CN105709235B

CN105709235B - 一种冻干保护剂及乳胶偶联抗体的冻干方法

Info

Publication number: CN105709235B
Application number: CN201610200646.3A
Authority: CN
Inventors: 郑筱雯; 余嘉陵; 陈明峰
Original assignee: SHENZHEN GOLDSITE DIAGNOSTICS Inc
Current assignee: SHENZHEN GOLDSITE DIAGNOSTICS Inc
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2019-02-26
Anticipated expiration: 2036-03-31
Also published as: CN105709235A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种冻干保护剂及乳胶偶联抗体的冻干方法。本发明提供的冻干保护剂中包括BSA、PEG和PVP。本发明提供的冻干保护剂针对乳胶偶联抗体设计，结合本发明提供的冻干方法，能够保护乳胶偶联抗体在冷冻干燥的过程中，抗体的活性不被破坏。且冻干后复溶的过程中不会发生非特异性聚集，抗体的效价在复溶后也保持稳定。重复多次实验，偏差皆不显著(相对偏差小于±10％)，说明本发明提供的冻干保护剂具有良好的冻干保护效果。

Description

一种冻干保护剂及乳胶偶联抗体的冻干方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种冻干保护剂及乳胶偶联抗体的冻干方法。

背景技术

抗体(antibody,Ab)是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白。除已广泛应用于体外诊断外，抗体越来越多地应用于各种疾病的体内诊断和治疗。目前，利用抗体对疾病进行诊断主要是通过对标志物的检测来完成。标志物的检测方法主要有免疫荧光法、免疫比浊法、酶联免疫吸附法和免疫渗滤法等。将抗体与乳胶微球或乳胶颗粒进行偶联后，微量的抗原便可以使抗体包被的微球产生明显的聚集，故而，乳胶标记的抗体在免疫诊断学方面，特别是在疾病标志物的免疫比浊检查中，有着非常广泛的应用。

为了保证抗体在长期的保存或者运输过程中活性的稳定，通常将其进行冻干处理。但是，由于检测所需的抗体为具有活性的物质，其自身的结构非常复杂，与抗原反应的机制也十分复杂，环境的微小变化、温湿度的变化等均可能引起抗体活性改变，进而影响检测结果。并且，在将抗体与乳胶颗粒或乳胶微球进行偶联后，冻干过程更是需要额外额外考虑乳胶的结构和性质，确保产品复溶后乳胶微球能够分散均匀而非聚集在一起，避免试剂检测空白值偏高。

目前，由于存在复溶后聚集状态不佳等问题，冷冻干燥技术极少应用于修饰乳胶的抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种冻干保护剂及乳胶偶联抗体的冻干方法。本发明提供的冻干保护剂能够保护乳胶偶联的抗体在复溶后不会发生非特异聚集、且抗体效价维持稳定。

本发明提供的冻干保护剂包括BSA、PEG和PVP；其中，BSA、PEG和PVP的质量比为(2～4)：(0.05～0.07)：(2.6～5)。

在一些实施例中，BSA、PEG和PVP的质量比为2:0.07:3.4。

在一些实施例中，BSA、PEG和PVP的质量比为3.2:0.06:2.6。

在一些实施例中，BSA、PEG和PVP的质量比为4:0.05:5。

在一些实施例中，其中还包括糖类；糖类、BSA、PEG和PVP的质量比为(2.6～2.7)：(2～4)：(0.05～0.07)：(2.6～5)。

在一些实施例中，糖类、BSA、PEG和PVP的质量比为2.7:2:0.07:3.4。

在一些实施例中，糖类、BSA、PEG和PVP的质量比为2.7:3.2:0.06:2.6。

在一些实施例中，糖类、BSA、PEG和PVP的质量比为2.6:3.2:0.06:2.6。

在本发明的实施例中，糖类为蔗糖或海藻糖。

冻干保护剂能够防止生物制品在冷冻干燥和贮藏的过程中活性组分发生变性。本发明提供的冻干保护剂中包括BSA、PEG和PVP。其中，BSA为牛血清白蛋白(bovine serumalbumin)，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。BSA能够减轻不利的环境因素或化学因素导致的活性组分的变性。PEG为聚乙二醇(polyethylene glycol)，对生物活性物质的活性具有保护作用。在本发明中，PEG的数均分子量为5500～7500。PVP为聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrrolidone)，在医药工业中有着广泛的应用，能够作为药物的低温保存剂使用。本发明中，PVP为PVP40，其平均分子量为40000。

本发明提供的冻干保护剂中还可以包括一些糖类。糖类物质是生物制品冷冻干燥过程中使用最频繁的冻干保护剂，本发明的冻干保护剂中添加蔗糖或海藻糖能够维持生物活性物质的生物活性。

本发明提供的冻干保护剂针对乳胶偶联抗体设计，能够保护乳胶偶联抗体在冷冻干燥的过程中，抗体的活性不被破坏。且冻干后复溶的过程中不会发生非特异性聚集，抗体的效价在复溶后也保持稳定。重复多次实验，偏差皆不显著(相对偏差小于±10％)，说明本发明提供的冻干保护剂具有良好的冻干保护效果。

本发明提供的冻干保护剂在制备乳胶偶联抗体冻干制剂中的应用。

在本发明中，乳胶偶联抗体中，乳胶为聚苯乙烯乳胶；抗体为C反应蛋白抗体、类风湿因子抗体、抗链球菌溶血素O抗体、胱抑素C抗体、D-二聚体抗体、糖化血红蛋白抗体或β2微球蛋白抗体。

乳胶偶联抗体是将抗体与乳胶微球或乳胶颗粒进行偶联后的产物，本发明中，乳胶偶联抗体中的抗体可为单克隆抗体，也可为多克隆抗体。其获得方式可为自制也可于市场购得。抗体与乳胶偶联的步骤可为自行制备，也可通过商业途径获得，本发明对此不作限定，本发明提供的冻干保护剂皆可对其产生良好的保护作用。在一些实施例中，乳胶偶联抗体为C-反应蛋白乳胶偶联抗体。C-反应蛋白抗体为兔抗人C-反应蛋白抗体。

本发明还提供了一种乳胶偶联抗体的冻干方法，将乳胶偶联抗体与本发明提供的冻干保护剂混合后冻干；冻干的程序为：

在一些实施例中，冻干的程序为：

在本发明的实施例中，乳胶偶联抗体与冻干保护剂混合的质量比为1：(45～65)。

在一些实施例中，乳胶偶联抗体与冻干保护剂混合的质量比为1:61.3。

在一些实施例中，乳胶偶联抗体与冻干保护剂混合的质量比为1:64.2。

在一些实施例中，乳胶偶联抗体与冻干保护剂混合的质量比为1:63.5。

在一些实施例中，乳胶偶联抗体与冻干保护剂混合的质量比为1:45.3。

本发明中，将乳胶偶联抗体的溶液与冻干保护剂溶液混合后，形成待冻干溶液，再进行冷冻干燥。其中，乳胶偶联抗体的溶液中乳胶偶联抗体的质量分数为0.2％；冻干保护剂溶液中冻干保护剂的质量分数为8.17％～9.05％。乳胶偶联抗体溶液与冻干保护剂溶液混合的体积比为1：(1～1.5)。在本发明的实施例中，待冻干溶液的体积为120μL。

在本发明的实施例中，乳胶偶联抗体与冻干保护剂溶解于水中；其中，乳胶偶联抗体的质量分数为0.1％～0.08％，冻干保护剂的质量分数为3.2％～4.6％。

在本发明的实施例中，乳胶偶联抗体中，乳胶为聚苯乙烯乳胶；抗体为C反应蛋白抗体、类风湿因子抗体、抗链球菌溶血素O抗体、胱抑素C抗体、D-二聚体抗体、糖化血红蛋白抗体或β2微球蛋白抗体。

在一些实施例中，乳胶偶联抗体为C-反应蛋白乳胶偶联抗体。C-反应蛋白抗体为兔抗人C-反应蛋白抗体。

在本发明的实施例中，冻干为真空冷冻干燥。

在本发明的实施例中，真空冷冻干燥的干燥仓真空值为1～5Pa。物料最高温度为8～10℃。起始板温为18～25℃。

以本发明提供冻干保护剂和方法，冷冻干燥得到的冻干制剂能够用于样品中目标物质的检测。所述样品为全血、血清、血浆或尿液。所述目标物质为C反应蛋白、类风湿因子、抗链球菌溶血素O、胱抑素C、D-二聚体、糖化血红蛋白含量或β2微球蛋白。所述检测的方法为免疫比浊法。

本发明提供的冻干保护剂中包括BSA、PEG和PVP。本发明提供的冻干保护剂针对乳胶偶联抗体设计，结合本发明提供的冻干方法，能够保护乳胶偶联抗体在冷冻干燥的过程中，抗体的活性不被破坏。且冻干后复溶的过程中不会发生非特异性聚集，抗体的效价在复溶后也保持稳定。重复多次实验，偏差皆不显著(相对偏差小于±10％)，说明本发明提供的冻干保护剂具有良好的冻干保护效果。

具体实施方式

本发明提供了一种冻干保护剂及乳胶偶联抗体的冻干方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的材料、试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1～6

C-反应蛋白胶乳抗体偶联溶液，本次采用质量分数为0.2％兔抗人C反应蛋白乳胶抗体溶液。按照表1方案添加冻干保护剂并实施冻干方案：

表1 实施例1～6

其中，冻干程序1为：

冻干程序2为：

冻干程序3为：

冻干程序4为：

各实施例重复5次，冻干后样品检测复溶后的外观、抗体效价，并进行免疫比浊法鉴定其空白值；同时计算各实施例重复间的重复性。

免疫比浊空白值检测方法：将冻干品用蒸馏水复溶后，按照国赛特定蛋白分析仪Nephstar Plus配套C反应蛋白检测体系，以生理盐水替代病人样本，测试反应光电值初值作为衡量冻干品空白值的指标。

抗体效价检测方法：将冻干品用蒸馏水复溶后，按照国赛特定蛋白分析仪Nephstar Plus配套C反应蛋白检测体系，取浓度为246mg/L的CRP校准品作为样本，测试反应光电值差值作为衡量冻干品效价的指标。

冻干品重复性检测方法：将冻干品用蒸馏水复溶后，按照国赛特定蛋白分析仪Nephstar Plus配套C反应蛋白检测体系，取浓度为157mg/L和20.5mg/L的高低浓度质控品作为样本，将各实施实例冻干品重复测试20次，计算20次的光电值差值CV，评价各实施实例冻干品的瓶间差。结果如表2：

表2 检测结果

如表2：空白值方面：

对照组与实施例1的检测空白值配对分析，P＜0.01，说明二者之间存在显著差异。对照组与实施例2～6的检测空白值配对分析，P＞0.05，说明存在显著性差异。实施例1与实施例2～6的检测空白值配对分析，P＞0.05，说明存在显著差异。

抗体效价方面：

对照组与实施例1的检测效价值配对分析，P＜0.01，说明二者之间存在显著差异。对照组与实施例2～6的检测效价值配对分析，P＞0.05，说明不存在显著差异。实施例1与实施例2～6的检测效价值配对分析，P<0.05，说明存在显著差异。

检测结果结果显示，本申请提供的冻干保护剂能够给予抗体较好的保护，能够使冻干后复溶的抗体保持良好的生物活性，未发生非特异性聚集，抗体效价维持稳定。与采用对照程序(冻干程序1)的实施例1相比，实施例2～6皆取得了良好的实验效果，对抗体的保护效果显著优于实施例1(p<0.05)。

实施例7～12

采用质量分数为0.4％鼠抗人D-二聚体乳胶抗体溶液。按照表2方案添加冻干保护剂并实施冻干方案，干燥控制程序1～4与实施例1～6相同：

表3 实施例7～12

免疫比浊空白值检测方法、抗体效价检测方法、冻干品重复性检测方法，亦与实施例1～6记载相同。

结果如表4：

表4 检测结果

如表4：空白值方面：

对照组与实施例7的检测空白值配对分析，P＜0.01，说明二者之间存在显著差异。对照组与实施例8～12的检测空白值配对分析，P＞0.05，说明存在显著性差异。实施例1与实施例8～12的检测空白值配对分析，P＞0.05，说明存在显著差异。

抗体效价方面：

对照组与实施例7的检测效价值配对分析，P＜0.01，说明二者之间存在显著差异。对照组与实施例8～12的检测效价值配对分析，P＞0.05，说明不存在显著差异。实施例7与实施例8～12的检测效价值配对分析，P<0.05，说明存在显著差异。

结果显示，本申请提供的冻干保护剂能够给予抗体较好的保护，能够使冻干后复溶的抗体保持良好的生物活性，未发生非特异性聚集，抗体效价维持稳定。与采用对照程序(冻干程序1)的实施例7相比，实施例8～12皆取得了良好的实验效果，对抗体的保护效果显著优于实施例7(p<0.05)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.冻干保护剂在制备乳胶偶联抗体冻干制剂中的应用；

所述冻干保护剂包括BSA、PEG、PVP和糖类；

所述糖类、BSA、PEG和PVP的质量比为(2.6～2.7)：(2～4)：(0.05～0.07)：(2.6～5)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳胶偶联抗体中，乳胶为聚苯乙烯乳胶；抗体为C反应蛋白抗体、类风湿因子抗体、抗链球菌溶血素O抗体、胱抑素C抗体、D-二聚体抗体、糖化血红蛋白抗体或β2微球蛋白抗体。

3.一种乳胶偶联抗体的冻干方法，其特征在于，将乳胶偶联抗体与冻干保护剂混合后冻干；

所述冻干保护剂包括BSA、PEG、PVP和糖类；

所述糖类、BSA、PEG和PVP的质量比为(2.6～2.7)：(2～4)：(0.05～0.07)：(2.6～5)；

所述冻干的程序为：

4.根据权利要求3所述的冻干方法，其特征在于，所述乳胶偶联抗体与所述的冻干保护剂混合的质量比为1：(45～65)。

5.根据权利要求3所述的冻干方法，其特征在于，所述乳胶偶联抗体与所述的冻干保护剂溶解于水中；其中，所述乳胶偶联抗体的质量分数为0.1％～0.08％，所述冻干保护剂的质量分数为3.2％～4.6％。

6.根据权利要求3所述的冻干方法，其特征在于，所述乳胶偶联抗体中，乳胶为聚苯乙烯乳胶；抗体为C反应蛋白抗体、类风湿因子抗体、抗链球菌溶血素O抗体、胱抑素C抗体、D-二聚体抗体、糖化血红蛋白抗体或β2微球蛋白抗体。

7.根据权利要求3所述的冻干方法，其特征在于，所述冻干为真空冷冻干燥。