子质量。
(2)在室温下将含羟基类高分子水溶性透明质酸、葡聚糖、环糊精、淀粉、聚乙二醇中的一种(分子当量为1)与对醛基苯甲酸(分子当量为4)、4-二甲氨基吡啶(分子当量为0.3)溶于100ml干燥的四氢呋喃中，在氮气氛围中搅拌20～25分钟，使其充分溶解，随后在氮气氛围中加入N,N'-二环己基碳二亚胺(分子当量为5)，在氮气氛围，20℃条件下反应18h，反应结束后，抽滤样品，用乙醚洗涤3～5次，获得醛基化的含羟基类高分子，置于烘箱中干燥待用。
(3)将以上步骤获得的胶原-单宁酸混合凝胶与醛基化的含羟基类高分子溶液(以浓度0.1wt％的乙酸溶液作为溶剂)混合，即可得所述生物墨水。参阅图4，流变学分析结果表明，本实施例制备的墨水具有剪切变稀性质，因而具有良好的打印性。
所述生物墨水的一种应用方案是：采用3D打印工艺制成胶原支架。其具体过程可以包括：
调节所述生物墨水的pH值为3～4，并在正式打印前将所述墨水充分混匀，通过超声，离心等方式去除其中的气泡；
配制碱性明胶凝固浴，包括：将明胶、阿拉伯胶溶于pH值＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，超声并置于37℃下保温溶解，得到碱性明胶凝固浴，其中明胶、阿拉伯胶的质量分数分别为2％、0.2％；
在温度为4～10℃的条件下，将所述生物墨水在所述碱性明胶凝固浴中打印并固化成形，且在打印结束后，将凝固浴置于37℃左右孵育，待明胶浴溶解后，即可得到打印好的胶原基支架。如图5b所示是用本实施例的胶原基墨水打印的一个4cm×4cm×2cm方块，图5a所示是相应的3D设计图。图6示出了该胶原基支架的表面SEM形貌图。
另外，以本实施例中的胶原作为空白组，并参照本实施例的前述方案，分别将胶原、胶原-单宁酸混合凝胶，胶原-单宁酸-透明质酸墨水进行碱固化交联，测量得到不同交联方式作用之后胶原基支架的弹性模量的值如图7所示，表明本实施例所获的经三重交联之后的支架强度明显提高，扩展了其应用。
实施例2：本实施例提供的胶原基3D打印生物墨水、其制备方法与应用方式与实施例1基本相同，区别之处在于：墨水中基质的质量浓度为30mg/ml，溶剂采用浓度0.5wt％的乙酸溶液。含羟基类高分子采用葡聚糖。植物多酚采用没食子酸。基质中，按质量比为胶原：没食子酸：醛基化的含羟基高分子＝1:0.05:4。而在制备醛基化的含羟基高分子的过程中，含羟基类高分子、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶与N,N'-二环己基碳二亚胺的分子当量之比为1：3：0.4：6。
实施例3：本实施例提供的胶原基3D打印生物墨水、其制备方法与应用方式与实施例1基本相同，区别之处在于：墨水中基质的质量浓度为40mg/ml，溶剂采用浓度1.0wt％的乙酸溶液。含羟基类高分子采用环糊精。植物多酚采用表没食子儿茶素。基质中，按质量比为胶原：表没食子儿茶素：醛基化的含羟基高分子＝1:0.03:3。而在制备醛基化的含羟基高分子的过程中，含羟基类高分子、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶与N,N'-二环己基碳二亚胺的分子当量之比为1：4：0.3：6。以及，碱性明胶凝固浴包含2.5wt％明胶和0.3wt％阿拉伯胶，其中磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.8。
实施例4：本实施例提供的胶原基3D打印生物墨水、其制备方法与应用方式与实施例1基本相同，区别之处在于：墨水中基质的质量浓度为50mg/ml。基质中，按质量比为胶原：单宁酸：醛基化的含羟基高分子＝1:0.02:20。含羟基类高分子采用淀粉。
实施例5：本实施例提供的胶原基3D打印生物墨水、其制备方法与应用方式与实施例1基本相同，区别之处在于：墨水的基质中，按质量比为胶原：单宁酸：醛基化的含羟基高分子＝1:0.005:4。以及，在以所述生物墨水进行3D打印后，将凝固浴置于38℃左右孵育，最终得到打印好的胶原基支架。
实施例6：本实施例提供的胶原基3D打印生物墨水、其制备方法与应用方式与实施例1基本相同，区别之处在于：墨水的基质中，按质量比为胶原：单宁酸：醛基化的含羟基高分子＝1:0.001:3。以及，在以所述生物墨水进行3D打印后，将凝固浴置于35℃左右孵育，最终得到打印好的胶原基支架。
本发明前述实施例提供的胶原基3D打印生物墨水主要由生物相容性的高分子和微量的植物来源多酚等组成，安全无毒，具有高的生物相容性，且制备工艺简单，成本低廉，且其能够在碱性明胶凝固浴中通过三重交联反应快速固化。利用本发明生物墨水以3D打印方式制得的胶原支架具有较高强度和稳定性，可以作为生物工程支架广泛应用。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
应理解，在本发明中，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。

Claims (10)

1.一种胶原基3D打印生物墨水，其特征在于包括溶剂和溶解于溶剂中的基质，所述基质包含质量比为1:0.001～0.05:1～20的胶原、植物多酚和醛基化的含羟基高分子。
2.根据权利要求1所述的胶原基3D打印生物墨水，其特征在于：所述墨水中基质的浓度为1～60mg/ml；和/或，所述溶剂为浓度0.1～1.0wt％的乙酸溶液；和/或，所述墨水的pH值为3～4。
3.根据权利要求1所述的胶原基3D打印生物墨水，其特征在于：所述胶原与植物多酚的质量比为1:0.001～0.02，优选为1:0.01～0.02。
4.根据权利要求1所述的胶原基3D打印生物墨水，其特征在于：所述醛基化的含羟基类高分子的来源包括水溶性透明质酸、葡聚糖、环糊精、淀粉、聚乙二醇中的一种或多种的组合；和/或，所述植物多酚包括单宁酸、表没食子儿茶素、没食子酸中的一种或多种的组合；和/或，所述胶原选自动物来源胶原。
5.根据权利要求1所述的胶原基3D打印生物墨水，其特征在于，所述醛基化的含羟基类高分子的制备方法包括：在室温下，于保护性气氛中将含羟基类高分子、对醛基苯甲酸与4-二甲氨基吡啶溶于无水有机溶剂中，之后加入N,N'-二环己基碳二亚胺，20～30℃条件下反应15～20h，其中，含羟基类高分子、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶与N,N'-二环己基碳二亚胺的分子当量之比为1：3～4：0.3～0.4：5～6。
6.一种胶原基3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于包括：将胶原溶液与植物多酚溶液混合反应后形成胶原-多酚混合凝胶，再将所述胶原-多酚混合凝胶与醛基化的含羟基高分子溶液混合；所述胶原、植物多酚和醛基化的含羟基高分子的质量比为1:0.001～0.05：1～20。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述墨水中基质的浓度为1～60mg/ml；和/或，所述溶剂包括浓度0.1-1.0wt％的乙酸溶液；和/或，所述胶原与植物多酚的质量比为1:0.001～0.02，优选为1:0.01～0.02；和/或，所述植物多酚包括单宁酸、表没食子儿茶素、没食子酸中的一种或多种的组合；和/或，所述胶原选自动物来源胶原；和/或，所述墨水的pH值为3～4。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述醛基化的含羟基类高分子的制备方法包括：在保护性气氛中将含羟基类高分子、对醛基苯甲酸与4-二甲氨基吡啶溶于无水有机溶剂中，之后加入N,N'-二环己基碳二亚胺，20～37℃条件下反应15～20h，其中，含羟基类高分子、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶与N,N'-二环己基碳二亚胺的分子当量之比为1：3～4：0.3～0.4：5～6；优选的，所述含羟基类高分子包括水溶性透明质酸、葡聚糖、环糊精、淀粉、聚乙二醇中的一种或多种的组合。
9.一种3D打印方法，其特征在于包括：
提供权利要求1～4中任一项所述的胶原基3D打印生物墨水，或者利用权利要求5～8中任一项所述的方法制备胶原基3D打印生物墨水及其支架；以及
在碱性明胶凝固浴中，利用所述墨水进行3D打印。
10.根据权利要求9所述的3D打印方法，其特征在于具体包括：
将明胶和阿拉伯胶溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到碱性明胶凝固浴，所述碱性明胶凝固浴包含2～2.5wt％明胶和0.2～0.3wt％阿拉伯胶，而所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4～7.8；
之后，在温度为4～10℃的条件下进行所述的3D打印，并在打印结束后，将凝固浴置于35-38℃孵育，待其中的明胶浴溶解后，获得打印好的胶原基支架。
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