CN104769429B - 体外诊断装置及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断装置(10)，用于从血液或其组成成分中之一的样本检测红细胞表型抗原和针对该抗原的抗体之间的至少一个反应。其特征在于其包括：基质(12)，和疏水多孔薄膜(14)，厚度为0.05mm到1.5mm之间且其孔的直径为2到30μm之间，所述薄膜包括用于接收所述样本的至少一个亲水反应区域(16)。本发明还涉及在血液免疫学领域使用所述装置。

Description

体外诊断装置及其使用
技术领域
本发明涉及体外诊断装置，其用于从血液或其一种组成成分的样本检测红细胞抗原和专门抵抗这些抗原的抗体之间的反应。
本发明还致力于这种装置对于识别和确定血型的使用。
背景技术
血液免疫诊断的目标是提供或诊断由抗体对红血球的攻击。为此，必要的是具有用于确定在红血球的表面处存在的抗原的工具，其存在或其缺失限定血型，但是还识别血液是否含有针对红血球已知抗原的一个或多个抗体，抗体的存在意味着不相容性的可能。
因此通常的技术包括在红细胞表面处搜索和识别血型抗原的存在或缺失，和/或搜索和识别在血浆中血型抗抗原抗体(anti–antigen antibody)的存在或缺失。
例如，对于ABO系统，Beth–Vincent测试确定通过红血球携带的抗原，且补充的Simonin–Michon测试或血清交叉检验确定血清中流动的抗体。
在Beth–Vincent测试中，个体的红血球与具有已知特性的抗体试剂在一起。通常，在抗体识别相应的红细胞抗原时，该测试通过对红血球凝聚的观察而是可见的。
在Simonin测试中，个体的血浆与红血球测试一起，所述红血球测试每一个属于ABO系统的精确抗原组。这是通过个体血浆的红血球细胞凝聚测试。
对所谓的不规则抗体的搜索检测对抗各种红细胞抗原的免疫球蛋白的个体在血液中的存在或缺失。在自身抗体研究的情况下，在直接测试中直接在个体中搜索已经固定在体内的抗体。在同种抗体搜索的情况下，目标是通过间接的Coombs技术发现在红血球测试上这些免疫球蛋白的固定，其中抗原是已知的。
存在大量过程和装置以用于血液免疫学领域中的表型分析(phenotyping)，但是血型的现有表型分析技术具有许多缺点。
例如微平板技术(Microplating technique)需要离心阶段，随后是搅动步骤。搅动步骤是关键的，因为同时存在于载体上的多种反应不具有相同的再悬浮动力学特征。因此存在解开弱凝聚而不能继续再悬浮的强凝聚的风险。必须在可使检查下执行，且必须特别注意一些试剂的粘合现象。
类似地，在执行通过凝胶测试进行的过滤技术的同时，还存在的风险是，无法检测由于因小凝聚在其进入凝胶时剪切作用而造成的分离造成的ABO血型的血浆测试期间的一些凝聚。
还有，所有这些技术存在一主要缺陷，因为它们需要离心步骤以将红血球移除，或让它们经过凝胶，还需要限流步骤(restricting step)，该步骤增加了大量时间和分析成本且需要使用难以操作的大体积离心器。
免疫过滤方法也是已知的，例如申请EP–2.167.967中描述的，其包括在样本经过带有捕获元素的多孔薄膜时捕获存在于样本中的分析物且通过显示元素(revelationelement)显示其存在。这类装置包括样本的沉淀区域，亲水性多孔薄膜，在所述亲水性多孔薄膜上沉淀捕获试剂且在所述亲水性多孔薄膜下面设置吸收剂薄膜。在样本沉淀区域中执行包括沉淀纯或稀释样本的这类测试，所述样本经过多孔薄膜，以在吸收剂薄膜中完成。在经由毛细作用进入多孔薄膜的这种行进过程中，如果对应于捕获元素的分析物存在于样本中，则后者被捕获试剂固定。此外，必要的是通过能检测捕获区域上分析物存在的显示试剂显示优选分析物的捕获点上的存在，且其带有一种元素，该元素让其能被视觉地检测(被着色产物)或通过物理或化学方法被发现。
但是，该方法具有显著的敏感性和特性问题，因为在样本被沉淀时，其使得多孔薄膜展开和吸收，且许多分析物在多孔薄膜的死亡体积中损失且经过捕获区域以外。对于发现溶液有相同问题。因此必要的是使得吸收系统尺寸过大，以能沉淀要被测试的更大量的样本和发现溶液，防止执行微型化测试，其动力特点被控制，不必接收显示试剂且可被机器人吸液管利用。
试图解决该问题和集中信号，其已经在申请CA1312265或WO02052263中提出，在亲水性多孔薄膜的上方和下方插入疏水结构，其迫使流动经过捕获点。但是，这些装置仍然存在的问题是从点的离心扩散，经过捕获点且不被固定至其的显示元素将能在亲水性多孔薄膜中离心扩散和存储在点的周围。显示元素将随后避免针对所述点的清洗。存在显示元素的返回现象，其形式是通过朝向所述点的向心扩散的返回，使得即使在缺失优选分析物的情况下也能进行点着色。这种现象能非常快速地防止测试读取(通常在5到15分钟之间)，因为会出现假的阳性结果。这是非常有问题的，因为在有疑问、人的错误或信息损失的情况下，这些装置不再随后解读装置。
现有免疫过滤的另一主要问题是运动速度的控制和在一些情况下的预培养(pre–incubation)时间。这些时间是重要的，因为捕获元素和分析物之间的相互作用以及分析物和显示元素之间的相互作用具有特定的动力学特点。这些动力学特点描述了按时间函数执行的反应数量。因此根据捕获试剂/分析物耦合剂和发现/分析物试剂，对于每一个耦合剂，用于获得足够信号的大量相互反应必须被确保。在捕获试剂/分析物之间的相互作用被减慢的情况下，经过薄膜的样本的通过速度必须因此进行调整。在显示元素和分析物之间的相互作用被限制的情况下，必要的是进行预培养，其中显示元素和分析物在捕获点上混合。在没有具体系统的情况下，通过亲水性薄膜是很快的(500μl/min)。
为了控制流动，已经提出了利用活塞，特别是在申请US2008318342中。
为了控制预培养时间，已经在申请WO03016902中提出使用具有两个部分的装置：上部部分，包括样本收集区域和多孔薄膜；和下部部分，包括多孔薄膜和吸收剂薄膜。在最初位置中，这两个块不连通，因为流体不能经由毛细作用传输。在机械处理之后，两个区域接触且流体可经由毛细作用流动。已经提出在疏水薄膜上沉淀捕获元素和通过增加表面活化剂而激励这种通过。
使用机器人难以执行机械方法，因为其需要开发和使用专用系统。在处理期间其还使得专业人员暴露于投射。
在测试被执行时增加表面活化剂以优化系统是非常有害的，因为其在捕获试剂/分析物相互作用方面会显著干扰。还有，在血液免疫的具体情况下，用作显示试剂的红血球不与液体形式的表面活性剂相容，因为红血球的细胞膜溶解且其使得其血红蛋白清空。
描述在EP0334015中的另一方法，包括使用第一薄膜下方的额外薄膜以控制流动，但是所提出的装置无法解决亲水性的多孔薄膜中的显示元素和样本扩散的问题。
现有的血液免疫诊断因此具有许多缺点。
发明内容
此外，本发明目的是通过提供适于通过毛细作用进行体外血液免疫诊断的装置克服现有技术的缺陷，其是可靠、快速、可移动且经济的，制造和使用简单，且能被小型化和自动化，具有很高敏感性。
为了该目标，本发明提出一种用于从血液或其组成成分中之一的样本检测红细胞的表型的抗原和与该抗原相关的抗体之间至少一个反应的体外诊断装置，其特征在于包括：
-支撑件，和
-疏水多孔薄膜，厚度为0.05mm到1.5mm之间且其孔的直径为2到30μm之间，所述薄膜包括用于接收所述样本的至少一个亲水反应区域，所述反应区域的表面比疏水多孔薄膜的表面小。
本发明还涉及该装置的使用，具体说是执行该装置以用于使得红血球的血型显型和检测抗体的过程。
有利地，本发明能解决现有免疫过滤测试的所有缺陷，具体是通过：
-防止负责假的阳性的显示试剂返回
-以使用更低的量来提高敏感性
-系统的小型化和自动化
-反应的动力学机制的控制，而不需要装置的机械处理。
附图说明
从本发明的以下说明可理解本发明的特点和优点，以下说明针对附图通过例子给出，其中：
图1示出了根据本发明的装置的具体实施例的透视图，
图2A示出了根据本发明的装置的疏水多孔薄膜和吸收剂薄膜，其具有亲水反应区域的第一变化例，
图2B示出了根据本发明的装置的疏水多孔薄膜，其具有亲水反应区域的第二变化例，
图3A示出了根据本发明的装置的一部分，具有与图2A所示的变化例对应的疏水多孔薄膜，
图3B示出了根据本发明的装置的一部分，具有与图2B所示的变化例对应的疏水多孔薄膜，
图4A示出了使用根据本发明的装置之后，在图2A所示的疏水多孔薄膜反应区域和下方的吸收剂薄膜的一部分上的获得的结果，和
图4B示出了在使用根据本发明装置之后，在图2B所示的疏水多孔薄膜的反应区域上的获得的结果。
具体实施方式
根据本发明的装置10是用于从血液或其组成成分中之一的样本检测红细胞表型抗原和具体地对抗该抗原的抗体之间的至少一个反应的体外诊断装置。
这是这样一种装置，用于经由毛细作用进行体外诊断，尤其适于体外血液免疫诊断。
红细胞表型抗原或红细胞血型抗原或血型抗原意味着存在于红血球表面的产生免疫性的分子，在需要时能引起抵抗其的抗体的生产和/或允许通过免疫系统识别出红血球的破坏。
红细胞表型抗原和具体地抵抗该抗原的抗体之间的反应在本说明书中是抗原–抗体反应。
血液或其组成成分中之一的样本是总血液或尤其是从红血球部分、白血球部分、血浆或血清中选择的其中一种组成成分。
如图1所示，根据本发明的装置10包括：
-支撑件12，和
-疏水多孔薄膜14，包括目的用于接收被测试的样本的至少一个亲水反应区域16。
多孔薄膜14具有0.05mm到1.5mm的厚度，优选是0.1到1mm，甚至更优选地为0.4到0.8mm。
孔的直径为2到30μm，优选为7到12μm。
疏水多孔薄膜14可包括不被水溶液改变的任何材料。该材料尤其可从通过化学方法改性或不改性的天然聚合物中选择，例如硝化纤维聚合物、纤维素，或从例如聚乙烯、高密度聚乙烯(HDPE)或PVDF这样的氟化聚合物的人工聚合物选择。该材料必须最初是疏水的，其通过足够的处理而变得亲水。这些聚合物可通过能与随后使用的捕获试剂形成关联的试剂组而被功能化或不被功能化。
疏水多孔薄膜14包括至少一个亲水反应区域16。反应区域16具有比疏水多孔薄膜表面14更小的表面，即薄膜14不能是完全亲水的。
多孔薄膜14的亲水反应区域(一个或多个)16优选通过局部增加清洁剂而被制造为亲水的，而没有通过疏水多孔薄膜14的之前化学或物理处理改变多孔基质的化学功能。
清洁剂意味着任何亲水化试剂，其是能使得疏水薄膜14亲水的任何物质。
使用的清洁剂可从天然清洁剂、以化学方法改性或通过化学合成获得的天然清洁剂。优选地，其是非离子的表面活化剂，例如Triton X–100、Tween20或皂素。
清洁剂可在水溶液或例如乙醇这样的有机溶剂中稀释，浓度为0.01到5％。优选地，用于使得薄膜14局部性亲水的清洁剂为0.01到2％(重量/体积)的剂量。
与薄膜的其他特点(特别是多孔性和厚度)相关的、所使用清洁剂的量控制经过薄膜的流体的运动速度。通常公认的是，不需要超过对于TritonX–100的0.1％和对于Tween的0.05％的最大剂量，就能使得用于接收捕获元素的薄膜亲水。但是由于根据本发明的薄膜14的具体特点，能使得该薄膜局部亲水的清洁剂可使用高达2％，尤其是对于Triton X–100或Tween–20，而不会影响区域的反应性，这使得薄膜14的亲水化更容易。
在这些区域不相交的条件下，同一疏水薄膜14可包括若干个亲水反应区域16。
反应区域16可以是所有几何形式，但是优选为直径为0.3mm到20mm的圆点或圆的形式。
反应区域16可在多孔薄膜14的整个厚度上和/或在表面处是亲水的。
反应区域16可具有单一程度的亲水性，如图2A、3A和4A所示。这种构造尤其适于检测要被分析的样本中抗体的具体存在。
根据变化例，反应区域16可包括具有不同亲水程度的几个区域。
如图2B、3B和4B所示，反应区域16可包括两个亲水区域16–1、16–2，与周边16–2处相比，反应区域的中心16–1处具有更大的亲水程度。这些亲水区域优选仅在薄膜14的表面处。
反应区域16还可包括具有不同亲水程度的两个亲水区域，一个是在表面处的，而另一个是沿厚度的。
在反应区域16包括两个亲水区域的情况下，反应区域16已经通过两种不同清洁剂而变得亲水，同时没有通过对多孔薄膜的在先化学或物理处理而改变多孔基质的化学功能。
有利地，具有不同亲水性(特别是在表面处，例如图2B、3B和4B所示)的两个区域的反应区域16的构造对应于输血人员的特别关注点，特别是区别两类人群的任何共存，一个是阳性而另一个是阴性，称为双种群(double population)的现象。该构造尤其适于检测和识别被测试的样本中的具体抗原。
多孔薄膜14的亲水反应区域16可包括捕获试剂。捕获试剂吸收或共价关联到薄膜14。
捕获试剂意思是固定在区域16上的任何化学或生物元素，其能单独地或与显示试剂复合地保持被测试的样本中包含的相关的分析物。
在目标是识别被测试样本中具体抗体的存在时，这些捕获试剂包括具体红细胞表型抗原。它们可以是携带抗原的细胞片段或细胞膜的抗原净化或未净化的空细胞，或不带有抗原或通过合成获得的重组蛋白或抗原。优选地，捕获试剂是没有血红蛋白的红细胞，其带有抗原。
在目标是识别被测试样本中具体抗原的存在时，捕获试剂是抗体。
在存在于反应区域16上时，捕获试剂可与用于使薄膜14亲水以界定出反应区域16的清洁剂同时或在亲水化之后独立于清洁剂沉淀。
捕获试剂可在非变性缓冲剂中沉淀在反应区域16上，所述缓冲剂包括稳定在pH4和pH10之间的pH溶液，优选在pH6.5到pH7.8之间，甚至更优选地在pH7到pH7.5之间。捕获试剂可被吸收或共价关联。
捕获试剂可被增加到佐剂，佐剂目的是维持其微生物稳定性，如叠氮化钠、抗生素，和其构造稳定性，如糖(蔗糖、葡萄糖、海藻糖)，以及执行这些功能的本领域技术人员已知的任何其他试剂。
捕获试剂可存在于整个区域16上或仅一部分上。
清洁剂和/或捕获试剂优选是溶液的形式，其可通过机器人或手动吸液管沉淀。有利地，这些溶液也可容易地使用通过毛细作用保持优选量的针头来沉淀。这些针头可用所有材料制造，但是更具体地用金属材料，且具有或不具有疏水涂层。其端部可以是平坦的或具有确定量的槽。
清洁剂和/或捕获试剂溶液的沉淀必须随后跟随有薄膜的干燥，干燥的周期取决于应用的温度：在室内温度干燥4小时，在37℃至少一个小时。
根据本发明的装置可包括在多孔薄膜14下方的吸收剂薄膜18。该薄膜18吸收在反应区域16的水平处沉淀的液体，其不通过薄膜14保持，特别是当反应区域16在薄膜14的整个厚度上是亲水的时。
薄膜18可包括通过毛细作用进行被动吸收的材料，例如吸收剂纸、纸浆(cellulose)等或用吸收剂聚合物制造。例如，可引述下列产品：
·Millipore C048，C068，C083，C248
·Whatman CF3,CF4,CF10,Grade 470,CF5,CF6,CF7,Grade 900,Grade300
·Ahlstrom Grades 601,642,631,238,237,222,243,320
·Pall Grades 111,113,133,165,197,8975,8964,8301,Ultra
·Cleanis Gelmax superabsorbent pad
·棉花
吸收剂薄膜18的组分和其尺寸必须被选择为其在测试期间可吸收所有的溶液(Vtotal，以μl表示)。每一个薄膜特征在于吸收容量(C，以μl/cm2表示)，薄膜和其尺寸(D，以cm2表示)被选择为满足下列的等式：D>Vtotal/C。
替换地，液体可通过薄膜上方区域和其下方区域之间的压差吸收。例如使用具有部分真空的吸入系统。
薄膜14和可选地薄膜18布置在支撑件12中。
根据本发明的装置10的支撑件12优选是刚性支撑件。其例如可以是壳。
支撑件优选包括不让液体泄漏的刚性材料。其可以具体是塑料材料，例如聚丙烯、聚乙烯、聚本乙烯、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸脂、聚酰胺、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯。
支撑件12优选包括至少一个开口20，每一个开口20与多孔薄膜14的每一个亲水反应区域16成直角。该开口20对应于沉淀在亲水反应区域16上的样本的收集区域。亲水区域16可具有与开口的基部相同的尺寸，可以较小或较大，只要两个亲水区域总是被薄膜14上的疏水区域分开。
如果需要，开口20可具有用于观察下方信号的透明边缘。
收集区域必须具有一尺寸使得其可至少包含沉淀在反应薄膜16上的最大量的要被测试的样本。
每一个反应区域16的独立是通过反应区域之间的疏水薄膜包括的屏障获得的。这种独立性在同一装置上执行几种不同诊断，所述装置包括单个薄膜。根据变化例，这种独立性还可选地通过将支撑件12分段为通过隔壁分开的实体独立单元来实施，每一个隔壁含有其自己的薄膜。
此外，通过在开口20周围形成多余厚度可以改善薄膜14和18之间的接触，且实际上是与所述开口20的开口相反的圆顶。
支撑件12可以是具有几个开口20的壳，其尺寸能与外部尺寸方面的标准SBS/AINSI相容。
根据本发明的装置10可用于通过毛细作用确定生物流体中分析物的存在或缺失，具体是在血液中或其成分中之一中。该分析物可以是红细胞表型抗原或与该抗原相关的抗体。
装置10可尤其用于：
-使得红血球显型，即在其表面处的抗原的确定。
-Simmonin测试，其识别抗A或抗B抗体的存在。
-依照对同种抗体、自身抗体或凝集素的搜索，搜索或识别与具体红细胞中细胞抗原相关的抗体。
具体说，本发明的目标因此是用于识别和确定ABO血型的装置10的使用，扩展的Rhesus表型，从血液或其组成成分中之一的样本搜索不规则凝集素，搜索自身抗体、搜索冷抗球蛋白和/或交叉验证。
根据本发明的装置10的使用需要使用显示试剂。优选其是血红细胞。这些血红细胞是：
-已知表型的血红细胞，称为血红细胞测试体，用于使用该装置以搜索抗体或Simmonin测试，
-是包含在被测试样本中的血红细胞，用于使用用于显型的该装置。
根据分析物(其目标是检测要被测试样本中的存在)的功能，捕获试剂的特点、显示试剂的特点、亲水化方法(单个或多个，沿厚度或表面)和随后的方案都需要改变。
在所有的情况下，在要被测试的样本在反应区域上的沉淀之前，可以继续进行通过缓冲溶液进行的反应区域16的水合。该缓冲剂可包括稳定的pH在pH6到pH8.5之间的溶液，优选在pH6.5到pH7.8之间，具体是在pH7到pH7.5之间，且同渗容摩为250mOsm到800mOsm之间，优选在300mOsm到600mOsm之间。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。
类似地，为了读取结果，必要的是使用缓冲洗液。该缓冲洗液优选包括PBS、TBS或pH为2到10之间的盐水溶液，优选在5到9之间。缓冲剂的同渗容摩必须被控制为避免红血球的溶血。缓冲剂必须被选择为不使得显示试剂或直接或间接地固定到捕获试剂的着色分析物分离。意外地，对于根据本发明的装置的使用来说，优选的是使用略微高渗性的洗液(其为300mOsm到800mOsm)，其通过盐水试剂的存在而获得，例如NaCl或非离子的渗透调节物质(osmolites)，例如甘氨酸或牛磺酸。该缓冲剂可被着上与显示试剂的颜色形成鲜明对比的颜色。例如，如果显示试剂是血红细胞，则缓冲剂洗液可着色为蓝色或绿色。还可能的是，将低剂量的表面活化剂增加到洗液，以消除背景噪声。这些表面活性剂优选是非离子的表面活性剂，且具体是糖酯，尤其是山梨聚糖的聚乙二醇酯。
在装置10的使用期间，液体可尤其通过吸液管系统或通过毛细作用复制系统(capillarity replication system)沉淀。
有利地，根据本发明的装置不需要离心、也不需要搅动、也不需要真空、也不需要临时装置。还可完全自主地手动使用，且容易依靠机器人而自动化。薄膜14的不同特点控制运动速度并产生足够长的运动时间，以允许抗原–抗体反应，而不管薄膜14的多孔性尺寸，但是很大。
根据第一变化例，本发明的目标是用于使得红血球显型的装置10的使用。
目标是搜索红血球表面处的抗原。在这种情况下，抗体或抗体的混合物用作捕获试剂，其能特定地识别有问题的抗原或抗原的变化形式。抗体可以是被净化或半净化的单克隆抗体、含有单克隆抗体的培养表面活化剂(见表格1)或多克隆抗体、抗血清。还可使用凝集素或外源凝集素。
单克隆抗体的非穷尽列表如下：
表格1：用于血球显型的捕获抗体的非穷尽列表
根据一具体实施例，本发明目标是一种过程用于从红血球样本(纯红血球或总血液)中使得红细胞血型表型，同时用于检测阳性显型人群和阴性显型人群(双种群)，包括以下步骤：
-使得溶液沉淀，以让多孔薄膜14在根据本发明的装置10的反应区域的中心处水合，所述反应区域16包括两个亲水区域16–1、16–2，与周边16–2处相比其在反应区域的中心16–1处具有更大的亲水程度，且在中心处包括捕获试剂，所述捕获试剂包括抗体；用于使得薄膜水合的溶液是已知的有利于血液免疫反应的含有可选添加剂的溶液，例如包括pH6到pH8.5之间的稳定pH的溶液的缓冲剂，优选在pH6.5到pH7.8之间，具体为pH7到pH7.5之间，且同渗容摩在250mOsm到800mOsm之间，优选为300mOsm到600mOsm。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(尤其是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(例如BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。该缓冲剂可选地具有蛋白酶活性，例如通过增加酶获得，例如木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。该缓冲剂可选地包含聚阳离子试剂，例如聚凝胺或聚赖氨酸，用于使得反应潜在地可能，且使得血球更久地保持与捕获元素接触；
-在缓冲剂溶液中将要被显型的红血球稀释，特别是有利于血液免疫反应的可选地含有添加剂的已知缓冲剂溶液，例如包括pH6到pH8.5之间的稳定pH的溶液的缓冲剂，优选在pH6.5到pH7.8之间，具体为pH7到pH7.5之间，且同渗容摩在250mOsm到800mOsm之间，优选为300mOsm到600mOsm。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(尤其是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(例如BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。该缓冲剂可选地具有蛋白酶活性，例如通过增加酶获得，如木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。该缓冲剂可选地包含聚阳离子试剂，例如聚凝胺或聚赖氨酸，用于使得反应潜在地可能，且使得血球更久地保持与捕获元素接触；
-添加含有要在反应区域16–1的中心处表型的红血球的该溶液；
-优选以15到40℃之间的温度，具体以18℃到25℃之间的温度，培养60秒到15分钟的周期，具体是2分钟到10分钟；
-在反应区域上使得清洗溶液沉淀；清洗溶液是不会对抗原–抗体反应造成危害的已知溶液，其保持红血球的完整性且取消特定的相互反应，例如包括在pH6到pH8.5之间的稳定pH的溶液的缓冲剂，优选为pH6.5到pH7.8之间，具体为pH7到pH7.5之间，且同渗容摩在250mOsm到800mOsm之间，优选在300mOsm到600mOsm之间。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(尤其是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(例如BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。在在先使用聚阳离子试剂的情况下，该缓冲剂是有强离子性的，例如其包含大于100mM的NaCl，以能取消通过这类添加剂造成的非特定相互反应。
要被沉淀的样本可以是红血球或总血液。样本可在缓冲剂中稀释，缓冲剂包括在pH6到pH8.5之间的稳定pH的溶液，优选在pH6.5到pH7.8之间，特别是pH7到pH7.5之间，同渗容摩在250mOsm到800mOsm之间，优选在300mOsm到600mOsm之间。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(尤其是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(例如BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。该缓冲剂可选地呈现有蛋白酶活性，例如通过增加酶获得，例如木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。
用于执行该过程的装置10的薄膜14的反应区域16的亲水化优选是表面亲水化。
亲水化例如可借助于在乙醇中浓度为0.1％m/v到1％m/v(优选是0.2％m/v和1％m/v)体积为2μl到40μl之间(且优选在5μl到20μl之间)的Tween20的溶液进行，在其中心处亲水区域沿厚度且借助于浓度在0.1％m/v到2％m/v之间、优选在0.5％m/v到1％m/v，体积为25nl到15μl之间且优选在100nl到10μl的TritonX100形成。
如果存在于样本中的红血球预示了通过捕获元素识别的抗原，则红血球保持在薄膜14的反应区域16的中心处固定不动，而不管清洗情况如何，且中央反应区域16–1保持为红色。如果存在于样本中的红血球不带有通过捕获元素识别的抗原，则红血球被清水冲洗：中央区域16–1保持白色且其在周边区域16–2中形成红色环。如果样本含有两个不同人群，则观察到中心红色22–1和红色周边环22–2二者。
读取结果可以是视觉的或自动的。
根据另一具体实施例，本发明的目标是用于从红血球样本(纯红血球或总血液)中使得红细胞血型显型的过程，不允许检测双重人群，包括下列的步骤：
-沉淀溶液以在根据本发明的装置10的反应区域的中心处使得多孔薄膜14水合，所述反应区域16包括单个亲水区域且包括具有抗体的捕获试剂；用于使得薄膜水合的溶液是已知的、有利于血液免疫反应的含有可选添加剂的溶液，例如包括pH6到pH8.5之间的稳定pH溶液的缓冲剂，优选在pH6.5到pH7.8之间，具体为pH7到pH7.5之间，同渗容摩在250mOsm到800mOsm之间，优选为300mOsm到600mOsm。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(尤其是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(例如BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。该缓冲剂可选地具有蛋白酶活性，例如通过增加酶获得，所述酶例如木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。该缓冲剂可选地包含聚阳离子试剂，例如聚凝胺或聚赖氨酸，用于使得反应潜在地可能，且使得血球更久地保持与捕获元素接触；
-可选地在缓冲剂溶液中稀释要被表型的红血球，特别是在有利于血液免疫反应的可选地含有添加剂的已知缓冲剂溶液，例如包括pH6到pH8.5之间的稳定pH溶液的缓冲剂，优选在pH6.5到pH7.8之间，具体为pH7到pH7.5之间，和同渗容摩在250mOsm到800mOsm之间，优选为300mOsm到600mOsm。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(尤其是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(例如BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。该缓冲剂可选地具有蛋白酶活性，例如通过增加酶获得，如木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。该缓冲剂可选地包含聚阳离子试剂，例如聚凝胺或聚赖氨酸，用于使得反应潜在地可能，且使得血球更久地保持与捕获元素接触；
-添加含有要在反应区域的中心处表型的红血球的该溶液，
-优选以15到40℃之间的温度，特别是以18℃到25℃之间的温度培养2秒到15分钟的周期，特别是1分钟到10分钟。
-在反应区域上沉淀清洗溶液，清洗溶液是不对抗原–抗体反应有危害的已知溶液，其保持红血球的完整性且能消除非特定相互反应，例如包括pH6到pH8.5之间的稳定pH溶液的缓冲剂，优选在pH6.5到pH7.8之间，优选在pH7到pH7.5之间，同渗容摩为250mOsm到800mOsm之间，优选在300mOsm到600mOsm之间。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(尤其是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(例如BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。在在先使用聚阳离子试剂的情况下，该缓冲剂是有强离子性的，例如其包含大于100mM的NaCl，以能取消通过这类添加剂造成的非特定相互反应。
用于执行该过程的装置10的薄膜14的反应区域16的亲水化可被沿厚度亲水化。对装置10来说必要的是还包括在薄膜14下方的吸收系统，例如吸收剂薄膜18。
通过浓度在0.1％m/v到2％m/v之间，优选浓度0.5％m/v到1％w/v，体积为25nl到15μl，且优选在100nl到10μl之间的三重氢核X100执行亲水化。
如果存在于样本中的红血球携带通过捕获元素识别的抗原，则红血球保持在薄膜14的反应区域16的中心22处固定不动，而不管清洗情况如何，中央反应区域16保持为红色。如果存在于样本中的红血球不带有通过捕获元素识别的抗原，则红血球被清水冲洗且反应区域16保持白色。吸收剂薄膜18吸收(区域24)不被固定到薄膜14的一切物质。
读取结果可以是视觉的或自动的。
根据第二变化例，本发明的目标是用于检测血液的多价抗体或Simonin test的装置10的使用。
该目标是搜索具体抗体。捕获元素因此包括优选抗体所针对的抗原。
固定的抗原可以是与聚合物或蛋白质结构关联或不关联的合成抗原。这些还可以是重组蛋白，其含有一个或多个顺序的抗原或有优选变异的抗原的混合物。固定抗原还可以在细胞上或在细胞片段上，特别是细胞膜片段或没有其细胞质内容物的细胞。这些细胞具体可以是没有其细胞质的红血球，也称为“ghosts”。
如果样本具有针对相关抗原的抗体，则其将保持被捕获在反应区域16水平处的薄膜14的表面处。
必要的是使用显示元素，以通过识别其抗体特点(抗IgG，抗IgM)发现这些抗体的存在，或如果被使用的抗体是多价的(能同时检测几个抗原)，则携带相关抗原的显示元素也可被使用。
表格2：用于搜索血液免疫领域抗体的例子
优选抗原 捕获元素 相关元素
IgM Anti–A Ghosts A 血红细胞测试A1
IgM Anti–B Ghosts B 血红细胞测试B
本发明的另一目标因此是用于从血浆、血清或总血液样本检测存在于血液中的多价抗体的过程，包括下列的步骤：
-将要被测试的样本沉淀在装置10的反应区域16上，所述反应区域16包括具有抗原的捕获试剂，
-增加已知显型的血红细胞测试体，包括与捕获试剂相同的抗原，
-让混合物经过亲水区域，所述亲水区域具有的特点是允许通过时间为1到45分钟，优选为3到15分钟，
-在反应区域上沉淀清洗溶液，例如包括pH6到pH8.5之间稳定pH溶液的缓冲剂，优选在pH6.5到pH7.8之间，具体是pH7到pH7.5之间，同渗容摩250mOsm到800mOsm之间，优选在300mOsm到600mOsm之间。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(尤其是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(例如BSA)。
要被沉淀的样本可以是在缓冲剂中被稀释或没有被稀释的血浆、血清或总血液，缓冲剂包括pH6到pH8.5的稳定pH溶液，优选在pH6.5到pH7.8之间，具体是pH7到pH7.5之间，同渗容摩为250mOsm到800mOsm之间，优选在300mOsm到600mOsm之间。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(例如是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(尤其BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。该缓冲剂优选具有NaCl小于100mM的盐分。
用于执行该过程的装置10的薄膜14的反应区域16的亲水化优选是沿厚度的亲水化。因此对装置10来说必要的是还包括在薄膜14下方的吸收系统，例如吸收剂薄膜18。
通过浓度在0.3％m/v到2％m/v之间，优选浓度0.5％m/v到1％w/v且体积为25nl到15μl且优选为100nl到10μl之间的三重氢核X100执行亲水化。捕获试剂可沉淀在薄膜上，与清洁剂混合，或在反应区域16亲水化之后。
如果经测试的血浆含有针对存在于捕获试剂中和在显示试剂(血红细胞测试体)中的抗原的抗体，则红色中心22出现在反应区域16中。白色中心表示在针对存在于捕获试剂和显示试剂(血红细胞测试体)中的抗原的抗体的经测试血浆中不存在。吸收剂薄膜18吸收(区域24)不被固定到薄膜14的一切物质。
读取结果可以是视觉的或自动的。
根据第三变化例，本发明的目标是使用装置10以搜索血液中的不规则的凝集素。
该目标是识别通过样本的血浆抗体或通过随后补充物的活化而变得敏感的血红细胞的存在。
以这种方式，没有捕获试剂，或捕获试剂是聚合试剂，例如聚阳离子聚合物。
在通过血浆培养的血红细胞的面板测试之后，能可逆地聚集红血球的试剂被添加到混合物。该可逆的聚合试剂可从例如聚凝胺、多熔素或聚乙烯亚胺这样的聚阳离子聚合物选择。血红细胞被保持且形成血球团块(a button of globules)，因为所形成的聚集物的尺寸太大以使得它们不能经过薄膜。通过也含有聚合试剂的溶液，血球被清洗掉过多的非特定球蛋白，以避免团块的不稳定化。在这些被保持的血球被清洗之后，多价Coombs’试剂被添加，以执行细胞团块的网状组织，如果后者被敏感化的话。添加含有低剂量表面活化剂的盐水缓冲剂会破坏非敏感化细胞的聚集且保持网状敏感细胞的聚集。
表格3：用于搜索不规则的凝集素的抗体的非穷尽列表
为了执行这些过程，用于执行该过程的装置10的薄膜14的反应区域16的亲水化优选沿厚度方向执行。因此对装置10来说必要的是还包括在薄膜14下方的吸收系统，例如吸收剂薄膜18。
通过浓度为0.3％m/v到2％m/v，优选浓度0.5％m/v到1％w/v且体积为25nl到15μl且优选为100nl到10μl的三重氢核X100执行亲水化。可逆的聚合试剂可有利地被添加，其优选从例如聚凝胺、多熔素或聚乙烯亚胺这样的聚阳离子聚合物选择。
根据该第三变化例，本发明的另一目标因此是一种过程，其用于从血浆、血清或总血液的样本中检测存在于血液中的抗红细胞的抗体，交叉验证或搜索自身抗体或冷凝集素，其特点是包括下列的步骤：
-对同种抗体搜索，预先通过缓冲剂、已知表型的血红细胞测试体和能在一温度下聚集红血球的试剂来培养要被测试的样本，所述温度为15到40℃，优选为大约37℃，经历3到60分钟的时间，优选为5到30分钟；缓冲剂是具有低的离子力的缓冲剂，例如LISS缓冲剂(例如含有少于50mM的NaCl)；为搜索同种抗体，简单地使用没有进行事先培养的血红细胞的样本；
-将能聚集血球的试剂添加到该混合物，所述试剂例如海地美溴铵的溶液；
-在15秒到5分钟之间的优选时间之后，将混合物沉淀在根据本发明的装置10的反应区域16上，且让其流动；其在点上形成细胞团块(button of cell)，
-将含有能让红血球聚集在反应区域上的试剂的溶液沉淀，其中能使得红血球聚集的试剂可以例如是海地美溴铵的溶液，优选溶液中的海地美溴铵的浓度为0.01到2％(m/v)，甚至更优选地为0.05到0.5％；这种试剂执行非特定蛋白质的清洗且保持细胞团块的完整性；
-将Coombs的人类抗球蛋白或抗补足物试剂沉淀在反应区域上，和
-将清洗溶液沉淀在反应区域上，例如pH6到pH8.5的稳定pH的高渗盐水溶液，优选为pH6.5到pH7.8，优选为pH7到pH7.5，同渗容摩为300mOsm到800mOsm。该溶液可选地包含低浓度清洁剂(例如0.01到0.05％m/v的Tween20)和与红色成对比的颜色(蓝色或绿色)的染料。
要被沉淀的样本可以是在缓冲剂中被稀释或没有被稀释的血浆、血清或总血液，缓冲剂包括pH6到pH8.5的稳定pH溶液，优选在pH6.5到pH7.8，具体是pH7到pH7.5，且同渗容摩为250mOsm到800mOsm，优选为300mOsm到600mOsm。该溶液可选地包括低浓度的清洁剂(例如是0.01到0.05％m/v的Tween20)、饱和试剂(尤其BSA)和/或能使得抗原–抗体反应有潜在可能的试剂。该缓冲剂优选具有NaCl小于50mM的盐分。
如果被测试血浆含有针对存在于显示试剂(血红细胞测试体)中的抗原的抗体或如果样本的血红细胞已经在体外被敏感化(sensitised)，则红色中心22出现在反应区域16中。白色中心表明针对存在于显示试剂(血红细胞测试体)中的抗原的抗体的缺失或不可检测计量。吸收剂薄膜18吸收(区域24)所有不被固定到薄膜14的物质。
读取结果可以是视觉的或自动的。
根据本发明的装置10可根据结合了最经常执行的且同时被专业人员在同一卡片上进行的相关补充测试的范围提供，所有的测试被类似地执行和解读。
在每一个卡片上，针对几个样本(捐赠人或患者)的、布置成列的几个分析物可被检测。这可例如是一种卡片，用于：
-ABO–D血型分型，
-Rhesus–Kell血型分型，
-搜索不规则的凝集素(3红细胞显型)，
-识别不规则的凝集素(10红细胞显型)，
-扩展的显型，
-直接通过抗球蛋白控制，
-直接相容性测试。
根据本发明的装置10可以是成套的，其还包括使用所述装置执行至少一个过程所必要的试剂。

Claims (24)

1.一种体外诊断装置(10)，用于从血液或血液的其中一种组成成分的样本检测红细胞表型抗原与特别针对该抗原的抗体之间的至少一个反应，其特征在于该体外诊断装置包括：
-支撑件(12)，和
-疏水多孔薄膜(14)，厚度为0.05mm到1.5mm且其孔的直径为2μm到30μm，所述薄膜包括用于接收所述样本的多于一个的亲水反应区域(16)，亲水反应区域(16)的表面小于疏水多孔薄膜(14)的表面。
2.如权利要求1所述的体外诊断装置(10)，其特征在于，其还包括布置在多孔薄膜(14)下方的吸收剂薄膜(18)。
3.根据权利要求2所述的诊断装置(10)，其特征在于多孔薄膜(14)的亲水反应区域(16)已经通过清洁剂而变得亲水，而没有通过多孔薄膜的在先化学或物理处理而改变多孔基质的化学功能。
4.根据权利要求3所述的诊断装置(10)，其特征在于所述清洁剂是非离子表面活化剂。
5.根据权利要求4的诊断装置(10)，其特征在于所述清洁剂以0.01％到2％(重量/体积)的剂量被使用。
6.根据权利要求1-5中的任何一项所述的诊断装置(10)，其特征在于多孔薄膜(14)布置在支撑件(12)中，且支撑件(12)包括至少一个开口(20)，每一个开口(20)与多孔薄膜的每一个亲水反应区域(16)成直角。
7.根据权利要求1-5中的任何一项所述的诊断装置(10)，其特征在于支撑件(12)是刚性塑料支撑件。
8.根据权利要求1-5中的任何一项所述的诊断装置(10)，其特征在于多孔薄膜(14)的亲水反应区域(16)还包括捕获试剂。
9.根据权利要求8所述的诊断装置(10)，其特征在于所述捕获试剂包括红细胞血型/表型的抗原。
10.根据权利要求9所述的诊断装置(10)，其特征在于捕获试剂是没有血红蛋白的血红细胞。
11.根据权利要求8所述的诊断装置(10)，其特征在于捕获试剂是抗体。
12.根据权利要求8所述的诊断装置(10)，其特征在于捕获试剂是聚阳离子聚合物。
13.根据权利要求1-5中的任何一项所述的诊断装置(10)，其特征在于亲水反应区域(16)在多孔薄膜的整个厚度上是亲水的。
14.根据权利要求1-5中的任何一项所述的诊断装置(10)，其特征在于亲水反应区域(16)在所述亲水反应区域的表面处是亲水的。
15.根据权利要求1-5中的任何一项所述的诊断装置(10)，其特征在于亲水反应区域(16)包括两个亲水区域(16–1，16–2)，在反应区域的中心处具有比周边处更大的亲水程度。
16.根据权利要求1到5中任何一项所述的诊断装置(10)，其特征在于亲水反应区域(16)包括具有不同程度亲水性的两个亲水区域，一个在表面处，而另一个是沿厚度的。
17.根据权利要求15所述的诊断装置(10)，其特征在于亲水反应区域(16)已经通过两种不同清洁剂变得亲水，而没有通过多孔薄膜的在先化学或物理处理而改变多孔基质的化学功能。
18.根据权利要求16所述的诊断装置(10)，其特征在于亲水反应区域(16)已经通过两种不同清洁剂变得亲水，而没有通过多孔薄膜的在先化学或物理处理而改变多孔基质的化学功能。
19.根据前述权利要求中的任何一项所述的装置(10)的一种制造方法，其特征在于该制造方法包括下列的步骤：
-通过至少一种清洁剂在所述薄膜的多于一个的亲水反应区域(16)上使得厚度为0.05mm到1.5mm且孔直径为2μm到30μm的疏水多孔薄膜(14)亲水化，
-使得捕获试剂溶液沉淀，
-干燥，
-组装多孔薄膜(14)和吸收剂薄膜(18)，所述吸收剂薄膜通过支撑件(12)布置在多孔薄膜(14)下方。
20.根据权利要求1到17中任何一项所述的装置的用途，其从血液或血液的其中一种组成成分的样本识别和确定ABO血型、扩展的Rhesus显型，搜索不规则的凝集素。
21.一种从红血球样本进行的红细胞血型的显型方法，用于检测两种不同抗原人群的存在，其特征在于该显型方法包括下列的步骤：
-使得溶液沉淀，以使得根据权利要求1到7中任何一项所述的装置(10)的反应区域的中心处的多孔薄膜(14)水合，所述亲水反应区域(16)包括两个亲水区域(16–1，16–2)，与周边处相比在反应区域的中心处具有更大的亲水程度，且在中心处包括捕获试剂，所述捕获试剂包括抗体，
-将红血球稀释以在缓冲剂溶液中显型，
-添加含有要在反应区域的中心处显型的红血球的该溶液，
-培养，
-使得清洗溶液在反应区域上沉淀。
22.一种从红血球样本进行的红细胞血型的显型方法其特征在于包括下列的步骤：
沉淀溶液，以使得根据权利要求1到7中任何一项所述的装置(10)的亲水反应区域(16)处的多孔薄膜(14)水合，所述亲水反应区域(16)包括单个亲水区域且包括捕获试剂，所述捕获试剂包括抗体，
-稀释红血球，以在缓冲剂溶液中显型，
-添加含有要在反应区域的中心处显型的红血球的该溶液，
-培养，
-使得清洗溶液在反应区域上沉淀。
23.一种从血浆、血清或总血液样本检测存在于血液中的多价抗体的方法，其特征在于包括下列的步骤：
-将要被测试的样本沉淀在根据权利要求1到7中任何一项所述的装置(10)的亲水反应区域(16)上，所述亲水反应区域(16)包括具有抗原的捕获试剂，
-添加已知显型的血红细胞测试体，其包括与捕获试剂相同的抗原，
-让混合物经过亲水反应区域，
-使得清洗溶液沉淀在反应区域上。
24.一种使用权利要求1到7中任一项所述的装置的方法，其特征在于包括下列的步骤：
-通过缓冲剂、已知表型的血红细胞测试体来培养要被测试的样本，
-向该混合物添加能让红血球聚集的试剂，
-将混合物沉淀在根据权利要求1到7中任何一项所述的装置(10)的亲水反应区域(16)上，
-将含有能使得红血球聚集的试剂的溶液沉淀在反应区域上，
-将Coombs人体抗球蛋白或抗补足物试剂沉淀在反应区域上，和
-使得清洗溶液沉淀在反应区域上。
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