CN114689874B - 用于液体稳定和抗冻融的d-二聚体试剂 - Google Patents

用于液体稳定和抗冻融的d-二聚体试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于液体稳定和抗冻融的D‑二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为10‑100mmol的基础缓冲液、包被D‑二聚体抗体的胶乳颗粒适量、0.1‑5mL表面活性剂、0.5‑10g糖类、20‑150mL多羟基醇、0.01‑0.05g AFP134抗冻蛋白、1‑10g稳定剂、0.5‑1mL防腐剂；且D‑二聚体试剂的pH值为7.0‑8.0。本发明可有效增强D‑二聚体试剂的稳定性，有助于试剂的长期稳定性及运输过程中稳定性，同时可防止冻融过程对试剂性能的影响，大大降低了冬天运输试剂的限制条件；本发明的D‑二聚体试剂可运用于方法学为免疫比浊法的其它项目中，操作简便、测试准确性高、灵敏性强等特定，在临床上应用广泛，适用性强。

Description

用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂
技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术领域，尤其涉及一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂。
背景技术
D-二聚体的定量检测可用来测定具有凝血和纤溶过程异常的疾病，如深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、弥漫性血管内凝血(DIC)等，同时D-二聚体检测可有效反映溶栓治疗效果。这些疾病会造成机体出现高凝状态和纤溶亢进，从而引起D-二聚体水平升高。目前临床上常采用胶乳免疫比浊法、乳胶凝集法、酶连免疫吸附法、胶体金法等方法对D-二聚体进行检测，其中胶乳免疫比浊法是将待检血浆样本中的D-二聚体抗原与包被了D-二聚体单克隆抗体的胶乳颗粒发生抗原抗体反应，产生凝集以致浊度上升，从而引起吸光度的增加，故通过吸光度的变化可反映测试样本中的D-二聚体水平。该方法因操作简便、快速、准确性高、特异性强等优点在临床上被广泛应用。D-二聚体测定试剂盒中常包含缓冲液、试剂等两种组分，其中D-二聚体试剂为包被了D-二聚体单克隆抗体的乳胶微球混悬液。混悬液中存在多种相互作用力，如胶乳微球与胶乳微球、胶乳微球与抗体、抗体与抗体之间的力，其中的相互平衡是维持整个系统稳定的关键，是保证产品性能的重要前提。
然而，D-二聚体试剂在储存过程中会受多方面因素的影响，例如经过冻融后，会破坏胶乳的性能，使试剂体系不稳定，从而影响测试灵敏性，同时也影响到试剂后续的长期稳定性。考虑我国南北地域跨度之大，在冬季运输过程中，因温度较低、零下温度时间过长等情况，会有存在试剂冻融的现象出现，故对试剂的运输带来较大的考验与难度，也对试剂到达客户端后的稳定性带来干扰。综上所述，提供一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂是目前我们亟需解决的问题。
发明内容
在本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中，D-二聚体试剂不能冻融、运输条件严苛，提供一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为10-100mmol的基础缓冲液、包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒 适量、0.1-5mL表面活性剂、0.5-10g糖类、20-150mL多羟基醇、0.01-0.05g AFP134抗冻蛋白、1-10g稳定剂、0.5-1mL防腐剂；且D-二聚体试剂的pH值为7.0-8.0。
优选地，基础缓冲液为HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的至少一种，且其含量为25-65mmol。
优选地，包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒的粒径为100-300nm。
优选地，表面活性剂为吐温20、吐温80、司盘20、司盘40中的至少一种，且其含量为0.5-3.5g。
优选地，糖类为海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种，且其含量为2-6g。
优选地，多羟基醇为丙三醇、甘露醇、山梨醇中的至少一种，且其含量为50-100mL。
优选地，稳定剂为牛血清白蛋白、明胶、小牛血清中的至少一种。
优选地，防腐剂为ProClin 150、ProClin 300、叠氮化钠中的至少一种。
本发明的有益效果：
（1）本发明提出一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，在D-二聚体试剂中添加海藻糖等糖类有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以防止冷冻导致D-二聚体试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况；丙三醇等多羟基醇类有利于包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒均匀地悬浮在基础缓冲液中，不易沉降，有助于保护冷冻后试剂的空间结构；AFP134抗冻蛋白有效达到抗冻融的目的，故有助于试剂的运输及储存稳定性。因此本发明可有效增强D-二聚体试剂的稳定性，有助于试剂的长期稳定性及运输过程中稳定性，同时可防止冻融过程对试剂性能的影响，大大降低了冬天运输试剂的限制条件。
（2）本发明的一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂可运用于方法学为免疫比浊法的其它项目中，操作简便、测试准确性高、灵敏性强等特定，在临床上应用广泛，适用性强。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为10-100mmol的基础缓冲液、包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒 适量、0.1-5mL表面活性剂、0.5-10g糖类、20-150mL多羟基醇、0.01-0.05g AFP134抗冻蛋白、1-10g稳定剂、0.5-1mL防腐剂；且D-二聚体试剂的pH值为7.0-8.0。
其中，基础缓冲液为HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的至少一种，且其含量为25-65mmol。基础缓冲液的pH值为6.0-8.0，优选为6.5-7.5。基础缓冲液具备一定缓冲能力、溶解性高，有很好的生物适应性，pH值随外界影响的改变很小。在D-二聚体试剂的配制过程中，基础缓冲液为胶乳颗粒微球与抗体偶联提供了合适的反应环境。
包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒的粒径为100-300nm，其含量不作限制，根据对试剂灵敏性、线性范围的实际需求适量添加即可。一般来说，优选1L体积的D-二聚体试剂中其含量为4-6mL，其中，10mL乳胶颗粒能与20-200mg D-二聚体抗体偶联（不同粒径的乳胶颗粒所能偶联的抗体含量不同）。D-二聚体试剂为包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒提供保护作用，提高其稳定性。本发明中，最优选1L体积的D-二聚体试剂中其含量为5mL左右。
表面活性剂为吐温20、吐温80、司盘20、司盘40中的至少一种，且其含量为0.5-3.5g。表面活性剂能够吸附在包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒的表面，降低其表面张力，使其不易聚集，有效地提高胶乳颗粒在溶液中稳定性，使其能均匀包被D-二聚体抗体，不团聚。
糖类为海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种，且其含量为2-6g。糖类有利于抑制D-二聚体试剂中的蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致试剂出现沉淀和非特异性聚集，从而保证试剂的储存、运输等稳定性。
多羟基醇为丙三醇、甘露醇、山梨醇中的至少一种，且其含量为50-100mL。多羟基醇可以提高D-二聚体试剂的粘度，有利于试剂中包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒均匀地悬浮在基础缓冲液中，不易发生沉降，从而对D-二聚体试剂起到较好的稳定作用。多羟基醇还可用作防冻剂，能有效降低D-二聚体试剂的凝固点，从而达到较好的抗冻融效果。多羟基醇的添加量与其助悬作用成正比，但当多羟基醇的含量较高时，会使D-二聚体试剂的粘度过高，导致试剂中各组分分布不均匀，从而增大了抗原-抗体反应过程中的混匀难度，不利于二者的充分反应，最终导致测试结果不准确，因此本发明选择含量为50-100mL。
AFP134抗冻蛋白可以吸附在冰晶表面，改变冰晶的生长特性，从而抑制D-二聚体试剂中冰晶的生长，且该蛋白在含量较低时便具有明显地降低试剂冰点和延缓结冰的效果。因此，AFP134抗冻蛋白可有效地起到抗冻融作用，从而使D-二聚体试剂满足稳定性高、运输稳定性好的需求。
稳定剂为牛血清白蛋白、明胶、小牛血清中的至少一种，能够对胶乳颗粒表面交联的D-二聚体抗体起到很好的保护稳定作用。
防腐剂为ProClin 150、ProClin 300、叠氮化钠中的至少一种。
以下通过具体实施例进行说明：
实施例1
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、5g海藻糖、50mL丙三醇、0.02g AFP134抗冻蛋白、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
实施例2
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、2g海藻糖、20mL丙三醇、0.01g AFP134抗冻蛋白、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
实施例3
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、6g海藻糖、150mL丙三醇、0.05g AFP134抗冻蛋白、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
对比例1
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、50mL丙三醇、0.02g AFP134抗冻蛋白、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是没有添加糖类。
对比例2
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、5g海藻糖、0.02g AFP134抗冻蛋白、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是没有添加多羟基醇。
对比例3
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、5g海藻糖、50mL丙三醇、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是没有添加AFP134抗冻蛋白。
对比例4
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是没有添加糖类、多羟基醇、AFP134抗冻蛋白。
对比例5
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、5g海藻糖、100mL丙三醇、0.02g AFP134抗冻蛋白、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是多羟基醇的含量为100mL。
对比例6
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、5g海藻糖、150mL丙三醇、0.02g AFP134抗冻蛋白、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是多羟基醇的含量为150mL。
对比例7
一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为30mmol的HEPES缓冲液、5mL包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒、1.5mL吐温20、5g海藻糖、200mL丙三醇、0.02g AFP134抗冻蛋白、10g牛血清蛋白、1mL ProClin 300，调整试剂的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是多羟基醇的含量为200mL。
可以理解地，在上述实施例及其替换方案中，基础缓冲液还可以替换为HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的至少一种；表面活性剂还可以替换为吐温20、吐温80、司盘20、司盘40中的至少一种；糖类还可以替换为海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种；多羟基醇还可以替换为丙三醇、甘露醇、山梨醇中的至少一种；稳定剂还可以替换为牛血清白蛋白、明胶、小牛血清中的至少一种；防腐剂还可以替换为ProClin 150、ProClin 300、叠氮化钠中的至少一种；D-二聚体试剂的pH值范围为7.0-8.0。
对比试验：
一、含有糖类、多羟基醇、AFP134抗冻蛋白的D-二聚体试剂的冻融试验
试验仪器：深圳市帝迈生物技术有限公司生产的CA520凝血分析仪
试验步骤：以质控品（深圳市帝迈生物技术有限公司D-二聚体高值质控品）为待测样本，使用在-20℃分别冷冻0h、12h、24h及48h后溶解的D-二聚体试剂进行测试，试验步骤如表1所示，试验结果如表2所示。
表1 冻融试验步骤
Figure 245861DEST_PATH_IMAGE001
表2 冻融试验结果
Figure 694160DEST_PATH_IMAGE002
从表2中可知，添加了糖类、多羟基醇、AFP134抗冻蛋白的D-二聚体试剂，其在冷冻48h后的质控品测试结果的相对偏差在±10%内，而分别未添加糖类、多羟基醇、AFP134抗冻蛋白的D-二聚体试剂在冷冻24h后相对偏差均超过±10%，三种组分均未添加的D-二聚体试剂在冷冻12h后相对偏差已超过±10%。此试验结果表明，本发明的D-二聚体试剂具有较好的稳定性和抗冻融性能。
二、不同多羟基醇含量的D-二聚体试剂的冻融试验及重复性试验
1、不同多羟基醇含量的D-二聚体试剂的冻融试验
试验仪器：深圳市帝迈生物技术有限公司生产的CA520凝血分析仪
试验步骤：以质控品（深圳市帝迈生物技术有限公司D-二聚体高值质控品）为待测样本，使用在-20℃分别冷冻0h、12h、24h及48h后溶解的D-二聚体试剂进行测试，试验步骤如表3所示，试验结果如表4所示。
表3 冻融试验步骤
Figure 270635DEST_PATH_IMAGE003
表4 冻融试验结果
Figure 400265DEST_PATH_IMAGE004
2、不同多羟基醇含量的D-二聚体试剂的重复性试验
试验仪器：深圳市帝迈生物技术有限公司生产的CA520凝血分析仪
试验步骤：以质控品（深圳市帝迈生物技术有限公司D-二聚体高值质控品）为待测样本，使用未经过冷冻的D-二聚体试剂进行重复性测试（测试10次），试验步骤如表5所示，试验结果如表6所示。
表5 重复性试验步骤
Figure 496528DEST_PATH_IMAGE005
表6 重复性试验结果
Figure 646887DEST_PATH_IMAGE006
从表4中可得，多羟基醇含量为50-150mL的D-二聚体试剂在-20℃冷冻48h后，其质控品测试结果的相对偏差均在±10%偏差范围内，且在该含量范围内，多羟基醇的含量越大，相对偏差越小。但多羟基醇含量过高会导致试剂的粘稠度增加，抗原与抗体混合不均匀，出现测试结果相对偏差较大的情况。当D-二聚体试剂的多羟基醇含量为200mL时，其在-20℃冷冻24h后测试结果的相对偏差已超过±10%。
从表6中可得，随着多羟基醇含量的增加，D-二聚体试剂的重复性变异系数（CV）也逐渐增大，说明多羟基醇含量越大，D-二聚体试剂的粘稠度越大，对样本与试剂的混匀要求越强，在相同混匀条件下，表现为试剂的重复性越差。该试验结果说明D-二聚体试剂中多羟基醇的含量越多，不利于抗原与抗体的充分反应，最终导致样本的测试结果不准确。
以上试验结果表明，海藻糖等糖类有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以防止冷冻导致D-二聚体试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况。丙三醇等多羟基醇类有利于包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒均匀地悬浮在基础缓冲液中，不易沉降，有助于保护冷冻后试剂的空间结构。此外，表6的试验结果表明，多羟基醇的添加量越多，试剂粘稠度越大，即试剂的重复性与添加量成正比，不利于测试结果的准确性及可靠性。AFP134抗冻蛋白可以有效达到抗冻融的目的，故有助于试剂的运输及储存稳定性。因此，通过添加糖类、多羟基醇、AFP134抗冻蛋白三种组分可达到提高D-二聚体试剂液体稳定性及抗冻融的效果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，其特征在于，以试剂总体积为1L计，包括以下组分：含量为10-100mmol的基础缓冲液、包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒 适量、1.5-5mL表面活性剂、2-6g糖类、50-100mL多羟基醇、0.01-0.05g AFP134抗冻蛋白、1-10g稳定剂、0.5-1mL防腐剂；且所述D-二聚体试剂的pH值为7.0-8.0；所述表面活性剂为吐温20、吐温80、司盘20、司盘40中的至少一种；所述糖类为海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种；所述多羟基醇为丙三醇、甘露醇、山梨醇中的至少一种；所述稳定剂为牛血清白蛋白、明胶、小牛血清中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，其特征在于，所述基础缓冲液为HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的至少一种，且其含量为25-65mmol。
3.根据权利要求1所述的用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，其特征在于，所述包被D-二聚体抗体的胶乳颗粒的粒径为100-300nm。
4.根据权利要求1所述的用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，其特征在于，所述表面活性剂含量为0.5-3.5g。
5.根据权利要求1所述的用于液体稳定和抗冻融的D-二聚体试剂，其特征在于，所述防腐剂为ProClin 150、ProClin 300、叠氮化钠中的至少一种。
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