CN108486047A - 一种干细胞提取物的医用敷料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干细胞提取物的医用敷料及其制备方法，属于生物医药领域。本发明的医用敷料是一种效果极佳的创面覆盖物，其有效阻止细菌感染，加速创面愈合，具有良好的生物相容性，控制和吸收创面渗液，透气性强，保护新生组织，无毒副作用等优势；采用天然来源的绿色原料，辅料均达到食用级别，免除解除时流血多及病人的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，为促进皮肤的再生提供一个有利于创面愈合的环境。还可以控制创面渗液、补水保湿、消炎消肿，缓解伤口疼痛及其他不适，防止伤口留下疤痕，不影响皮肤美观。本发明敷料采用冻干的形式，更利于维持敷料中大量细胞因子以及蛋白的活性，并且能在室温条件下存放和运输。

Description

一种干细胞提取物的医用敷料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞提取物的医用敷料及其制备方法，属于生物医药领域。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，起着保护机体的屏障作用，但是却最容易受到创伤，常见的有利器、工具等造成的创伤，属于急性伤口，容易失血感染，侵害真皮层，不但给患者带来痛苦，且容易留下疤痕，影响肌肤美观；其他常见的有擦伤、烧伤、烫伤、冻伤，这种创伤属于慢性伤口，一般会造成软组织挫伤，引起肿痛，常有创面渗液，有可能造成皮肤组织和肌肉中的血管破裂和神经损伤，这种创伤可能比急性伤口更难治愈。因此，皮肤受到创伤，应当及时有效护理，防止留下不必要的后遗症，在这方面，敷料起着重要作用。

一款理想的医用敷料不仅能够迅速止血、贴合创面、消肿止痛，为创面愈合创造一个良好的微环境，具有良好的透气性，阻隔外界异物、微生物污染，并且还需要防患于未然，防止创伤留下疤痕，控制创面渗液，修复损伤的组织、血管及神经，具有良好的吸收性能。然而，现有医用敷料还存在以下一些缺陷：

1、现有技术中医用敷料采用的干细胞主要有胎盘干细胞、脐带干细胞、脂肪干细胞、诱导多能干细胞、皮肤干细胞、造血干细胞；

胎盘脐带来源的干细胞：可能储存时间较长，储存成本高昂，需要一个巨大的干细胞库，长期冻存也影响细胞活性，胎盘干细胞容易受到来自母体疾病的污染，定向分化能力有限；

脂肪干细胞(ADSCs)相对于BMSCs具有一定的局限性，BMSCs可以分化为ADSCs，修复受损组织的能力较弱，ADSCs定向分化能力较弱，一般用于皮下组织的填塞等；

诱导多能干细胞(iPSCs)是指将成熟体细胞重新编程使其具有原始未分化细胞的性状和功能，由于诱导需要使用化学物质或细胞因子来实现，并且iPSCs涉及到基因重组，因此在使用中可能会产生毒性反应；新产生的iPSCs和胚胎干细胞具有类似的特性，但目前为止，iPSCs复杂的调控机制还未被充分阐释，是否具有可靠的临床安全性还是未知，而骨髓间充质干细胞是人体非常自然的细胞；

皮肤干细胞，属于单功能干细胞，它的应用主要在于皮肤病变和创伤，但是对于皮下组织、肌肉组织及其下的血管和神经修复作用较弱，相对具有较大的局限性。皮肤干细胞体外培养相对有难度，分化能力远低于BMSCs。虽然皮肤干细胞可以分化为新的皮肤组织，但是创面伤口愈合是一系列组织复杂协调的过程，皮肤干细胞并不能解决伤口出血、组织渗出液、局部感染、红肿炎症、血管和神经损伤等问题；

造血干细胞只能定向分化为红细胞、白细胞、血小板等，作用于血液系统疾病和血管再生，需要配型配对，否则容易出现MHC、HCG人类白细胞相容抗原的变态反应，受到主体致病因子污染，容易带有毒素。

大量研究表明:干细胞在促进创面愈合时主要通过旁分泌作用(干细胞分泌大量细胞因子)从而抑制创面炎性反应、促进血管生成、改善细胞外基质环境，动员机体自身细胞迁移到损伤部位，达到创面的修复目的。随着干细胞技术的发展，其已应用在组织生长发育、创面愈合和器官再生等多个领域。但是，此前的研究主要是通过收集培养基上清液进行创面治疗，而这种上清液含有的有效活性细胞因子较少，还含有很多外源物质，包括调亡的细胞、细胞碎片，很难稳定保存，易污染，造成很多负面问题，不利于规范化生产制备。现有技术无法最大程度利用干细胞培养物中的活性成分，现有技术提取干细胞分泌的细胞因子，多采用透析法，所得提取物对创面愈合的促进效果也十分有限。

2、现有技术的凝胶敷料多采用干细胞制成的细胞悬液，活性难以维持，干细胞在悬浮状态下，活性降低很快(最佳使用时间为48h内)，其应用具有很大的局限性；而几乎所有的创面损伤都具有突发性、偶然性和不可预料性，这就需要在最短的时间内应用敷料来治疗，等到细胞培养好再制成细胞悬液，已经错过了最佳的治疗时机。即使是使用干细胞悬液制成的创面修复药物，也是通过干细胞分泌细胞因子作用于伤口。

3、现有技术敷料部分技术不使用抗菌剂，使用时容易滋生细菌，造成二次污染，另外一部分技术使用的抗菌剂有银离子、季铵盐等，银离子对人体有一定的副作用，而季铵盐在皮肤非常敏感的时候容易对伤口造成刺激，影响患者使用感受，阻碍创伤快速愈合；且被人体组织吸收后会有一定的副作用。

4、现有技术敷料中使用的凝胶剂主要有明胶、生物活性玻璃，吸收慢，对皮肤的亲和力不够。

5、现有技术敷料不能有效防止肌肤留下疤痕，创面修复后依然需要使用护肤品来淡化疤痕。

6、现有技术敷料对于慢性伤口修复效果不理想，无法有效控制渗出液、修复受损的组织、血管和神经。

发明内容

本发明首先提供了一种骨髓间充质干细胞提取物，包括：干细胞因子(SCF)、集落刺激因子1(SCF1)、白血病抑制因子(LIF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF23)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、重组人纤维连接蛋白(FIBRONECTIN)。

本发明还提供制备所述骨髓间充质干细胞提取物的方法，包括以下步骤：

(1)采集胚胎骨髓，制备细胞悬液，培养至细胞融合达85％以上，进行传代培养，收集第3-5代骨髓间充质干细胞备用；

(2)当骨髓间充质干细胞增殖到第3-5代时，细胞融合达95％以上，采用无酚红的无血清培养基，并添加视黄醇以及麦芽糖，置于二氧化碳培养箱中培养，收集细胞上清液，过滤除杂质；

(3)将过滤好的溶液，超滤浓缩得到超滤液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)采集胚胎骨髓，制备细胞悬液，培养至细胞融合达85％以上，进行传代培养，收集第3-5代骨髓干细胞备用；

(2)当BMSCs增殖到第3-5代时，细胞融合达95％以上，采用无酚红的无血清培养基，并添加1μmol/L视黄醇(维生素A)，以及1μmol/L麦芽糖，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，48小时后，收集细胞上清液，过滤除杂质；

(3)将过滤好的溶液，超滤浓缩得到超滤液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，采集胚胎骨髓，加入10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，混匀、离心去上清，然后用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基制成细胞悬液，以合适的接种量接种于含10％胎牛血清的DMEM-F12培养液中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，24小时后换液，以后每2-3天换液一次，细胞融合达80％以上可以传代，收集第三至五代骨髓干细胞备用。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，当BMSCs增殖到第3-5代时，细胞融合达95％以上，采用无酚红的无血清培养基，并添加1μmol/L视黄醇(维生素A)，以及1μmol/L麦芽糖，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，48小时后，收集细胞上清液，用真空过滤系统过滤除菌及其他杂质。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，将步骤(2)过滤好的溶液，采用超滤浓缩法超滤膜的截留分子量3000kDa。

在本发明的一种实施方式中，还包括将超滤液制备成冻干粉的过程，过程中添加海藻糖作为保护剂。具体地，使用40mM海藻糖作为冻干保护剂，冻存条件可以是：

预冻阶段:设置温度从室温25℃降至设定值-40℃，持续保持维持该温度40-70min；

升华阶段:真空干燥箱内压力控制在0.13-0.3mbar，采用两次升华方式:第一次升华温度从-40℃升至-20℃，此过程保持在60min左右；第二次升华温度从-20℃升至4℃,这个过程持续时间在90min；

解吸阶段:真空箱内压力控制在0.18～0.28mbar,温度在30min内从4℃升温至30℃.随后在30℃维持160min。

本发明还提供一种含有骨髓间充质干细胞提取物的医用敷料，其配方如下：

骨髓间充质干细胞提取物冻干粉，质量分数0.1-0.5％；

胶原蛋白冻干粉，质量分数0.05-0.25％；

其中，干细胞提取物与胶原蛋白的质量比为2:1；

海藻酸钠粉剂，质量分数1-4％；

维生素C粉剂，质量分数5-15％；

生理盐水，质量分数80.25-93.85％。

将各粉剂与生理盐水混合均匀即可制成凝胶状液体，用于敷料。

所述胶原蛋白冻干粉可以来自于动物皮、人胎盘提取、基因重组，本发明提供一种来自于鱼皮的胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

第1步，组织破碎：将鱼皮解冻之后，加入水，物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；

第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液混合，搅拌均匀后浸泡一段时间，离心去除上清，得到第一沉淀；

第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5-9，浸泡一段时间后离心去除上清，得到第二沉淀；

第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2-6％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20-40，酶解温度为35-38℃，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，离心取上清，得到粗提物；

第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂；

第6步，精制处理：第5步的产物盐析，盐析后离心取沉淀，溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤截留液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。

具体地，所述胶原蛋白冻干粉的制备方法，还可以采用以下步骤：

第1步，组织破碎：将鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:1，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，超声波强度控制在500-1000瓦/升，超声波处理时间为30-60min，得到浆料；

第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液(质量浓度5-8％)混合，浆料和氯化钠溶液重量比是1：5，搅拌均匀后浸泡15h，3000rpm，离心20min，去除上清。得到第一沉淀；

第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液(质量浓度是6-10％)混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5，浸泡6-12h，3000rpm，离心20min，去除上清。得到第二沉淀；

第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2-6％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:(20-40)，酶活性为335U/g，酶解温度为35-38℃，反应时间为6-12h，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，用NaOH调节反应体系pH为碱性，即可终止酶反应，3000rpm，离心20min，取上清，得到粗提物；

第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂，粗提物加入到密封高压釜中，一边升温一边用高压泵充入CO₂，温度达到40℃，CO₂压力达到预定的要求，CO₂浓度为0.8g/mL(P＝20MPa)，处理时间10-20min，不仅最大程度降低油脂含量，还达到脱腥、脱色、脱臭的效果，提高了胶原蛋白的纯度，保持了胶原的三螺旋结构；

第6步，精制处理：第5步的产物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.4-0.9mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，用0.4-0.8mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤膜的截留分子量2000kDa。将超滤液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。

冻干步骤：超滤液于冻干机上进行冻存，冻存条件是:

预冻阶段:在常压下，于温度-25至35℃，预冻30-40min；

冻干阶段:在常压下，于温度-40℃，冷冻2-3h。

产品：洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽，胶原蛋白分子量大于2000kDa。

本发明有益效果：

1、本发明采用骨髓间充质干细胞(BMSCs)，BMSCs是来源于骨髓的单胚层多能干细胞，BMSCs在合适条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经样细胞、心肌细胞、支持造血干细胞的基质细胞等多种细胞，BMSCs取材容易，具有支持造血、调节免疫的生理功能以及以下生物学特性：①具有较强的增殖能力，能够自我更新；②具有多向分化潜能，具有明显的可塑性，在体内可以向多种骨髓间充质以外组织迁移定位并分化为相应的组织细胞；③免疫原性微弱，可移植并安全可靠；④具有归巢性，可以作为运载工具定向运送生物制剂来治疗某些疾病。BMSCs进入新环境后，对新环境的调节信号做出反应，分化成与新的生长环境相适应的细胞。本发明使用的BMSCs，来源于已建系的胚胎干细胞，所使用的BMSCs均通过正当途径向国家批准的正规研究院所购买，用于科学实验研究，完全符合社会公德。

2、本发明采用胶原蛋白冻干粉，与干细胞因子配伍，具有非常优秀的协同作用，不但可以增强干细胞因子的活性，延长储存时间，还可以修复伤口，促进受损的皮肤组织，经过发明人大量的实验验证，得出了干细胞提取物与胶原蛋白的最佳质量配比，从而达到最佳的创面修复的效果。

3、本发明使用的超级浓缩维生素C粉，不仅有抗氧化效果，还有天然的抑菌作用，无毒无害无副作用，天然来源，可以被人体吸收。

4、本发明采用的海藻酸钠，不但是可食用级别，提取自海藻，天然绿色，无毒副作用。

5、本发明采用BMSCs提取物与胶原蛋白配伍，并加入维生素C，维生素C不仅有抗炎、抗过敏、抗渗出作用，还可以调节组织间的渗透压、增强机体免疫力。本发明的医用敷料不但可以迅速消肿止痛，对伤口具有良好的止血、消炎的效果，还能防止伤口留下疤痕，不影响患者伤口愈合后的肌肤美观。

6、本发明提供的敷料是一种效果极佳的创面覆盖物，其有效阻止细菌感染，加速创面愈合，具有良好的生物相容性，控制和吸收创面渗液，透气性强，保护新生组织，无毒副作用等优势。

总的来说，本发明提供的干细胞提取物中，富含多种活性因子，共同对创伤起到良好的修复作用，干细胞提取物通过与胶原蛋白、天然有机植物提取物配伍使用，对创面进行修复，实验表明，采用本发明提供的医用敷料，对皮肤炎症、肿胀、破溃、糜烂、溃疡、烧伤、创伤等急性和慢性皮肤疾患及创伤均有良好的缓解愈合作用，对于头面部伤口大约3天创面愈合率可达90％以上，对于四肢及躯干伤口8天创面愈合率可达90％以上，极大提高了皮肤损伤的治愈率和缩短了治疗时间。

附图说明

图1是保存于4℃和-20℃两种条件下冻干粉样品的生物活性测定结果。

图2是蛋白免疫印迹法检测小鼠β-keratin、Wnt和β-catenin基因蛋白表达水平的结果。

具体实施方式

实施例1、制备干细胞提取物

(1)制备BMSCs提取物

将购买的胚胎源BMSCs细胞P4代从液氮冰箱中取出，快速置于37℃水浴锅中摇晃使其融化，将冻存管离心，1500rpm，5min，弃上清，用1ml复苏培养基重悬；

复苏培养基为含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基，细胞计数，以8*10⁵个细胞接种于75cm²培养瓶中，培养瓶中培养基添加至15ml；

将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，24小时后换液(含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基)，以后每2天换液一次，3-5天后，细胞融合达90％以上进行传代；

传代时，先将培养基弃去，用5-10ml PBS清洗两遍，加入2ml 0.05％胰酶进行消化，轻轻摇晃使胰酶铺满瓶底部，显微镜下观察细胞变圆，加入3ml含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化，吹打使细胞完全脱落，收集细胞悬液至离心管中，离心1500rpm，5min，弃上清，用4ml含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬，分别接种于4个新的75cm²培养瓶中，4个培养瓶中培养基添加至15ml；

传代后每2天换液一次，3-5天后，细胞融合达95％以上，将培养基换成无酚红无血清的DF12培养基，并添加1μmol/L视黄醇(维生素A)，以及1μmol/L麦芽糖，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，48小时后，收集细胞上清液，用0.22μm真空过滤系统过滤除菌及其他杂质，过滤好的溶液，采用超滤浓缩法，超滤膜的截留分子量3000kDa。得到的超滤液，4℃过夜。

(2)制备BMSCs提取物冻干粉

次日将超滤液于冻干机上进行冻存，使用的冻干保护剂为40mM海藻糖，冻存条件是:

预冻阶段:设置温度从室温25℃降至设定值-40℃，持续保持维持该温度40-70min；

升华阶段:真空干燥箱内压力控制在0.13-0.3mbar，采用两次升华方式:第一次升华温度从-40℃升至-20℃，此过程保持在60min左右；第二次升华温度从-20℃升至4℃,这个过程持续时间在90min；

解吸阶段:真空箱内压力控制在0.18～0.28mbar,温度在30min内从4℃升温至30℃.随后在30℃维持160min。

得到BMSCs提取物冻干粉，富含活性生长因子。

干细胞冻干粉的活性分析：

实施例1所得到的冻干粉装瓶，西林瓶装，共2瓶，每瓶含有10gBMSCs提取物冻干粉。分别置于4℃和-20℃保存，1、2、3、4、6、7、8、10、12个月(month，简称m)后分别测定其活性。

BMSCs提取物冻干粉活性测定方法：BMSCs提取物中含量最高的细胞因子为EGF，也是创面修复过程中起主要作用的细胞因子之一，不同细胞因子作用有差异但是均为蛋白质，因此不同细胞因子的活性测定方法相似。以下以测定BMSCs提取物冻干粉中EGF活性为例，使用MTT染色法测定EGF的活性：收集对数Balb/c 3T3细胞，重悬于完全培养液中(含有10％FBS的DMEM)，计数，调整细胞浓度为5×10⁵个/mL，接种于96孔板上，每孔100μL，37℃5％CO₂培养24h，吸去上清，加入检测培养液(0.4％FBS DMEM)培养100μL/孔，37℃5％CO₂培养24h；用检测培养液将EGF样品及国家参考品进行系列稀释，吸去96孔板上清，加入100μL/孔已稀释好的样品，每个稀释度做3个重复，置于37℃5％CO₂培养箱培养48h。换液一次，并追加同样浓度的待测EGF(实施例1所得到的冻干粉)，继续培养24h。加入MTT溶液10μL/孔，37℃5％CO₂培养4h，吸去上清，加入DMSO 100μL/孔，震荡5-10min混匀，570nm比色。用Origin 8.0计算其ED₅₀，应用EGF生物活性参照标准品为标准，依上述方法测定样品的ED₅₀，按照药典方法计算得到EGF样品的生物学活性，如表1所示。根据“时间(月份)-吸光值”作图，结果如图1。表2为按照药典方法根据测定的样品的ED₅₀计算得出实施例1所得到的冻干粉保存于4℃和-20℃两种条件下的生物活性。按照剩余活性百分比＝表2中的测定值/起始测定值20000IU/g，计算剩余活性百分比，结果见下表3。

表1

表2为按照药典方法根据测定的样品的ED₅₀计算得出样品的生物活性(IU/g)

表3剩余活性百分比

实验结果分析：样品中的EGF生物活性会随着保存时间的延长而逐步减少。实施例1干细胞提取物冻干粉储存于4℃，在3个月内均能维持良好的活性，3个月后活性开始下降，4个月时，活性剩下70％，8个月时活性仅剩30％，10个月时活性仅剩10％。

实施例1干细胞提取物冻干粉储存于-20℃，在6个月内均能维持良好的活性，6个月后活性开始下降，8个月时，活性剩下60％，12个月时活性仅剩30％。

实施例2、制备胶原蛋白冻干粉

(1)鱼皮胶原蛋白的提取；

第1步，组织破碎：将体重2-3斤的成年娃娃鱼(人工养殖)鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:1，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，超声波强度控制在750瓦/升，超声波处理时间为40min，得到浆料；

第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液(质量浓度5％)混合，浆料和氯化钠溶液重量比是1：5，搅拌均匀后浸泡15h，3000rpm，离心20min，去除上清。得到第一沉淀；

第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液(质量浓度是10％)混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5，浸泡6-12h，3000rpm，离心20min，去除上清。得到第二沉淀；

第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量3％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20，酶活性为335U/g，酶解温度为35-38℃，反应时间为8h，酶解过程中控制反应液pH在5.5，用NaOH调节反应体系pH为碱性，即可终止酶反应，3000rpm，离心20min，取上清，得到粗提物；

第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂，粗提物加入到密封高压釜中，一边升温一边用高压泵充入CO₂，温度达到40℃，CO₂压力达到预定的要求，CO₂浓度为0.8g/mL(P＝20MPa)，处理时间10-min；

第6步，精制处理：第5步的产物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.6mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，用0.5mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤膜的截留分子量2000kDa。

(2)胶原蛋白冻干粉的制备：

将超滤液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。

冻干步骤：超滤液于冻干机上进行冻存，冻存条件是:

预冻阶段:在常压下，于温度-25至35℃，预冻30-40min；

冻干阶段:在常压下，于温度-40℃，冷冻2-3h。

产品：洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽，胶原蛋白分子量大于2000kDa。产率测定：100g鱼皮，最终提取出94g胶原蛋白，纯度达到98％。应用此方法提取出的胶原蛋白，不仅对环境无污染，对人体无毒副作用，蛋白活性高，与人体胶原蛋白结构接近，修复效果也非常好。

实施例3、制备医用敷料

100g医用敷料包含：实施例1制备的骨髓间充质干细胞(BMSCs)提取物冻干粉(质量分数0.2％)，实施例2制备的胶原蛋白冻干粉(质量分数0.1％)；海藻酸钠(质量分数2％)；浓缩维生素C粉(10％)；生理盐水(质量分数87.7％)。

使用时，粉剂和水剂混合均匀即可，10g敷料包含粉剂为20mg BMSCs提取物冻干粉，10mg胶原蛋白冻干粉，0.2g海藻酸钠，1g浓缩维生素C粉，8.77g生理盐水。

10g敷料可以应用于不超过10×10cm²的创面。

实施例4、制备医用敷料

100g医用敷料包含：实施例1制备的骨髓间充质干细胞(BMSCs)提取物冻干粉(质量分数0.5％)，实施例2制备的胶原蛋白冻干粉(质量分数0.25％)；海藻酸钠(质量分数4％)；浓缩维生素C粉(15％)；生理盐水(质量分数80.25％)。

使用时，粉剂和水剂混合均匀即可，10g敷料包含粉剂为50mg BMSCs提取物冻干粉，25mg胶原蛋白冻干粉，0.4g海藻酸钠，1.5g浓缩维生素C粉，8.025g生理盐水。10g敷料可以应用于不超过10×10cm²的创面。

实施例5、制备医用敷料

100g医用敷料包含：实施例1制备骨髓间充质干细胞(BMSCs)提取物冻干粉(质量分数0.1％)，实施例2制备的胶原蛋白冻干粉(质量分数0.05％)；海藻酸钠(质量分数1％)；浓缩维生素C粉(5％)；生理盐水(质量分数93.85％)。

使用时，粉剂和水剂混合均匀即可，10g敷料包含粉剂为10mg BMSCs提取物冻干粉，5mg胶原蛋白冻干粉，0.1g海藻酸钠，0.5g浓缩维生素C粉，9.385g生理盐水。10g敷料可以应用于不超过10×10cm²的创面。

对照例1

与实施例1、2、3的区别在于，BMSCs培养过程中不添加1μmol/L视黄醇(维生素A)和1μmol/L麦芽糖。

对照例2

与实施例1、2、3的区别在于，BMSCs培养过程中添加1μmol/L视黄醇(维生素A)，不添加1μmol/L麦芽糖。

对照例3

与实施例1、2、3的区别在于，BMSCs培养过程中不添加1μmol/L视黄醇(维生素A)，添加1μmol/L麦芽糖。

实施例1及对照例1～3所得提取物中细胞因子含量的比较

将购买的胚胎源BMSCs细胞P4代1支从液氮冰箱中取出，快速置于37℃水浴锅中摇晃使其融化，将冻存管离心，1500rpm，5min，弃上清，用复苏培养基重悬，复苏培养基为含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基，细胞计数，以8*10⁵个细胞接种于75cm²培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，24小时后换液(含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基)，以后每2天换液一次，细胞融合达90％以上进行1:4传代，平均传代至4个75cm²培养瓶中，分别记为①②③④，传代培养基为含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基，每2天换液一次，直到细胞融合达90％以上(约3-7天)，使用如下方法换液：

将①号培养瓶培养基换成无酚红无血清的DF12培养基，添加1μmol/L视黄醇，以及1μmol/L麦芽糖(同实施例1)；

将②号培养瓶培养基换成无酚红无血清的DF12培养基(对照例1)；

将③号培养瓶培养基换成无酚红无血清的DF12培养基，添加1μmol/L视黄醇(对照例2)；

将④号培养瓶培养基换成无酚红无血清的DF12培养基，添加1μmol/L麦芽糖(对照例3)；

将①②③④培养瓶均置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，48小时后，分别收集细胞上清液，用0.22真空过滤系统分别过滤除菌及其他杂质，过滤好的溶液，采用超滤浓缩法分别进行超滤浓缩，超滤膜的截留分子量3000kDa。得到的超滤液分别记为①②③④，4℃过夜。

次日，将超滤液用ELISA试剂盒检测溶液中:SCF、CSF1、LIF、EGF、FGF23、VEGF、PDGF、KGF、FIBRONECTIN含量。结果如下表4：

表4超滤液①②③④中细胞因子的含量(EGF含量单位为μg/mL，其余均为ng/mL)

由表4可以看出，实施例1所获得的干细胞提取物中细胞因子的含量均明显高于对照例1、2、3，培养基添加物视黄醇和麦芽糖可以显著提高干细胞分泌细胞因子的水平。添加视黄醇可以显著增增加CSF1、EGF的产量，添加麦芽糖可以显著增加SCF、EGF的产量，而视黄醇和麦芽糖具有优异的协同作用，这比单独添加其中一个效果好很多。

对照例4

与实施例3的区别在于，医用敷料中使用的BMSCs提取物冻干粉在制备过程中冻干时不使用任何保护剂，其他步骤均相同。

对照例5

与实施例3的区别在于，医用敷料中使用的BMSCs提取物冻干粉在制备过程中冻干时使用40mM的蔗糖作为保护剂，其他步骤均相同。

对照例6

与实施例3的区别在于，医用敷料中BMSCs提取物冻干粉和胶原蛋白冻干粉质量比为1:1，即(质量分数0.2％)和(质量分数0.2％)，其他步骤均相同。

10g敷料包含粉剂为20mg BMSCs提取物冻干粉，20mg胶原蛋白冻干粉，0.2g海藻酸钠，1g浓缩维生素C粉，8.76g生理盐水。

对照例7

与实施例3的区别在于，医用敷料中BMSCs提取物冻干粉和胶原蛋白冻干粉质量比为1:2，即(质量分数0.2％)和(质量分数0.4％)，其他步骤均相同。

10g敷料包含粉剂为20mg BMSCs提取物冻干粉，40mg胶原蛋白冻干粉，0.2g海藻酸钠，1g浓缩维生素C粉，8.76g生理盐水。

实施例1及对照例4、5中BMSCs提取物冻干粉的细胞因子含量的比较

将实施例1、对照例4、对照例5所获得的冻干粉分别记为⑤⑥⑦，对比上述冻干粉，用ELISA试剂盒检测其中:SCF、CSF1、LIF、EGF、FGF23、VEGF、PDGF-CC、KGF、FIBRONECTIN含量，测定保护剂对于冻干粉冻干效果的影响。结果见表5：

表5冻干粉⑤⑥⑦中细胞因子的含量(EGF含量单位为μg/mL，其余均为ng/mL)

由表5可见，实施例1添加了海藻糖作为保护剂、对照例4未添加保护剂、对照例5添加了蔗糖作为保护剂，对比表2和表1，可见海藻糖是一种高效的保护剂，能让细胞因子在冻干过程中最大程度减少损失，而不添加保护剂时，细胞因子会在冻干过程中损耗接近40％，蔗糖也是一种冻干保护剂，但效果明显逊色于海藻糖。

实施例3～5与对照例6、7中敷料的稳定性

实施例3、4、5中BMSCs提取物冻干粉与胶原蛋白冻干粉质量比为2:1，对照例6中BMSCs提取物冻干粉与胶原蛋白冻干粉质量比为1:1，对照例7中BMSCs提取物冻干粉与胶原蛋白冻干粉质量比为1:2。

将实施例3、实施例4、实施例5、对照例6、对照例7中敷料中的粉剂与生理盐水混合均匀后，静置10min。在6个相同的刻度离心管，标记为①-⑥，分别加入实施例3敷料、实施例4敷料、实施例5敷料、对照例6敷料、对照例7敷料、空白敷料(生理盐水)，3000r/min离心30min。弃上层溶液，准确称取沉淀物质量(湿重)，按以下公式计算离心稳定性M，作为敷料稳定性评判指标。

M＝(1-m₁/m₂)*100％

上述公式中：M—离心稳定性，％；m₁—沉淀物质量，g；m₂—离心前溶液的质量，g。

表6：稳定性水平

实验结果分析：实施例3、实施例4、实施例5均选择BMSCs提取物冻干粉与胶原蛋白冻干粉质量比为2:1，获得的敷料具有较好的稳定性。

实施例3～5与对照例6、7中敷料的创面修复效果

1、皮肤创口损伤模型制备及处理

SD雄鼠60只，随机分成六组，经10％水合氯醛麻醉后，背部剃毛，用无菌眼科剪在一侧背部做直径2cm左右的全层皮肤损伤模型。将空白敷料、实施例3、4、5制备的敷料、对照例6敷料、对照例7敷料分别记为①②③④⑤⑥，分别均匀涂抹于六组大鼠创面，模型制备当天记为第1天，分别于1d、2d、4d、6d、8d、10、12d、14d观察创面愈合情况，观察创面渗液吸收情况，并计算创面愈合率。创面愈合率(％)＝(开始创伤面积-未愈合创面面积)/开始创伤面积。在创面完全愈合后观察疤痕留下的情况。

1.1、蛋白免疫印迹法

14d麻醉处死实验大鼠，沿创口周围2mm处剪下创口皮肤全层，取下的组织经研磨、裂解，提取蛋白样品。蛋白浓度测定后，样品经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转至聚偏二氟乙烯膜上。一抗4℃过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(tris bufferedsaline andtween 20,TBST)洗3次，二抗室温1h，化学发光法检测蛋白表达。

1.2、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数土标准差表示，各组向比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、验证结果

2.1创伤应用敷料效果观察

表7：

注：轻度炎症反应在创伤部位表现为红、肿、热、痛；中度炎症反应为化脓，血管扩张，血浆及血液成分渗出到组织内；重度炎症反应为包括上述两种情况且组织发黑坏死。

2.2大鼠创口愈合过程

六组实验大鼠1-14d时创面愈合率比较比较，结果见表8：

表8

实施例3、4、5组大鼠愈合明显较其他组快，本发明制成的医用敷料可以显著促进大鼠创口愈合，4和10d大鼠创面愈合率分别为(90.464±1.738)％和(96.061±0.918)％，均明显高于其他组，经用单因素方差分析，差异有统计学意义(P＝0.000)。

2.3蛋白免疫印迹法

由图2可以看出，使用实施例3、4、5制备的敷料的小鼠β-keratin、Wnt和β-catenin基因蛋白表达水平高于其他组。

实施例3～5与对照例6、7中敷料的抑菌能力测试

取实施例3、4、5，对照例6、7制备的敷料各10g用于抑菌圈试验：

(1)将粪肠球菌ATCC29212在LB固体平板上划线，37℃培养过夜。

(2)挑取单菌落，接种于3-5mL的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养过夜。

(3)按1-2％的体积比率将培养过夜的菌液接种于适量的LB液体培养基中，37℃、280r/min振荡培养3h左右，当OD₆₀₀＝0.6-0.8时，进行抑菌试验。

(4)将LB固体培养基加热融化，当培养基温度降至45℃左右时，将对数期的粪肠球菌ATCC29212按2％的接种量与LB培养基混匀，倾倒平板，待平板凝固后放入4℃冰箱中冷却保存。用2.7mm直径打孔器打孔，每孔注入10μL实施例3、4、5及对照例6、7制备得到的敷料，对照孔加入无菌水。每处理重复3次，倒置培养皿，37℃培养过夜。根据抑菌圈大小计算抗菌率，具体结果如下表9所示。

表9不同敷料对粪肠球菌ATCC29212的抗菌效果

由上表可知，本发明敷料对伤口感染常见的粪肠球菌ATCC29212的抗菌率均在99％以上，高于对照例6和对照例7。由此可见，本发明敷料还具有显著的抗菌效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备骨髓间充质干细胞提取物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集胚胎骨髓，制备细胞悬液，培养至细胞融合达85％以上，进行传代培养，收集第3-5代骨髓间充质干细胞备用；

(2)当骨髓间充质干细胞增殖到第3-5代时，采用无酚红的无血清培养基，培养一定时间，并添加视黄醇以及麦芽糖，置于二氧化碳培养箱中培养，收集细胞上清液，过滤除杂质；

(3)将过滤好的溶液，超滤浓缩得到超滤液。

2.根据权利要求1所述的一种制备骨髓间充质干细胞提取物的方法，其特征在于，步骤(1)中，采集胚胎骨髓，加入10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，混匀、离心去上清，然后用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基制成细胞悬液，以合适的接种量接种于含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基中，置于二氧化碳培养箱中培养，细胞融合达85％以上可以传代，收集第三至五代骨髓干细胞备用。

3.根据权利要求1或2所述的一种制备骨髓间充质干细胞提取物的方法，其特征在于，步骤(2)中，当骨髓间充质干细胞增殖到第3-5代时，采用无酚红的无血清培养基，并添加1μmol/L视黄醇，以及1μmol/L麦芽糖，置于5％二氧化碳培养箱中37℃培养，48小时后，收集细胞上清液，用真空过滤系统过滤除菌及其他杂质。

4.根据权利要求1～3任一所述的一种制备骨髓间充质干细胞提取物的方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤(2)过滤好的溶液，采用超滤浓缩法超滤膜的截留分子量3000kDa。

5.根据权利要求1～4任一所述的一种制备骨髓间充质干细胞提取物的方法，其特征在于，还包括将超滤液制备成冻干粉的过程，过程中添加海藻糖作为保护剂。

6.根据权利要求5所述的一种制备骨髓间充质干细胞提取物的方法，其特征在于，使用40mM海藻糖作为冻干保护剂。

7.根据权利要求1～6任一所述方法制备得到的骨髓间充质干细胞提取物。

8.一种医用敷料，其特征在于，含有权利要求7所述的骨髓间充质干细胞提取物。

9.根据权利要求8所述的一种医用敷料，其特征在于，配方为：

骨髓间充质干细胞提取物冻干粉，质量分数0.1-0.5％；

胶原蛋白冻干粉，质量分数0.05-0.25％；

其中，干细胞提取物与胶原蛋白的质量比为2:1；

海藻酸钠粉剂，质量分数1-4％；

维生素C粉剂，质量分数5-15％；

生理盐水，质量分数80.25-93.85％；

将各粉剂与生理盐水混合均匀即可制成凝胶状液体，用于敷料。

10.根据权利要求9所述的一种医用敷料，所述胶原蛋白冻干粉的制备方法包括以下步骤：

第1步，组织破碎：将鱼皮解冻之后，加入水，物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；

第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液混合，搅拌均匀后浸泡一段时间，离心去除上清，得到第一沉淀；

第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5-9，浸泡一段时间后离心去除上清，得到第二沉淀；

第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2-6％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20-40，酶解温度为35-38℃，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，离心取上清，得到粗提物；

第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂；

第6步，精制处理：第5步的产物盐析，盐析后离心取沉淀，溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤截留液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。