CN104212762A - 一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法，包括从人尿液样品中获得尿源性细胞，对得到的原代细胞进行体外小分子诱导和培养获得贴壁生长的P1代hUSCs克隆，挑取生长状态良好的hUSCs克隆进行接种，并继续传代培养，获得细胞呈现长梭形，状态良好的hUSCs。采用本方法制备的hUSCs经诱导可定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、成纤维细胞或平滑肌细胞，对糖尿病下肢缺血模型进行体内移植hUSCs，研究结果表明其能显著增强缺血部位的血流恢复和血管新生。本方法制备的hUSCs可应用于治疗和修复糖尿病及并发症、心脑肾血管疾病、阿尔兹海默症、骨质疏松、关节炎等病变组织与器官的修复，以及泌尿系统肿瘤预警与细胞药物的筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种多潜能干细胞的制备方法，特别涉及一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞(Human Urine-Derived Stem Cells，hUSCs)的方法。本发明属于细胞生物学技术领域，
背景技术
组织、器官的丧失或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡的最主要原因。据美国的一份资料显示，每年有数以百万计的美国人患有各种组织、器官的丧失或功能障碍，每年需进行800万次手术进行修复，年住院日在4000—9000万之间，年耗资超过400亿美元。近年来，干细胞领域所取得的一系列重大突破燃起了人类寻找组织器官再生修复的希望。
干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞。在胚胎和成年组织中均存在着具有高度更新能力和多向分化潜能的干细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。目前发现的成体干细胞主要有造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、肌肉干细胞、皮肤干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞等。随着对干细胞可塑性认识的深入，其在多组织器官损伤性疾病治疗中的应用潜能进一步加大。与胚胎干细胞不同，成体干细胞不存在胚胎干细胞有的移植排斥反应、致瘤性及伦理等问题。在体外理想的培养条件下，将人体多种组织来源的成体干细胞从组织中提取分离出来，并在体外人工增殖扩增至治疗剂量，经合适途径移植给受者，通过参与受者组织细胞的替代和再生，修复病变或衰老的器官组织结构并重建功能，从而用于治疗多种目前尚不能用传统治疗手段治愈的相关疾病：糖尿病及并发症、心脑肾血管疾病、阿尔兹海默症、骨质疏松、关节炎等。从目前完成的干细胞临床试验表明，成体干细胞移植在安全性、有效性、稳定性等各方面均非常适合临床治疗的要求，将是未来相当一段时期内有希望首先从实验室研究真正走向临床应用的治疗性干细胞。
能够利用病人自身的干细胞用于治疗具有不发生诱导免疫反应或排斥的优势，然而，因为组织特异性的干细胞数量稀少，所以很难将它们从器官和组织中分离出来。近来已有研究利用小分子化合物成功诱导多潜能干细胞定向分化，包括5-氮杂胞苷(5-aza-2–deoxycytidine5-AZA)，DNA甲基化化酶抑制剂以及作为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase)竞争性抑制剂的腺苷类似物；研究还发现通过在培养过程中添加维生素C可使诱导多潜能干细胞(inducedpluripotent stem cells，iPS cells)的诱导效率提高10倍。
目前国内关于hUSCs的研究基本处于空白阶段，本发明利用一种非侵入式的简单低成本的方法而非外科手术，通过体外化学小分子组合诱导重编程培养获得尿液源性多潜能干细胞。通过体外增殖培养并证实这些干细胞具有多潜能性，并且通过细胞移植发现这些hUSCs能有效促进糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生与血流恢复。此外，在植入体内后未观测到肿瘤形成，其安全性与有效性hUSCs可转化于未来临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法以及由该方法得到的尿源性多潜能干细胞，研究发现这些干细胞具有多潜能性，并且通过细胞移植发现这些hUSCs能有效促进糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生与血流恢复。
为了达到以上目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)尿源性细胞的分离
将获取的人尿液样品进行离心，沉淀用PBS洗1-3遍后，离心，弃上清，用培养液重悬细胞，得到尿源性细胞；
(2)尿源性细胞的原代培养
将得到的尿源性细胞接种于含有培养液的24孔板中，置于细胞培养箱内培养，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得贴壁生长的P0代圆形细胞；
(3)化学小分子诱导重编程获得P1代尿源性多潜能干细胞
选择步骤(2)培养的得到的状态佳的细胞接种于含有培养液的六孔板中，细胞贴壁生长后，采用两步诱导法，第一步，向培养液中添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)诱导培养1-3天；第二步，向含有5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷的培养液中添加3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C进行诱导，每4天换一次诱导培养液，10-14天完成化学小分子诱导细胞重编程，获得贴壁生长的圆形或短梭形且具有无限增殖和多向分化潜能的细胞，即为P1代尿源性多潜能干细胞克隆；
其中，5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)、3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C的化学结构式分别如下所示：
(4)P0代尿源性多潜能干细胞的传代培养
挑选小分子诱导获得的P1代尿源性多潜能干细胞克隆，接种转移至含有培养液的6孔板中继续培养，细胞生长至90％融合转移至含有相同培养液的9cm平皿中进行传代培养，通过连续传代之后，获得呈现长梭形，状态良好的细胞，即为尿源性多潜能干细胞。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(1)中所述的培养液为含有15％(v/v)胎牛血清(FBS)的KSFM培养液(keratinocyte serum-free medium)。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(2)中所述的培养液为含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素以及100mg/ml链霉素的KSFM培养液。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(2)中将得到的细胞按照500个细胞/孔的密度接种于24孔板中，置于37℃，5％CO2及饱和湿度细胞培养箱内培养，接种24h后，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得贴壁生长的圆形细胞。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(3)中所述的培养液为含有5％(v/v)FBS的KSFM以及EFM(embryonic fibroblast medium)按照等体积混合的培养液，所述的诱导培养液为含有3-Deazaneplanocin A(DZNeP)、维生素C以及5％(v/v)FBS的KSFM以及EFM(embryonic fibroblast medium)按照等体积混合的培养液。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(3)中添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷使其终浓度达到2-10μmol/L，添加3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C使其终浓度分别达到1-5μmol/L以及10-40μg/ml。
在本发明所述的方法中，步骤(4)中初次传代时间为6-8天，初次传代后，按照1：3的比例转移至含有相同培养液的9cm平皿中进行传代培养，3-4天传代一次，通过连续传代5-7代之后，获得呈现长梭形，状态良好的细胞，即为尿源性多潜能干细胞，其中所述培养液为含有5％(v/v)FBS的KSFM以及EFM按照等体积混合的培养液。
进一步的，本发明还提出了由所述的方法制备得到的尿源性多潜能干细胞，其特征在于，所述的尿源性多潜能干细胞为表达间质标志CD29、CD44、CD73、CD90和SSEA-4，不表达成熟造血细胞标志CD45及内皮标志CD31和CD133的多潜能干细胞。
碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase，ALP)染色和Von Kossa矿化染色鉴定其能向成骨细胞分化；油红O(Oil Red O)鉴定其能向脂肪细胞分化；细胞免疫免疫荧光染色其表达，培养扩增所获得的该细胞通过移植能有效促进糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生与血流恢复，并在植入体内后未观测到肿瘤形成。本发明将为hUSCs的研究和细胞临床治疗发挥重要作用，应用前景广阔。
因此，更进一步的，本发明还提出了所述的尿源性多潜能干细胞在定向诱导细胞分化中的应用，所述细胞为脂肪细胞，成骨细胞，平滑肌细胞，神经细胞、骨骼肌细胞或成纤维细胞。
再进一步的，本发明还提出了所述的尿源性多潜能干细胞在制备治疗糖尿病引起的远端血管闭塞和糖尿病足的药物中的用途。
本发明的有益效果体现在：
本发明提供了一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法，这是一种非侵入式的简单低成本的方法，通过对得到的多潜能干细胞进行体外增殖培养，结果证实这些干细胞具有多潜能性，经诱导可定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、成纤维细胞、神经细胞或平滑肌细胞，并且对糖尿病下肢缺血模型进行体内移植，结果表明hUSCs能显著增强缺血部位的血流恢复和血管新生。因此，本方法制备的hUSCs可应用于治疗和修复糖尿病及并发症、心脑肾血管疾病、阿尔兹海默症、骨质疏松、关节炎等病变组织与器官的修复，以及泌尿系统肿瘤预警与细胞药物的筛选，具有广泛的临床应用前景。
附图说明
图1为通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞方法的实验步骤示意图；
图2为hUSCs的形态学观察图；
图3为hUSCs的增殖曲线图；
图4为hUSCs的细胞表面标志分析鉴定的流式细胞仪结果图；
图5为体外诱导hUSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化图；
图6为hUSCs多向分化潜能的免疫荧光检测图；
图7为hUSCs移植促进糖尿病大鼠下肢缺血的血管生成与血流恢复图。
具体实施方式
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞(hUSCs)
体外分离培养hUSCs的实验步骤示意图如图1所示。
(1)尿源性细胞分离
将获取的人尿液样品50-100mL以500g的转速离心5min，沉淀用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4)洗两遍后弃上清，用培养液重悬细胞，培养液成分为：keratinocyte serum-free medium(KSFM)培养基+15％FBS(购自Gibco-Invitrogen公司)，分离得到尿源性细胞；
(2)尿源性细胞的原代培养
将得到的尿源性细胞按照500个细胞/孔的密度接种于含有培养液的24孔板中，培养液成分为：keratinocyte serum-free medium(KSFM)培养基+10％FBS+青霉素(100U/ml)+链霉素100mg/ml(购自Gibco-Invitrogen公司)，置于37℃，5％CO2及饱和湿度细胞培养箱内培养，接种24小时后，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得P0代贴壁生长的圆形细胞；
(3)化学小分子诱导重编程获得P1代尿源性多潜能干细胞
尿源性细胞正常培养在培养液中，选择状态佳的细胞接种于含有培养液的六孔板中，密度为1×105细胞/孔。培养液为：keratinocyte serum-free medium(KSFM)+embryonic fibroblast medium(EFM)(体积比1：1混合)培养基+5％FBS(购自Gibco-Invitrogen公司)。观察细胞贴壁2小时后，采用两步诱导法，第一步，添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)使其终浓度为6μmol/L，诱导培养2天；第二步，向含有5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷的培养液中添加3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C(vitamin C)进行诱导，并使其终浓度分别达到3μmol/L以及20μg/ml，每4天换一次诱导培养液，诱导培养液的成分为KSFM+EFM(体积比1：1混合)+5％FBS+3μmol/L3-Deazaneplanocin A(DZNeP)+20μg/ml维生素C(vitamin C)。10-14天完成化学小分子诱导细胞重编程，获得贴壁生长的圆形和短梭形具有无限增殖和多向分化潜能的细胞，即为P1代尿源性多潜能干细胞克隆；正常培养的尿源性细胞作为阴性对照。
(4)P1代尿源性多潜能干细胞的传代培养
挑选小分子诱导获得的P1代尿源性多潜能干细胞克隆，接种转移至含有培养液的6孔板中继续培养，细胞生长至90％融合转移至含有相同培养液的9cm平皿中进行初次传代培养，培养液的成分为KSFM+EFM(体积比1：1混合)+5％FBS。第一代的hUSCs生长缓慢，初次传代时间在7天左右。初次传代后，细胞生长迅速，按照1：3的比例转移至9cm平皿中进行传代培养，需3-4天传代一次(见图2)。通过连续传代(约5代)之后，细胞呈现长梭形，状态良好，即为本发明所述的尿源性多潜能干细胞。
实施例2体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞(hUSCs)
采用两步诱导法，第一步，添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)使其终浓度为2μmol/L，诱导培养2天；第二步，添加3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C(vitamin C)进行诱导，并使其终浓度分别达到3μmol/L以及40μg/ml，
其余步骤同实施例1。
实施例3体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞(hUSCs)
采用两步诱导法，第一步，添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)使其终浓度为8μmol/L，诱导培养2天；第二步，添加3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C(vitamin C)进行诱导，并使其终浓度分别达到4μmol/L以及10μg/ml，
其余步骤同实施例1。
实施例4体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞(hUSCs)
采用两步诱导法，第一步，添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)使其终浓度为10μmol/L，诱导培养2天；第二步，添加3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C(vitamin C)进行诱导，并使其终浓度分别达到2μmol/L以及20μg/ml，
其余步骤同实施例1。
实施例5hUSCs的增殖能力检测
通过CCK-8试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)检测实施例1制备得到的尿源性多潜能干细胞的增殖生长情况，取生长状态良好的P6代与P12代对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，按每孔100μL培养基含1000个细胞的密度接种于96孔板内，每代细胞种8孔/板，共种8板，细胞每三天换一次液。每天在固定时间取一板细胞，将培养基更换为含CCK-8溶液的完全培养液(100μL培养液中加入10μL CCK-8液体)，在培养箱培养3小时后检测450nm处吸光度OD值，连续检测7天，根据吸光度OD值绘制细胞生长曲线并进行统计学分析。根据公式计算群体倍增时间：TD＝t×lg2/(lgNt-lgN0)(TD：细胞群体倍增时间，t：培养时间，如24h，N0：对数生长期某一起始吸光值，Nt：对数生长期培养t小时后的吸光值)。
细胞增殖能力检测结果显示，第6代、12代的hUSCs生长曲线形态相似，呈现S型，接种后前2天细胞生长缓慢，处于滞留期，2天后细胞生长迅速，进入对数生长期，7天后细胞增殖达到顶峰，显微镜下观察，细胞已生长至90％融合。在生长曲线上取对数生长期特定时间吸光值，通过公式计算群体倍增时间，第6代、12代细胞分别为：37.25h和37.89h，统计结果显示，两者之间没有明显区别，第6代、12代的hUSCs增殖能力基本一致(图3)。
实施例6流式细胞仪检测hUSCs细胞表面标志
取P5-P10代的从尿液诱导的多潜能干细胞进行流式细胞学分析。取培养到80％左右融合的细胞，去掉培养液用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液消化，PBS洗涤后制成浓度约1×107个细胞/mL的单细胞悬液。取100μL细胞悬液加入1.5mLEP管中，分别各加入1μL下列的小鼠抗人一抗：SSEA-4、CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD133(均购自eBioscience公司)，4℃孵育45min，PBS洗三遍，再分别加入FITC标记的山羊抗小鼠lgG二抗或兔抗山羊lgG二抗(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，4℃避光孵育30min，PBS洗三遍后通过流式细胞仪检测，阴性对照为不加一抗只加FITC标记的山羊抗小鼠lgG或兔抗山羊lgG二抗。
经流式细胞仪测定贴壁生长hUSCs表型均一，表达间质标志CD29、CD44、CD73、CD90、和SSEA-4，不表达成熟造血细胞标志CD45及内皮标志CD31、CD133(图4)。
实施例7体外诱导hUSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化
hUSCs向成骨细胞诱导分化及鉴定：取P6代hUSCs以1×104/孔的细胞密度接种于24孔培养板中，贴壁24h后，用成骨诱导培养液(低糖DMED+10％FBS，补充0.10mol/L地塞米松，500g/mL抗坏血酸及10mmol/Lβ-甘油磷酸钠)培养。每3天更换一次培养基，培养14天后，早期成骨鉴定用碱性磷酸酶试剂盒染色，诱导21-28天后，晚期成骨鉴定用Von Kossa染色，矿化结节将呈黑色。
hUSCs向脂肪诱导分化及鉴定：取P6代以hUSCs以1×104/孔接种于24孔板，贴壁24小时后，用脂肪诱导培养液(α-DMEM+10％FBS，补充1μM地塞米松，0.5mM IBMX，10μM胰岛素，200μM吲哚美辛)培养7-14天，油红O染色，红色油滴状的微粒存在脂肪细胞浆内。
以上两组实验以未加诱导培养基的hUSCs为对照，进行诱导效果鉴定。
hUSCs体外诱导实验结果如图5所示，在向脂肪细胞分化诱导14天后，能够观察到明显的脂肪滴，油红O染色呈阳性(图5A)。在向成骨细胞分化诱导14天后，能够观察到hUSCs向早期成骨分化，碱性磷酸酶染色呈阳性(图5B)，25天时形成的后期成骨钙化的骨结节，Von Kossa染色呈阳性(图5C)。对照组未能检测到脂肪滴和矿化结节形成，说明hUSCs可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。
实施例8hUSCs的多向分化潜能鉴定
取P6代hUSCs以2×103/孔的细胞密度接种于96孔培养板中，分化诱导培养液(高糖DMEM+EFM(1：1混合)培养基(购自Gibco-Invitrogen公司)+10％FBS，补充添加诱导因子2.5ng/mL TGF-β1，5.0ng/mL PDGF-BB(购自R&D公司))，每3天换液一次，诱导14天，细胞呈长梭形的成纤维细胞形态，免疫荧光检测的平滑肌细胞标志α-SMA，成纤维细胞标志vimentin，骨骼肌细胞标志desmin，肌球蛋白myosin。
免疫荧光染色方法如下：(1)细胞用4％多聚甲醛固定20min后，PBS洗涤3次；(2)0.1％Triton-X-100室温破膜10min，PBS洗3次，每次5min；(3)二抗血清(1:20)稀释，37℃室温封闭30min；(4)加入一抗：α-SMA(购自Sigma公司)、vimentin、desmin、myosin(均购自eBioscience公司)，4℃过夜；(5)PBS洗3次，每次5min；(6)加FITC标记的二抗(l:100)，室温避光30min，PBS洗涤3次，每次5min；(7)加DAPI染液(1:500)，室温l-2min，PBS洗涤3次，每次5min；(8)荧光显微镜下观察结果。
免疫荧光检测结果显示，诱导的hUSCs表达α-SMA、vimentin、desmin和myosin为阳性，说明其能向平滑肌细胞，成纤维细胞标志，神经细胞、骨骼肌细胞分化(图6)。
实施例9移植hUSCs治疗糖尿病大鼠下肢缺血
16只正常成年雄SD大鼠随机分成两组(PBS对照组、hUSCs组)，每组8只，对所有大鼠单次腹腔注射链脲霉素(Streptozotocin，STZ)60mg/kg剂量后1周，血糖值大于16mmol/L时被认定为糖尿病大鼠模型。
糖尿病大鼠建模12周后，用2％戊巴比妥纳腹腔注射麻醉大鼠，选左侧腹股沟中点向膝部作一个长度约2cm的纵行切口，紧贴腹股沟下方小心剥离出股动脉主干，用5/0的带针缝合线在近心端处结扎左下肢股动脉两道，再远心端间隔1cm处结扎两道，用眼科剪在剪断结扎线间血管，造成糖尿病大鼠下肢缺血模型，待苏醒两小时后再麻醉用激光多普勒血流仪(moorLDI2，英国moor instruments公司)评价结扎效果，保证每只大鼠模型都成功。
分离培养的hUSCs进行扩增，按每只大鼠2×106个细胞重悬于1mL的PBS中，用1mL注射器进行结扎缺血肢的腓肠肌肉多点方式注射细胞，每点注射单个核细胞悬液0.2mL，点与点间隔0.25cm，共注射5个点左右。如果有局部溃疡或坏死，则在溃疡或坏死周边组织进行点状注射。所有实验大鼠每3-7天用激光多普勒血流仪检测侧枝循环建立血流恢复情况，观察28天。
实验结果显示，相对PBS组血流灌注效果显著，hUSCs移植组能显著促进糖尿病大鼠缺血下肢的血流灌注恢复，促进缺血组织的血管新生和侧枝循环的建立，使缺血组织得到有效改善，进一步证明hUSCs可作为细胞治疗的种子细胞，可用于糖尿病引起的远端血管闭塞、糖尿病足等临床治疗(图7A，7B)。
Claims (10)
1.一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
(1)尿源性细胞的分离
将获取的人尿液样品进行离心，沉淀用PBS洗1-3遍后，离心，弃上清，用培养液重悬细胞，得到尿源性细胞；
(2)尿源性细胞的原代培养
将得到的尿源性细胞接种于含有培养液的24孔板中，置于细胞培养箱内培养，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得贴壁生长的P0代圆形细胞；
(3)化学小分子诱导重编程获得P1代尿源性多潜能干细胞
选择步骤(2)培养的得到的状态佳的细胞接种于含有培养液的六孔板中，细胞贴壁生长后，采用两步诱导法，第一步，向培养液中添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)诱导培养1-3天；第二步，向含有5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷的培养液中添加3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C进行诱导，每4天换一次诱导培养液，10-14天完成化学小分子诱导细胞重编程，获得贴壁生长的圆形或短梭形且具有无限增殖和多向分化潜能的细胞，即为P1代尿源性多潜能干细胞克隆；
(4)P0代尿源性多潜能干细胞的传代培养
挑选小分子诱导获得的P1代尿源性多潜能干细胞克隆，接种转移至含有培养液的6孔板中继续培养，细胞生长至90％融合转移至含有相同培养液的9cm平皿中进行传代培养，通过连续传代之后，获得呈现长梭形，状态良好的细胞，即为尿源性多潜能干细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的培养液为含有15％FBS的KSFM培养液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的培养液为含有10％FBS、100U/ml青霉素以及100mg/ml链霉素的KSFM培养液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中将得到的细胞按照500个细胞/孔的密度接种于24孔板中，置于37℃，5％CO2及饱和湿度细胞培养箱内培养，接种24h后，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得贴壁生长的圆形细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的培养液为含有5％FBS的KSFM以及EFM按照等体积混合的培养液，所述的诱导培养液为含有3-Deazaneplanocin A(DZNeP)、维生素C以及5％FBS的KSFM以及EFM按照等体积混合的培养液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷使其终浓度达到2-10μmol/L，添加3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C使其终浓度分别达到1-5μmol/L以及10-40μg/ml。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中初次传代时间为6-8天，初次传代后，按照1：3的比例转移至含有相同培养液的9cm平皿中进行传代培养，3-4天传代一次，通过连续传代5-7代之后，获得呈现长梭形，状态良好的细胞，即为尿源性多潜能干细胞，其中所述培养液为含有5％FBS的KSFM以及EFM按照等体积混合的培养液。
8.按照权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的尿源性多潜能干细胞，其特征在于，所述的尿源性多潜能干细胞为表达间质标志CD29、CD44、CD73、CD90和SSEA-4，不表达成熟造血细胞标志CD45及内皮标志CD31和CD133的多潜能干细胞。
9.权利要求8所述的尿源性多潜能干细胞在定向诱导细胞分化中的应用，所述细胞为脂肪细胞，成骨细胞，平滑肌细胞，骨骼肌细胞，神经细胞或成纤维细胞。
10.根据权利要求8所述的尿源性多潜能干细胞在制备治疗糖尿病引起的远端血管闭塞和糖尿病足的药物中的用途。
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