CN103613654A - 大鲵黏液蛋白、制备方法及在化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种大鲵黏液蛋白、制备方法及在化妆品中的应用。大鲵黏液蛋白分子量为17000道尔顿，含两个亚基8500道尔顿，所述亚基含有77个氨基酸残基；N末端为：缬氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苏氨酸-缬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-。该大鲵黏液蛋白质具有凝集血红细胞活性、降低毛细血管通透性以及促进细胞生长等作用，所制备的化妆品，可有效改善皮肤毛细管血管扩张症（俗称红血丝）。

Description

大鲵黏液蛋白、制备方法及在化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及一种大鲵黏液蛋白及制备方法，尤其是一种具有凝集血红细胞特性的大鲵黏液蛋白、制备方法及在化妆品中的应用。
背景技术
大鲵（Andrias davidianus）是我国特有的珍稀特产，属国家二类保护动物。主要分布于长江中上游、珠江中上游及汉水上游的溪流中。随着养殖规模的发展，大鲵资源的精深加工利用成为一个关系大鲵产业持续发展的紧迫课题。大鲵体表无鳞多皮肤腺，在生长过程中不断分泌黏液，内含多种活性物质。 如Guo等人在《Z. Naturforsh》上发表了从大鲵黏液中提取出的磷脂酶A2[Z. Naturforsh, 67c, 86-92(2012)]；王立峰等人从大鲵黏液中分离出抗菌肽（《中国生化药物杂志》，2011年，第34卷第4期，269-272页）；冯叙桥等鉴定了从大鲵黏液中制备的糖肽结构（《食品工业科技》，2012年，第33卷第6期，128-131页）。迄今为止，还没有以大鲵黏液为原料，制备具有凝集血红细胞特性的大鲵黏液蛋白的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种具有凝集血红细胞特性的大鲵黏液蛋白、制备方法及在化妆品中的应用。
本发明的技术解决方案是：一种大鲵黏液蛋白，其特征在于分子量为17 000道尔顿，含两个亚基8500道尔顿，所述亚基含有77个氨基酸残基；N末端为：缬氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苏氨酸-缬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-。
所述大鲵黏液蛋白的氨基酸含量（摩尔/100摩尔）为：天冬氨酸和天冬酰胺4.76%， 苏氨酸7.05%，丝氨酸5.62%，谷氨酰胺和谷氨酸5.25%，脯氨酸9.02%，甘氨酸17.88%，丙氨酸4.83%，缬氨酸7.16%, 异亮氨酸7.14%, 亮氨酸 8.25%，酪氨酸5.26%, 苯丙氨酸 5.27% 组氨酸 1.79%， 精氨酸 2.07%，甲硫氨酸1.,32%，赖氨酸7.22%。
一种上述大鲵黏液蛋白的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：
a. 收集大鲵黏液，将大鲵黏液在0~10℃时进行匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8含有0.15 M NaCl的0.01~0.1M Tris-HCl缓冲液，置于4℃过夜，5000g离心20 min，收集上清；
b.  向所收集上清中加入(NH4)2SO4至80%饱和浓度，静置过夜后，5000g离心20 min，收集沉淀，透析、冻干，得大鲵黏液冻干粉；
c. 用pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl缓冲液溶解大鲵黏液冻干粉，加入到交联的卵黏白蛋白-猪胃黏蛋白（3：1）亲和层析上，先用pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl缓冲液清洗，再用1.5 M NaCl溶液洗脱，收集NaCl洗脱液，透析冻干；
d.将冻干粉溶于pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl冲液中，再加到分子筛层析
Sephadex G-100 (1.8×98cm) 上，收集具有OD280吸收的层析峰，得大鲵黏液蛋白。
一种大鲵黏液蛋白在化妆品中的应用。
所述大鲵黏液蛋白在改善皮肤毛细管血管扩张症化妆品中的应用。
本发明是以大鲵黏液为原料所制备的大鲵黏液蛋白，该大鲵黏液蛋白质具有凝集血红细胞活性、抑制血管内皮生长因子受体I激酶以及促进细胞生长等作用，所制备的化妆品，可降低毛细血管通透性，有效改善皮肤毛细管血管扩张症（俗称红血丝）。
附图说明
图1是本发明实施例的大鲵黏液蛋白SDS聚丙酰胺凝胶电泳图。
图2是本发明实施例的大鲵黏液蛋白凝集血红细胞活性效果图。
图3是本发明实施例的大鲵黏液蛋白抑制血管内皮生长因子受体I激酶的曲线图。
具体实施方式
依次按如下步骤进行：
a. 收集大鲵黏液，将大鲵黏液在0~10℃时进行匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8含有0.15 M NaCl的0.01~0.1M Tris-HCl缓冲液，置于4℃过夜，5000g离心20 min，收集上清；
b.  向所收集上清中加入(NH4)2SO4至80%饱和浓度，静置过夜后，5000g离心20 min，收集沉淀，透析、冻干，得大鲵黏液冻干粉；
c. 用50毫升pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl缓冲液溶解150mg大鲵黏液冻干粉，加入到交联的卵黏白蛋白-猪胃黏蛋白（3：1）亲和层析上，先用pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl缓冲液清洗，再用1.5 M NaCl溶液洗脱，收集NaCl洗脱液，透析冻干；
d.  将冻干粉溶于pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl冲液中，取1.5毫升加到分子筛层析Sephadex G-100 (1.8×98cm) 上，收集具有OD280吸收的层析峰，得5 mg大鲵黏液蛋白（ADL）。可以制成粉剂、片剂和针剂等商品剂型。
SDS聚丙酰胺凝胶电泳如图1所示，图1中1. ADL； 2. 标准分子量蛋白质； 3：加入二硫苏糖醇的ADL。
本发明的大鲵黏液蛋白分子量为 17 000道尔顿，含两个亚基8500道尔顿，每个亚基含有77个氨基酸残基。
经检测该大鲵黏液蛋白的结构，N末端为：缬氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苏氨酸-缬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-。每100摩尔大鲵黏液蛋白氨基酸含量（摩尔/100摩尔）为：天冬氨酸和天冬酰胺4.76%， 苏氨酸7.05%，丝氨酸5.62%，谷氨酰胺和谷氨酸5.25%，脯氨酸9.02%，甘氨酸17.88%，丙氨酸4.83%，缬氨酸7.16%, 异亮氨酸7.14%, 亮氨酸 8.25%，酪氨酸5.26%, 苯丙氨酸 5.27% 组氨酸 1.79%， 精氨酸 2.07%，甲硫氨酸1.,32%，赖氨酸7.22%。
皮肤毛细管血管扩张症（俗称红血丝）是由于毛细血管扩张，皮肤收缩造成的。抑制毛细管血管扩张，可以抑制红血丝的形成。血管内皮生长因子受体I激酶具有促进毛细管血管扩张的作用，抑制该酶即可抑制红血丝的形成。另一方面，促进皮肤细胞生长更新，可以维持毛细血管的正常通透性，改善皮肤毛细管血管扩张症。
实验一：证实大鲵黏液蛋白具有凝集人红细胞（B型）作用
将人红细胞（B型）悬浮于10ml 0.1mol L-1的缓冲液中，加入2 mg胰蛋白酶，在37℃条件下消化3h，然后用0.1mol L-1的缓冲液冲洗3次，再用0.1mol L-1的缓冲液配成体积分数为2%的红细胞悬浮液。在96孔U型板中，将本发明实施例的大鲵黏液蛋白 25μl用0.01mol L-1的缓冲液进行倍比稀释，然后加入到每个孔中，在每个孔中再加入等体积搅动后的体积分数为2%的红细胞悬浮液，30min后目测血凝结果，如图1第一排所示，红细胞之间形成一似网络扩散的红斑块，证明本发明的大鲵黏液蛋白凝集血红细胞活性。第二排为对照组，红细胞没有发生凝集，在“U”型血凝板小孔内沉于孔底形成一界线清晰的红色小点。
实验二：大鲵黏液蛋白抑制血管内皮生长因子受体I激酶的活性
按照庄书斐等报道的方法测定大鲵黏液蛋白抑制血管内皮生长因子受体I激酶的活性（《中国药理学报》，2002年第23期，第117-123页）。
利用96孔板，测试大鲵黏液蛋白抑制血管内皮生长因子受体I激酶（Flt1）活性。Flt1可以磷酸化PolvE4Y（谷氨酸与酪氨酸多肽聚合物），PolvE4Y磷酸化程度可以通过抗磷酸化单克隆抗体PY20识别。将100μl的PolvE4Y溶液（1mg/L，溶于0.02 M 的Tris-HCl缓冲液中，pH7.5，含有0.15M NaCl，TBS）加入到ELISA专用96孔板每一孔中，4℃下放置一夜，弃去上清。加入100μl的Flt1（0.0001M）和100μl本发明所得大鲵黏液蛋白（ADL）溶液，在37℃下孵育1h后，用TBS洗3次后，用5%的BSA封闭30min。用含有0.1%的Tween的TBS冲洗3次后，每孔加入100μl 的PY20（20μg/L），在室温下放置2h。用TBS洗3次后，添加100μl辣根过氧化物酶HRP偶联的抗PY20抗体，在室温下放置1h。用TBS冲洗3次后，加入100μl pH5.5的0.1M柠檬酸缓冲液到每一孔中，该缓冲液含有1.3 mM H2O2以及10mM的O-邻苯二胺。颜色变化后用100μl的1M H2SO4终止反应。于492nm处测定吸光值。以Flt1为阳性对照，不同浓度的大鲵黏液蛋白对血管内皮生长因子受体I激酶（Flt1）的抑制率如图3所示，ADL在20μg/ml浓度下对血管内皮生长因子受体I激酶（Flt1）的抑制率达到80~90%。证明本发明的大鲵黏液蛋白具有非常强的抑制血管内皮生长因子受体I激酶活性。
实验三. 含有ADL的护肤霜对成纤维细胞生长促进活性测定：
本发明所得的大鲵黏液蛋白应用于化妆品中，使用时与现有的化妆品混合即可，也可以在化妆品的基料中掺入含有总重量0.1~1% 的大鲵黏液蛋白制成化妆品，化妆品基料可以是现有的普通化妆品。
1．样品制备
护肤霜为表1所示配方：
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
 （1）含ADL的护肤霜样品制备：即按表1将油相原料和油溶性乳化剂，在不断搅拌下混合加热至80℃，维持20 min灭菌，将水相原料和水溶性乳化剂加入至蒸馏水中，搅拌下加热至80℃，维持20min灭菌，然后冷却，将与护肤霜按质量比为千分之一的ADL缓慢加到水相中搅拌乳化，再将水相加入到油相中，当温度降至45℃时加入香精，继续搅拌冷却，即得含ADL的护肤霜。取0.5g含ADL的护肤霜溶于2.5ml蒸馏水中，10000 rpm离心20 min取上清，经过0.2 μm滤膜过滤，4℃保存。
（2）ADL样品的制备：用水配制2μg/ml的ADL溶液，10000 rpm离心20 min取上清，经过0.2 μm滤膜过滤，4℃保存。
（3）对照样品：取0.5g护肤霜溶于2.5ml蒸馏水中，10000 rpm离心20 min取上清，经过0.2 μm滤膜过滤，4℃保存。
2．样品对成纤维细胞生长促进作用的测定：
成纤维细胞为第10代体外培养的人成纤维细胞。
将数量为5×104 个/ml处于对数生长期的人成纤维细胞100 μl、不同的样品（含ADL的护肤霜样品、ADL样品、对照样品）溶液各2.5ml，并加含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基液至每孔200 μl，在5%CO2的37oC培养箱中培养24h后，加入20 μL MTT（５g/L），再培养4h后，弃去培养基，加入180 μl DMSO，在恒温振荡器上振荡60s后，用酶标仪在570 nm/630 nm波长处检测吸光度。
每个样品溶液设3个平行样。
根据测得的吸光度值计算生长促进率：生长促进率=［（实验组吸光度值–对照组吸光度值）/ 对照组吸光度值］×100%。
结果如表2。
表2 
样品 对照组 含ADL的护肤霜 ADL
成纤维细胞生长促进率（%） 0 57.4 60.9
 结果表明：含有ADL的护肤霜及ADL对人体成纤维细胞具有促生长作用。
实验四：ADL改善皮肤毛细管血管扩张症评价
      按照蒋献等2009年在《临床皮肤科杂志》第38卷第6期上第355-357页上登载的方法，对上述用ADL配置得护肤霜进行改善皮肤毛细管血管扩张症评价。
采用随机开放、自身前后对照试验方法，对30例受试者进行测试。30例患者中女28例，男2例，24～46岁。在首诊日、使用产品后第30天观察疗效评价并记录不良反应。每晚清洁面部后使用含有ADL的护肤霜0.2ml/cm2。
疗效观察指标及评分标准：
皮肤干燥紧绷感、瘙痒的改善标准分4级：明显改善、改善、轻度改善、无改善。明显改善、改善例数合计为改善率。
面部毛细血管扩张的改善标准分为4级，痊愈：毛细血管扩张消退>90%；显效：毛细血管扩张消退60%～90%；有效：毛细血管扩张消退20%～59%；无效：毛细血管扩张消退<20%。痊愈、显效例数合计为有效率。
使用SPSS13.0软件进行相应统计处理与分析，对疗效分析采用卡方检验，无创性评价参数采用重复测量数据的方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。
结果表明，使用上述含有ADL的护肤霜后第30天，受试者皮肤干燥紧绷感、瘙痒评价如表1，受试者面部毛细血管扩张的改善评价如表2。
 表1  
Figure 229268DEST_PATH_IMAGE002
 表2  
Figure 624478DEST_PATH_IMAGE004

Claims (5)

1.一种大鲵黏液蛋白，其特征在于分子量为17 000道尔顿，含两个亚基8500道尔顿，所述亚基含有77个氨基酸残基；N末端为：缬氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苏氨酸-缬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-。
2.根据权利要求1所述的大鲵黏液蛋白，其特征在于：所述大鲵黏液蛋白的氨基酸含量（摩尔/100摩尔）为：天冬氨酸和天冬酰胺4.76%， 苏氨酸7.05%，丝氨酸5.62%，谷氨酰胺和谷氨酸5.25%，脯氨酸9.02%，甘氨酸17.88%，丙氨酸4.83%，缬氨酸7.16%, 异亮氨酸7.14%, 亮氨酸 8.25%，酪氨酸5.26%, 苯丙氨酸 5.27% 组氨酸 1.79%， 精氨酸 2.07%，甲硫氨酸1.,32%，赖氨酸7.22%。
3.一种如权利要求1或2所述大鲵黏液蛋白的制备方法，其特征在于依次
按如下步骤进行：
a. 收集大鲵黏液，将大鲵黏液在0~10℃时进行匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8含有0.15 M NaCl的0.01~0.1M Tris-HCl缓冲液，置于4℃过夜，5000g离心20 min，收集上清；
b. 向所收集上清中加入(NH4)2SO4至80%饱和浓度，静置过夜后，5000g离心20 min，收集沉淀，透析、冻干，得大鲵黏液冻干粉；
c. 用pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl缓冲液溶解大鲵黏液冻干粉，加入到交联的卵黏白蛋白-猪胃黏蛋白亲和层析上，先用pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl缓冲液清洗，再用1.5 M NaCl溶液洗脱，收集NaCl洗脱液，透析冻干；
将冻干粉溶于pH 6-9、0.01-0.1 M Tris-HCl冲液中，再加到分子筛层析Sephadex G-100  上，收集具有OD280吸收的层析峰，得大鲵黏液蛋白。
4.一种大鲵黏液蛋白在化妆品中的应用。
5.根据权利要求4所述大鲵黏液蛋白在制备化妆品中的应用，其特征在于在改善皮肤毛细管血管扩张症化妆品中的应用。
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