CN116445401B - 间充质干细胞培养基、干细胞外泌体及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种间充质干细胞培养基、干细胞外泌体及制备方法，属于干细胞外泌体技术领域。间充质干细胞培养基包括第一上清液以及第一培养基；第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的50‑70%；第一培养基为无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基；第一上清液为第二上清液依次经过去除细胞处理和除菌处理后所得的液相；第二上清液为采用第二培养基培养间充质干细胞时收集的培养上清液；第二培养基含有无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。本申请提供的培养基不仅可提高间充质干细胞的贴壁率和增殖率，间充质干细胞的表面标志物的表达情况更佳，也可促进间充质干细胞分泌更多的干细胞外泌体。
Description
技术领域
本申请涉及干细胞外泌体技术领域，具体而言，涉及一种间充质干细胞培养基、干细胞外泌体及制备方法。
背景技术
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。间充质干细胞可应用于临床治疗多种血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复以及自身免疫性疾病等，具有良好的发展应用前景。
间充质干细胞可以分泌干细胞外泌体，间充质干细胞分泌的干细胞外泌体含有可溶性蛋白（如生长因子、白介素、趋化因子、抗体、酶、黏附分子、受体、激素以及抗菌肽等）、游离核酸以及生物活性脂质等“有效成分”，可起到免疫调节、抗凋亡、抗纤维化、心血管调节以及促进组织再生等功能，也具有良好的应用前景。
现有的培养间充质干细胞的培养基一般为间充质干细胞完全培养基（含有血清和酚红），间充质干细胞完全培养基一般包括α-MEM基础培养基、血替（或胎牛血清）及其他营养成分组成。但是现有的用于培养间充质干细胞的培养基在对间充质干细胞进行培养时，间充质干细胞的贴壁率和增殖能力等方面依旧存在提升的瓶颈，因此需要一种更适用于培养间充质干细胞的培养基。
此外，现有的干细胞外泌体的制备一般是从间充质干细胞的培养上清中分离获得。但是，现有的培养间充质干细胞的培养工艺获得的干细胞外泌体的产量较少，不利于干细胞外泌体的工业化生产和进一步应用。
发明内容
本申请提供一种间充质干细胞培养基、干细胞外泌体及制备方法，其旨在提供一种更适用于培养间充质干细胞的培养基，以及可促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体的培养基。
第一方面，本申请提供一种间充质干细胞培养基，间充质干细胞培养基包括：第一上清液以及第一培养基；其中，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的50-70%。第一培养基为无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。第一上清液为第二上清液依次经过去除细胞处理和除菌处理后所得的液相；第二上清液为采用第二培养基培养间充质干细胞时收集的培养上清液；第二培养基含有无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。
本申请通过将特定的第一培养基与第一上清液（采用第二培养基培养间充质干细胞时的培养上清液）在特定的比例下复配，得到间充质干细胞培养基。相比于现有技术中的用于培养间充质干细胞的完全培养基，采用本申请提供的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞时，不仅可提高间充质干细胞的细胞贴壁率以及细胞增殖率，还可以使得培养的间充质干细胞的形态更佳且间充质干细胞的表面标志物的表达情况更佳，因而更适用于培养间充质干细胞。
此外，相比于现有技术中的用于培养间充质干细胞的完全培养基，采用本申请提供的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞时，也可促进间充质干细胞分泌更多的干细胞外泌体，以提高干细胞外泌体的产量，有利于工业化生产干细胞外泌体；也可使得间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态更佳，更有利于干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的55-65%。
第一上清液与第一培养基在上述配比条件下，可在有效降低间充质干细胞培养基的经济成本的基础上，实现相比于现有技术中的间充质干细胞完全培养基的“更适于培养间充质干细胞、提高干细胞外泌体的产量以及间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态更佳”的技术效果。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，第二上清液为采用第二培养基培养间充质干细胞至细胞融合度≥90%时收集的培养上清液；或/和，第二上清液为采用第二培养基培养间充质干细胞至P4或P5代时收集的培养上清液。
上述技术方案，有利于进一步促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体，进而有利于进一步提高干细胞外泌体的产量；同时，也可使得间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态较佳，有利于制得的干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基为无血清无酚红的α-MEM基础培养基。
上述技术方案，有利于进一步促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体，进而有利于进一步提高干细胞外泌体的产量。
结合第一方面，本申请可选的实施方式中，去除细胞处理的步骤包括：于300-400g的离心力下对第二上清液进行离心处理，然后对离心处理后所得的液相依次进行第一过滤处理和第二过滤处理，收集第二过滤处理后的液相；其中，第一过滤处理和第二过滤处理使用的滤孔孔径分别为0.4-0.6μm以及0.1-0.25μm。
上述技术方案，可有效去除第二上清液中游离的完整细胞、细胞凋亡小体以及细胞碎片等物质，更有利于培养间充质干细胞以及提高干细胞外泌体的产量；同时，也可使得间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态较佳，有利于制得的干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
第二方面，本申请提供一种间充质干细胞培养基的制备方法，间充质干细胞培养基的制备方法包括：将第一上清液和第一培养基混合；其中，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的50-70%；第一培养基为无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基；第一上清液的制备方法包括：先采用第二培养基培养间充质干细胞，收集培养上清液，得到第二上清液；然后对第二上清液依次进行去除细胞处理和除菌处理，收集所得的液相即为第一上清液；第二培养基含有无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。
相比于现有技术中的用于培养间充质干细胞的完全培养基，将采用本申请提供的制备方法制得的间充质干细胞培养基用于培养间充质干细胞时，不仅可提高间充质干细胞的细胞贴壁率以及细胞增殖率，还可以使得培养的间充质干细胞的形态更佳且间充质干细胞的表面标志物的表达情况更佳，因而更适用于培养间充质干细胞。
此外，相比于现有技术中的用于培养间充质干细胞的完全培养基，将采用本申请提供的制备方法制得的间充质干细胞培养基用于培养间充质干细胞时，也可促进间充质干细胞分泌更多的干细胞外泌体，以提高干细胞外泌体的产量，有利于工业化生产干细胞外泌体；也可使得间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态更佳，更有利于干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
第三方面，本申请提供一种制备干细胞外泌体的方法，制备干细胞外泌体的方法包括：采用上述第一方面提供的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞，收集采用间充质干细胞培养基培养间充质干细胞时的培养上清液，得到第三上清液；从第三上清液中分离得到干细胞外泌体。
由于本申请提供的制备干细胞外泌体的方法采用上述第一方面提供的间充质干细胞培养基，可促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体，进而可提高制备得到的干细胞外泌体的产量，有利于工业化生产干细胞外泌体；同时，制得的干细胞外泌体的形态更佳，更有利于干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
结合第三方面，本申请可选的实施方式中，分离操作的温度为4-10℃。
上述技术方案中，分离得到干细胞外泌体的操作温度为4-10℃，可抑制第三上清液中酶的活性，有利于避免第三上清液中的酶将蛋白水解成较多的杂质小分子，进而有利于保证干细胞外泌体中有效成分的含量；也有利于避免分离得到的干细胞外泌体发生聚集，干细胞外泌体中的有效成分可以分散均匀，更有利于制得的干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
第四方面，本申请提供一种干细胞外泌体，干细胞外泌体采用上述第三方面提供的制备干细胞外泌体的方法制得。
本申请提供的干细胞外泌体由于采用上述提供的干细胞外泌体的方法制得，干细胞外泌体的形态较佳，有利于干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
第五方面，本申请提供一种培养间充质干细胞的方法，培养间充质干细胞的方法包括：采用上述第一方面提供的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞。
本申请提供的培养间充质干细胞的方法由于采用上述第一方面提供的间充质干细胞培养基，可提高间充质干细胞的细胞贴壁率以及细胞增殖率，还可以使得培养的间充质干细胞的形态较佳且间充质干细胞的表面标志物的表达情况较佳。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请提供的间充质干细胞培养基的制备工艺流程图。
图2为采用本申请实施例1、对比例3以及对比例5-7制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞48h时的细胞状态对比图。
图3为采用本申请实施例1制得的间充质干细胞培养基脐带间充质干细胞获得的干细胞外泌体的电镜图。
图4为采用本申请对比例4制得的间充质干细胞培养基脐带间充质干细胞获得的干细胞外泌体的电镜图。
具体实施方式
本申请提供一种间充质干细胞培养基的制备方法，制备方法包括：将第一上清液和第一培养基混合；其中，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的50-70%。第一培养基为无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。第一上清液的制备方法包括：先采用第二培养基培养间充质干细胞，收集培养上清液，得到第二上清液；然后对第二上清液依次进行去除细胞处理和除菌处理，收集所得的液相；第二培养基含有无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。
本申请通过将特定的第一培养基与第一上清液（采用第二培养基培养间充质干细胞时的培养上清液）在特定的比例下复配，得到间充质干细胞培养基。
相比于现有技术中的用于培养间充质干细胞的完全培养基，本申请提供的间充质干细胞培养基更适用于培养间充质干细胞和制备干细胞外泌体。
可以理解的是，获得第二上清液时培养的间充质干细胞的种类与“第一上清液与第一培养基复配得到的间充质干细胞培养基”要用于培养的间充质干细胞的种类相同；例如，第二上清液为采用第二培养基培养脐带间充质干细胞时收集的培养上清液，后续第一上清液与第一培养基复配得到的间充质干细胞培养基也是要用于培养脐带间充质干细胞的。
图1为本申请提供的间充质干细胞培养基的制备工艺流程图，请参阅图1，间充质干细胞培养基的制备方法包括：
S10，采用第二培养基培养间充质干细胞，收集培养上清液，得到第二上清液；其中，第二培养基含有无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。
在本申请一些可选的实施方式中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）。
作为示例性地，当间充质干细胞为脐带间充质干细胞，使用第二培养基培养脐带间充质干细胞的培养温度为37℃。
需要说明的是，在其他可行的实施方式中，间充质干细胞也可以为脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞等等；此外，对于不同种类的间充质干细胞，使用第二培养基培养间充质干细胞的培养温度为对应种类的间充质干细胞的常规培养温度即可。
在本申请一些可选的实施方式中，无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基为无血清无酚红的α-MEM基础培养基，有利于进一步促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体，进而有利于进一步提高干细胞外泌体的产量。
需要说明的是，在其他可行的实施方式中，无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基也可以为无血清无酚红的OriCell间充质干细胞完全培养基（无血清II型）培养基或无血清无酚红的Opti Vitro MSC增生无血清培养基培养基等。
作为示例性地，第二培养基可以选用商品化的培养基，只要满足第二培养基中含有无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基即可；例如，当间充质干细胞为脐带间充质干细胞时，第二培养基采用体积比为（80-120）：1的友康公司的NC0103型号的培养基与友康公司的NC0103.S型号的培养基复配而成。
在本申请一些可选的实施方式中，第二上清液为采用第二培养基培养间充质干细胞至细胞融合度≥90%时收集的培养上清液；换言之，采用第二培养基培养间充质干细胞，当培养的间充质干细胞至细胞融合度≥90%时收集培养上清液，所收集的培养上清液即为第二上清液。
上述技术方案，有利于进一步促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体，进而有利于进一步提高干细胞外泌体的产量；同时，也可使得间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态较佳，有利于制得的干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
作为示例性地，采用第二培养基培养间充质干细胞，当培养的间充质干细胞至细胞融合度为90%、91%、92%、93%、94%或95%时收集培养上清液，得到第二上清液。
在本申请一些可选的实施方式中，第二上清液为采用第二培养基培养间充质干细胞至P4或P5代时收集的培养上清液；有利于进一步促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体，进而有利于进一步提高干细胞外泌体的产量；同时，也可使得间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态较佳，有利于制得的干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
需要说明的是，在其他可行的实施方式中，第二上清液也可以为采用第二培养基培养间充质干细胞传代2代后收集的培养上清液。
S20，对第二上清液依次进行去除细胞处理和除菌处理，收集所得的液相，得到第一上清液。
需要说明的是，在本申请中，去除细胞处理是指：去除第二上清液中游离的完整细胞、细胞凋亡小体以及细胞碎片等物质；第一上清液是指：对第二上清液进行去除细胞处理后，对去除细胞处理后得到的液相进行除菌处理，除菌处理后所得的液相即为第一上清液。
在本申请一些可选的实施方式中，去除细胞处理的步骤包括：于300-400g的离心力下对第二上清液进行离心处理，然后对离心处理后所得的液相依次进行第一过滤处理和第二过滤处理，收集第二过滤处理后的液相；其中，第一过滤处理和第二过滤处理使用的滤孔孔径分别为0.4-0.6μm以及0.1-0.25μm。
上述技术方案，可有效去除第二上清液中游离的完整细胞、细胞凋亡小体以及细胞碎片等物质，更有利于培养间充质干细胞以及提高干细胞外泌体的产量；同时，也可使得间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态较佳，有利于制得的干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
作为示例性地，对第二上清液进行离心处理的离心力可以为300g、320g、340g、350g、360g、370g和400g中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值；第一过滤处理使用的滤孔孔径可以为0.4μm、0.42μm、0.45μm、0.47μm、0.5μm、0.52μm、0.55μm、0.57μm和0.6μm中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值；第二过滤处理使用的滤孔孔径可以为0.1μm、0.12μm、0.15μm、0.17μm、0.2μm、0.22μm和0.25μm中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
进一步地，对第二上清液进行离心处理的时间为5-10min；作为示例性地，对第二上清液进行离心处理的时间可以为5min、6min、7min、8min、9min和10min中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
作为示例性地，在本申请的实施例中，第一过滤处理和第二过滤处理均采用抽滤装置进行。
作为示例性地，对去除细胞处理后的液相进行除菌处理的操作可以为：在生物安全柜中，用0.1-0.25μm（例如，0.22μm）的无菌滤头对去除细胞处理后的液相过滤至无菌离心管中。
需要说明的是，在其他可行的实施方式中，除菌处理也可以采用其他常规的除菌操作，本申请不进行限定。
S30，将第一上清液和第一培养基混合；其中，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的50-70%，第一培养基为无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。
需要说明的是，本申请不对第一上清液和第一培养基的混合方式进行限定，例如，混合方式可以为超声分散混合或磁力搅拌混合等。
作为示例性地，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的百分数可以为50%、52%、55%、57%、60%、62%、65%、67%和70%的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
进一步地，在本申请一些可选的实施方式中，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的55-65%。第一上清液与第一培养基在上述配比条件下，可在有效降低间充质干细胞培养基的经济成本的基础上，实现相比于现有技术中的间充质干细胞完全培养基“更适于培养间充质干细胞、提高干细胞外泌体的产量以及间充质干细胞分泌的干细胞外泌体的形态更佳”的技术效果。
在本申请一些可选的实施方式中，无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基为无血清无酚红的α-MEM基础培养基，有利于进一步促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体，进而有利于进一步提高干细胞外泌体的产量。
需要说明的是，在其他可行的实施方式中，无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基也可以为无血清无酚红的OriCell间充质干细胞完全培养基（无血清II型）培养基或无血清无酚红的Opti Vitro MSC增生无血清培养基培养基等。
本申请还提供一种间充质干细胞培养基，间充质干细胞培养基包括：第一上清液以及第一培养基；其中，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的50-70%。第一培养基为无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。第一上清液为第二上清液依次经过去除细胞处理和除菌处理后所得的液相；第二上清液为采用第二培养基培养间充质干细胞时收集的培养上清液；第二培养基含有无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基。
本申请还提供一种制备干细胞外泌体的方法，制备方法包括：采用上述提供的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞，收集采用间充质干细胞培养基培养间充质干细胞时的培养上清液，得到第三上清液；从第三上清液中分离得到干细胞外泌体。
由于本申请提供的制备干细胞外泌体的方法采用上述提供的间充质干细胞培养基，可促进间充质干细胞分泌干细胞外泌体，进而可提高制备得到的干细胞外泌体的产量，有利于工业化生产干细胞外泌体；同时，制得的干细胞外泌体的形态更佳，更有利于干细胞外泌体在应用（例如，用于护肤领域等）时充分发挥其功效。
需要说明的是，若分离后得到的干细胞外泌体需较短期保存（即1天内），则于2-8℃下保存备用即可；若分离后得到的干细胞外泌体需短期保存（即3天内），则于-20℃下保存备用即可；若分离后得到的干细胞外泌体需长期保存（大于3天），则需于-80℃下保存备用。
进一步地，分离操作的温度为4-10℃；可抑制第三上清液（即待分离得到干细胞外泌体的体系）中酶的活性，有利于避免第三上清液中的酶将蛋白水解成较多的杂质小分子，进而有利于保证干细胞外泌体中有效成分的含量；也有利于避免分离得到的干细胞外泌体发生聚集，干细胞外泌体中的有效成分可以分散均匀，更有利于制得的干细胞外泌体在应用时充分发挥其功效。
作为示例性地，分离操作的温度可以为4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃和10℃中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
需要说明的是，本申请不对从第三上清液中分离干细胞外泌体的步骤进行限定，例如，从第三上清液中分离得到干细胞外泌体的分离方式可以超高速离心分离或者切向流过滤等分离方式。
作为示例性地，当从第三上清液中分离得到干细胞外泌体的分离方式为超高速离心分离时，于4-10℃（例如，4℃）下，先对第三上清液进行1500-2500g（例如，2000g）离心20-40min（例如，30min），得到第一滤液；对第一滤液进行11000-13000g（例如，12000g）离心20-40min（例如，30min），得到第二滤液；然后对第二滤液进行0.1-0.25μm（例如，0.22μm）的滤孔孔径过滤，得到第三滤液；最后对第三滤液进行45000-55000g（例如，50000g）离心20-40min（例如，30min），得到的滤液即为干细胞外泌体。
作为示例性地，当从第三上清液中分离得到干细胞外泌体的分离方式切向流过滤分离时，于4-10℃（例如，4℃）下，将比例为1g：150-250mL（例如，1g：200mL）的医用级活性炭与第三上清液混合后，静置5-15min（例如，10min）；真空抽滤后，得到第一滤液；对第一滤液进行0.4-0.6μm（例如，0.45μm）的滤孔孔径过滤，得到第二滤液；对第二滤液进行0.1-0.25μm（例如，0.22μm）的滤孔孔径过滤，得到第三滤液；对第三滤液进行切向膜包过滤，得到的滤液即为干细胞外泌体。
本申请还提供一种干细胞外泌体，干细胞外泌体采用上述提供的制备干细胞外泌体的方法制得。
本申请提供的干细胞外泌体由于采用上述提供的干细胞外泌体的方法制得，干细胞外泌体的形态较佳，有利于干细胞外泌体在应用（例如，用于护肤领域等）时充分发挥其功效。
此外，本申请还提供一种培养间充质干细胞的方法，包括：采用上述提供的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞。
本申请提供的培养间充质干细胞的方法由于采用上述提供的间充质干细胞培养基，可提高间充质干细胞的细胞贴壁率以及细胞增殖率，还可以使得培养的间充质干细胞的形态较佳且间充质干细胞的表面标志物的表达情况较佳；相比于现有技术中的用于培养间充质干细胞的间充质干细胞完全培养基，更适用于培养间充质干细胞。
在本申请一些可选的实施方式中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
作为示例性地，当间充质干细胞为脐带间充质干细胞，使用本申请上述提供的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞的培养温度为37℃。
需要说明的是，在其他可行的实施方式中，间充质干细胞也可以为脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞等等；此外，对于不同种类的间充质干细胞，使用本申请上述提供的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞的培养温度为对应种类的间充质干细胞的常规培养温度即可。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种间充质干细胞培养基，包括如下步骤制备：
（1）复苏P3代脐带间充质干细胞，根据计数结果，按照6000个细胞/cm2接种于T150细胞培养瓶中，并用脐带间充质干细胞完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养70h至脐带间充质干细胞的融合度为95%，以准备收获P4代脐带间充质干细胞。
其中，脐带间充质干细胞完全培养基中含有：有血清有酚红的α-MEM培养基、血替以及L-Gul，且血替的质量以及L-谷氨酰胺（L-Gul）的质量分别占有血清有酚红的α-MEM培养基的质量的5%以及1%。
（2）弃去步骤（1）培养70h后的T150细胞培养瓶中的上清液，进行三次洗涤。
其中，第一次洗涤：用移液管向T150细胞培养瓶中加入10mL的生理盐水，并用10mL移液管轻柔冲洗细胞培养面，倒掉生理盐水。
第二次洗涤：用移液管向T150细胞培养瓶中加入10mL的生理盐水，水平摇晃T150细胞培养瓶清洗细胞培养面，倒掉生理盐水。
第三次洗涤：重复上述第二次洗涤的操作。
（3）向步骤（2）进行三次洗涤后的T150细胞培养瓶中加入2mL胰酶，水平摇晃培养瓶直至胰酶覆盖整个细胞培养面，在显微镜下观察细胞变圆，用手拍打T150细胞培养瓶侧边使细胞掉落，然后向T150细胞培养瓶中加入6mL生理盐水终止消化。离心收集细胞，并用无血清无酚红的第二培养基重悬细胞后，取适量细胞悬液计数。根据计数结果，按照7500个细胞/cm2接种于T150细胞培养瓶，并用第二培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养70h至脐带间充质干细胞的融合度为95%，以准备收获第二上清液及收获P5代脐带间充质干细胞。
其中，第二培养基采用体积比为100：1的友康公司的NC0103型号的培养基与友康公司的NC0103.S型号的培养基复配而成。
（4）收集步骤（3）培养70h后的T150细胞培养瓶中的上清液（即为第二上清液），于350g的离心力下对第二上清液进行离心处理8min，然后使用抽滤装置依次对离心处理后所得的上清液进行第一过滤处理和第二过滤处理，收集第二过滤处理后的液相于离心管中。然后将装有第二过滤处理后的液相的离心管转移至生物安全柜中，用0.22μm的无菌滤头及一次性注射器过滤第二过滤处理后的液相于无菌50mL离心管中，并用无菌封口膜封口备用，得到的上清液即为第一上清液。
其中，第一过滤处理和第二过滤处理使用的滤孔孔径分别为0.45μm以及0.22μm。
（5）将步骤（4）得到的第一上清液与友康公司的NC0103型号的培养基（即第一培养基）混合，得到间充质干细胞培养基。
其中，第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的60%。
实施例2
本实施例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与实施例1的区别在于：第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的50%。
实施例3
本实施例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与实施例1的区别在于：第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的70%。
实施例4
本实施例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与实施例1的区别在于：第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的55%。
实施例5
本实施例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与实施例1的区别在于：第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的65%。
对比例1
本对比例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与实施例1的区别在于：第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的40%。
对比例2
本对比例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例的间充质干细胞培养基为友康公司的NC0103型号的培养基。
对比例3
本对比例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与实施例1的区别在于：步骤（3）至（5）的不同，本对比例的步骤（3）至（5）如下：
（3）向步骤（2）进行三次洗涤后的T150细胞培养瓶中加入2mL胰酶，水平摇晃培养瓶直至胰酶覆盖整个细胞培养面，在显微镜下观察细胞变圆，用手拍打T150细胞培养瓶侧边使细胞掉落，然后向T150细胞培养瓶中加入6mL生理盐水终止消化。离心收集细胞，并用脐带间充质干细胞完全培养基重悬细胞后，取适量细胞悬液计数。根据计数结果，按照7500个细胞/cm2接种于T150细胞培养瓶，并用脐带间充质干细胞完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养70h至脐带间充质干细胞的融合度为95%，以准备收获第二上清液及收获P5代脐带间充质干细胞。
其中，脐带间充质干细胞完全培养基中含有：有血清有酚红的α-MEM培养基、血替以及L-Gul，且血替的质量以及L-谷氨酰胺（L-Gul）的质量分别占有血清有酚红的α-MEM培养基的质量的5%以及1%。
（4）收集步骤（3）培养70h后的T150细胞培养瓶中的上清液（即为第二上清液），将1g的医用级活性炭与200mL的第二上清液混合20min，得到待过滤液相；然后依次对上述得到的待过滤液相进行第一过滤和第二过滤处理，收集第二过滤处理后的液相于离心管中。然后将装有第二过滤处理后的液相的离心管转移至生物安全柜中，用0.22μm的无菌滤头及一次性注射器过滤第二过滤处理后的液相于无菌50mL离心管中，并用无菌封口膜封口备用，得到的上清液即为第一上清液。
其中，第一过滤处理和第二过滤处理使用的滤孔孔径分别为0.45μm以及0.22μm。
（5）将步骤（4）得到的第一上清液与Gibco公司的12561049型号的培养基混合，得到间充质干细胞培养基。
其中，Gibco公司的12561049型号的培养基（记为第一培养基的对照物）为无血清有酚红的α-MEM基础培养基；第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的对照物的总质量的60%。
对比例4
本对比例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例的间充质干细胞培养基为脐带间充质干细胞完全培养基。
其中，脐带间充质干细胞完全培养基中含有：有血清有酚红的α-MEM培养基、血替以及L-Gul，且血替的质量以及L-谷氨酰胺（L-Gul）的质量分别占有血清有酚红的α-MEM培养基的质量的5%以及1%。
对比例5
本对比例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与对比例3的区别在于：第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的40%。
对比例6
本对比例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与对比例3的区别在于：第一上清液的质量占第一上清液与第一培养基的总质量的80%。
对比例7
本对比例提供一种间充质干细胞培养基，本对比例与对比例3的区别在于：本对比例的间充质干细胞培养基为对比例3的第一上清液。
实验例1
采用实施例1与对比例3制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞。其中，培养脐带间充质干细胞的方法如下：
（1）复苏P3代脐带间充质干细胞，根据计数结果，按照6000个细胞/cm2接种于T150细胞培养瓶中，并用脐带间充质干细胞完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养70h至脐带间充质干细胞的融合度为95%，以准备收获P4代脐带间充质干细胞。
其中，脐带间充质干细胞完全培养基中含有：有血清有酚红的α-MEM培养基、血替以及L-Gul，且血替的质量以及L-谷氨酰胺（L-Gul）的质量分别占有血清有酚红的α-MEM培养基的质量的5%以及1%。
（2）弃去步骤（1）培养70h后的T150细胞培养瓶中的上清液，进行三次洗涤。
其中，第一次洗涤：用移液管向T150细胞培养瓶中加入10mL的生理盐水，并用10mL移液管轻柔冲洗细胞培养面，倒掉生理盐水。
第二次洗涤：用移液管向T150细胞培养瓶中加入10mL的生理盐水，水平摇晃T150细胞培养瓶清洗细胞培养面，倒掉生理盐水。
第三次洗涤：重复上述第二次洗涤的操作。
（3）向步骤（2）进行三次洗涤后的T150细胞培养瓶中加入2mL胰酶，水平摇晃培养瓶直至胰酶覆盖整个细胞培养面，在显微镜下观察细胞变圆，用手拍打T150细胞培养瓶侧边使细胞掉落，然后向T150细胞培养瓶中加入6mL生理盐水终止消化。离心收集细胞，并用实施例1或对比例3制得的间充质干细胞培养基分别重悬细胞后，取适量细胞悬液计数。根据计数结果，按照7500个细胞/cm2接种于T150细胞培养瓶，并用实施例1或对比例3制得的间充质干细胞培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养70h至脐带间充质干细胞的融合度为95%，以准备收获P5代脐带间充质干细胞。
分别对采用实施例1与对比例3制得的间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的表面标志物的表达情况进行检测，检测结果如表1所示；其中，脐带间充质干细胞的表面标志物的表达情况的检测方法如下：
收获培养后的脐带间充质干细胞，使用流式细胞仪进行“细胞表面标志物的表达情况”的测试。
表1
表1中，对照组对应的数据是指：收获的P4代脐带间充质干细胞的表面标志物的表达情况，即采用实施例1与对比例3制得的间充质干细胞培养基培养前的脐带间充质干细胞的表面标志物的表达情况；CD105、CD73以及CD44均是阳性指标，HLA-DR、CD11b以及CD14均是阴性指标；阳性指标表达量更高，表示脐带间充质干细胞的表面标志物的表达情况更佳；阴性指标表达量更低，表示脐带间充质干细胞的表面标志物的表达情况更佳。
从表1可以看出，相比于对比例3，采用实施例1制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞时，可使得脐带间充质干细胞的表面标志物的表达情况更佳；表明：相比于对比例3制得的间充质干细胞培养基，实施例1制得的间充质干细胞培养基更适于培养脐带间充质干细胞。
实验例2
采用实施例1与对比例3、对比例5-7制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞，并分别对培养的脐带间充质干细胞48h时的细胞状态进行对比，对比结果如图2所示；其中，图2中的标尺为50μm。
其中，培养脐带间充质干细胞的方法请参阅实验例1，实验例2与实验例1中培养脐带间充质干细胞的方法的不同之处在于步骤（3）的不同；实验例2中培养脐带间充质干细胞的方法中的步骤（3）如下：向步骤（2）进行三次洗涤后的T150细胞培养瓶中加入2mL胰酶，水平摇晃培养瓶直至胰酶覆盖整个细胞培养面，在显微镜下观察细胞变圆，用手拍打T150细胞培养瓶侧边使细胞掉落，然后向T150细胞培养瓶中加入6mL生理盐水终止消化。离心收集细胞，并用实施例1或对比例3、对比例5-7制得的间充质干细胞培养基分别重悬细胞后，取适量细胞悬液计数。根据计数结果，按照2×104个细胞/cm2接种于6孔细胞培养板，每孔2mL的细胞悬液，于37℃、5%CO2培养箱中培养48h。
从图2可以看出，采用对比例3以及对比例5-7制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞48h后，脐带间充质干细胞的细胞形态变大且出现衰老状态；而采用实施例1制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞48h后，脐带间充质干细胞的细胞形态更佳且细胞状态良好（即未出现衰老情况）；表明：相比于对比例3以及对比例5-7，实施例1制得的间充质干细胞培养基更适于培养脐带间充质干细胞。
实验例3
采用实施例1-5与对比例1-7制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞，并分别对培养的脐带间充质干细胞的细胞贴壁率进行对比，对比结果如表2所示。
其中，培养脐带间充质干细胞的方法请参阅实验例1，实验例3与实验例1中培养脐带间充质干细胞的方法的不同之处在于步骤（3）的不同，实验例3中培养脐带间充质干细胞的方法中的步骤（3）如下：向步骤（2）进行三次洗涤后的T150细胞培养瓶中加入2mL胰酶，水平摇晃培养瓶直至胰酶覆盖整个细胞培养面，在显微镜下观察细胞变圆，用手拍打T150细胞培养瓶侧边使细胞掉落，然后向T150细胞培养瓶中加入6mL生理盐水终止消化。离心收集细胞，并用实施例1-5或对比例1-7制得的间充质干细胞培养基分别重悬细胞后，取适量细胞悬液计数。根据计数结果，按照3.5×104个细胞/cm2接种于T25细胞培养瓶，于37℃、5%CO2培养箱中培养12h。
表2
从表2可以看出，相比于对比例1-7，采用实施例1-5制得的间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的细胞贴壁率更高，表明：相比于对比例1-7，实施例1-5制得的间充质干细胞培养基更适于培养脐带间充质干细胞。
从实施例1-5以及对比例1-2的对比可以看出，采用“无血清无酚红的培养基（例如，体积比为100：1的友康公司的NC0103型号的培养基与友康公司的NC0103.S型号的培养基复配而成）培养脐带间充质干细胞获得的培养上清液”与无血清无酚红的培养基（例如，友康公司的NC0103型号的培养基）复配制备的间充质干细胞培养基培养时，当复配的上清液占上清液与培养基的总质量50-70%时，可有效提高脐带间充质干细胞的细胞贴壁率。
从实施例1-5与对比例3-7的对比可以看出，相比于现有技术中的脐带间充质干细胞完全培养基（即对比例4）以及采用“有血清有酚红的培养基培养脐带间充质干细胞获得的培养上清液”与无血清有酚红的α-MEM基础培养基（即Gibco公司的12561049型号的培养基）复配制备的间充质干细胞培养基培养（即对比例3以及对比例5-7），本申请采用“无血清无酚红的培养基（例如，体积比为100：1的友康公司的NC0103型号的培养基与友康公司的NC0103.S型号的培养基复配而成）培养脐带间充质干细胞获得的培养上清液”与无血清无酚红的培养基（例如，友康公司的NC0103型号的培养基）在一定比例内复配制备的间充质干细胞培养基培养，可有效提高脐带间充质干细胞的细胞贴壁率。
实验例4
采用实施例1-5与对比例1、对比例3、对比例5-7制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞，并分别对培养的脐带间充质干细胞的细胞增殖能力进行对比，对比结果如表3所示。
其中，培养脐带间充质干细胞的方法请参阅实验例1，实验例4与实验例1中培养脐带间充质干细胞的方法的不同之处在于步骤（3）的不同，实验例4中培养脐带间充质干细胞的方法中的步骤（3）如下：向步骤（2）进行三次洗涤后的T150细胞培养瓶中加入2mL胰酶，水平摇晃培养瓶直至胰酶覆盖整个细胞培养面，在显微镜下观察细胞变圆，用手拍打T150细胞培养瓶侧边使细胞掉落，然后向T150细胞培养瓶中加入6mL生理盐水终止消化。离心收集细胞，并用实施例1-5与对比例1、对比例3、对比例5-7制得的间充质干细胞培养基分别重悬细胞后，取适量细胞悬液计数。根据计数结果，按照6000个细胞/cm2接种于T25细胞培养瓶，于37℃、5%CO2培养箱中培养70h。
表3
说明：表3中，倍增倍数是指：扩增倍数=收获细胞数/接种细胞数；“/”表示脐带间充质干细胞无法进行增殖，因此没有对应的倍增倍数的数据。
从表3可以看出，采用对比例1、3以及5-7制得的间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞无法进行增殖，而采用实施例1-5制得的间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的增殖能力较佳，表明：相比于对比例1、3以及5-7，实施例1-5制得的间充质干细胞培养基更适于培养脐带间充质干细胞。
从实施例1-5以及对比例1的对比可以看出，采用“无血清无酚红的培养基（例如，体积比为100：1的友康公司的NC0103型号的培养基与友康公司的NC0103.S型号的培养基复配而成）培养脐带间充质干细胞获得的培养上清液”与无血清无酚红的培养基（例如，友康公司的NC0103型号的培养基）复配制备的间充质干细胞培养基培养时，当复配的上清液占上清液与培养基的总质量50-70%时，可有效提高脐带间充质干细胞的增殖能力。
从实施例1-5、对比例3以及对比例5-7的对比可以看出，相比于采用“有血清有酚红的培养基培养脐带间充质干细胞获得的培养上清液”与无血清有酚红的α-MEM基础培养基（即Gibco公司的12561049型号的培养基）复配制备的间充质干细胞培养基培养（即对比例3以及对比例5-7），本申请采用“无血清无酚红的培养基（例如，体积比为100：1的友康公司的NC0103型号的培养基与友康公司的NC0103.S型号的培养基复配而成）培养脐带间充质干细胞获得的培养上清液”与无血清无酚红的培养基（例如，友康公司的NC0103型号的培养基）在一定比例内复配制备的间充质干细胞培养基培养，可有效提高脐带间充质干细胞的增殖能力。
实验例5
采用实施例1-5与对比例1-7制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞，分别收集培养体系中的干细胞外泌体，并分别对收集得到的干细胞外泌体的形态和粒径进行对比。
其中，收集干细胞外泌体的方法如下：
（1）复苏P3代脐带间充质干细胞，根据计数结果，按照6000个细胞/cm2接种于T150细胞培养瓶中，并用脐带间充质干细胞完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养70h至脐带间充质干细胞的融合度为95%，以准备收获P4代脐带间充质干细胞。
其中，脐带间充质干细胞完全培养基中含有：有血清有酚红的α-MEM培养基、血替以及L-Gul，且血替的质量以及L-谷氨酰胺（L-Gul）的质量分别占有血清有酚红的α-MEM培养基的质量的5%以及1%。
（2）弃去步骤（1）培养70h后的T150细胞培养瓶中的上清液，进行三次洗涤。
其中，第一次洗涤：用移液管向T150细胞培养瓶中加入10mL的生理盐水，并用10mL移液管轻柔冲洗细胞培养面，倒掉生理盐水。
第二次洗涤：用移液管向T150细胞培养瓶中加入10mL的生理盐水，水平摇晃T150细胞培养瓶清洗细胞培养面，倒掉生理盐水。
第三次洗涤：重复上述第二次洗涤的操作。
（3）向步骤（2）进行三次洗涤后的T150细胞培养瓶中加入2mL胰酶，水平摇晃培养瓶直至胰酶覆盖整个细胞培养面，在显微镜下观察细胞变圆，用手拍打T150细胞培养瓶侧边使细胞掉落，然后向T150细胞培养瓶中加入6mL生理盐水终止消化。离心收集细胞，并用实施例1-5或对比例1-7制得的间充质干细胞培养基分别重悬细胞后，取适量细胞悬液计数。根据计数结果，按照7500个细胞/cm2接种于T150细胞培养瓶，并用实施例1-5或对比例1-7制得的间充质干细胞培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养70h至脐带间充质干细胞的融合度为95%，以准备收获P5代脐带间充质干细胞和P5代脐带间充质干细胞的培养上清液。
（4）于4℃下，先对步骤（3）收集的培养上清液进行2000g离心30min，得到第一滤液；对第一滤液进行12000g离心30min，得到第二滤液；然后使用抽滤装置对第二滤液进行0.22μm的滤孔孔径过滤，得到第三滤液；最后对第三滤液进行50000g离心30min，得到的滤液即为干细胞外泌体。
分别对采用实施例1和对比例4制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞获得的干细胞外泌体进行透射电镜（TEM）表征，透射电镜图分别如图3和图4所示；其中，图3和图4中的标尺为100nm。
从图3和图4的对比可以看出，相比于现有技术中的脐带间充质干细胞完全培养基（即对比例4），采用实施例1制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞获得的干细胞外泌体，其干细胞外泌体的形态更佳，且干细胞外泌体数量更多；表明相比于现有技术中的脐带间充质干细胞完全培养基（对比例4），采用实施例1制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞时，可以促进脐带间充质干细胞分泌更多的干细胞外泌体，且使得分泌得到的干细胞外泌体的形态更佳。
分别对采用实施例1-5和对比例1-7制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞获得的干细胞外泌体进行粒径和含量检测，结果如表4所示。
表4
说明：表4中，“/”表示：不分泌外泌体，“个数/mL”表示：每mL液相中干细胞外泌体的数量。
从表4可以看出，实施例1-5和对比例1制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞获得的干细胞外泌体的粒径相差不大；但是，相比于对比例1-7（其中，对比例2-3以及对比例5-7不分泌外泌体），采用实施例1-5制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞获得的干细胞外泌体，其单位体积内的干细胞外泌体的数量更多；表明：采用本申请实施例制得的间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞时，可以促进脐带间充质干细胞分泌更多的干细胞外泌体。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
Claims (9)
1.一种间充质干细胞培养基，其特征在于，包括：第一上清液以及第一培养基；其中，所述第一上清液的质量占所述第一上清液与所述第一培养基的总质量的50-70%；
所述第一培养基为无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基；
所述第一上清液为第二上清液依次经过去除细胞处理和除菌处理后所得的液相；所述第二上清液为采用第二培养基培养间充质干细胞时收集的培养上清液；所述第二培养基采用体积比为100：1的友康公司的NC0103型号的培养基与友康公司的NC0103.S型号的培养基复配而成。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述第一上清液的质量占所述第一上清液与所述第一培养基的总质量的55-65%。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述第二上清液为采用所述第二培养基培养间充质干细胞至细胞融合度≥90%时收集的培养上清液；
或/和，所述第二上清液为采用所述第二培养基培养间充质干细胞至P4或P5代时收集的培养上清液。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基为无血清无酚红的α-MEM基础培养基。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述去除细胞处理的步骤包括：于300-400g的离心力下对所述第二上清液进行离心处理，然后对所述离心处理后所得的液相依次进行第一过滤处理和第二过滤处理，收集所述第二过滤处理后的液相；
其中，所述第一过滤处理和所述第二过滤处理使用的滤孔孔径分别为0.4-0.6μm以及0.1-0.25μm。
6.一种间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括：将第一上清液和第一培养基混合；
其中，所述第一上清液的质量占所述第一上清液与所述第一培养基的总质量的50-70%；
所述第一培养基为无血清无酚红的间充质干细胞基础培养基；
所述第一上清液的制备方法包括：先采用第二培养基培养间充质干细胞，收集培养上清液，得到第二上清液；然后对所述第二上清液依次进行去除细胞处理和除菌处理，收集所得的液相即为所述第一上清液；
所述第二培养基采用体积比为100：1的友康公司的NC0103型号的培养基与友康公司的NC0103.S型号的培养基复配而成。
7.一种制备干细胞外泌体的方法，其特征在于，包括：采用如权利要求1-5中任一项所述的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞，收集采用所述间充质干细胞培养基培养间充质干细胞时的培养上清液，得到第三上清液；从所述第三上清液中分离得到所述干细胞外泌体。
8.根据权利要求7所述的制备干细胞外泌体的方法，其特征在于，所述分离操作的温度为4-10℃。
9.一种培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：采用如权利要求1-5中任一项所述的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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